来源：Metabolic flux reprogramming and protein engineering drive efficient l-arginine biosynthesis（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-精氨酸是食品、饲料、医药和化妆品行业广泛使用的半必需氨基酸。本研究以大肠杆菌Arg4为底盘菌株，利用酶约束模型ec_iML1515鉴定出11个影响L-精氨酸合成的关键基因靶点，通过前体代谢库（草酰乙酸、天冬氨酸、瓜氨酸）的系统重构与限速酶ArgG的蛋白工程改造，最终在3-m³发酵罐中实现L-精氨酸产量114.18 g/L、得率0.57 g/g、生产强度2.27 g/L/h，创下迄今报道的最佳性能。
研究背景
L-精氨酸是一种具有重要应用价值和商业意义的半必需氨基酸。2023年全球L-精氨酸市场估值约7亿美元，年复合增长率约8%，预计2030年将突破10亿美元。通过代谢工程和进化工程等手段，大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的L-精氨酸生产性能已获得显著提升——大肠杆菌菌株最高可实现132 g/L产量、0.51 g/g得率和2.75 g/L/h生产强度，谷氨酸棒杆菌则达到92.5 g/L、0.40 g/g和1.28 g/h。然而，L-精氨酸的工业生产仍面临辅因子需求高、氮供体要求严格以及生物合成途径本身冗长复杂等严峻挑战。
研究方法
菌株、质粒与引物
本研究所用菌株、质粒及引物详见补充材料。L-精氨酸生产底盘菌株大肠杆菌Arg4为实验室保藏菌株，通过随机诱变与代谢工程获得。大肠杆菌JM109用于质粒构建。基因组编辑采用CRISPR-Cas9工具包。CRISPR-dCas9介导的转录抑制使用源自pdCas9的单质粒CRISPRi系统。pdCas9质粒包含Pcas-dcas9表达盒和Ptrc驱动的sgRNA表达盒。针对每个靶基因，将sgRNA cassette中的原始sgRNA-pMB1间隔序列替换为靶标特异性间隔序列。所得pdCas9-sgRNA质粒转化至相应L-精氨酸生产菌株，并使用卡那霉素筛选转化子。pCDR质粒用于过表达异源及同源基因。除非另有说明，常规DNA操作在添加卡那霉素（50 mg/L）或壮观霉素（30 mg/L）的Luria–Bertani（LB）培养基中进行。
【数据】卡那霉素：50 mg/L；壮观霉素：30 mg/L；培养基：LB
DNA操作
质粒构建和基因组修饰采用标准分子克隆策略和Gibson assembly方法。启动子序列、整合/删除位点、异源基因及遗传修饰靶点的详细信息见补充材料。
【数据】克隆方法：Gibson assembly；基因组编辑：CRISPR-Cas9
摇瓶发酵
种子制备：将甘油菌种接种至含30 mL液体NDG培养基的100 mL摇瓶中，于37°C、250 rpm条件下培养4–6 h。当OD600达到2.0–3.0时视为菌株活化完成。随后将培养物转移至NDG琼脂平板，37°C培养12 h。每块平板用5 mL生理盐水洗涤收集菌落，制备摇瓶发酵接种液。
摇瓶发酵：将6 mL细胞悬液接种至含52 mL发酵培养基的500 mL摇瓶中，随后加入2 mL 60%（w/v）葡萄糖溶液。培养物于37°C、250 rpm条件下培养24 h。
过程控制与补料：通过添加NH4OH将pH控制在约7.3。使用生物传感器分析仪定量残留葡萄糖。糖耗竭后，补充1 mL 60%（w/v）葡萄糖溶液。定期使用生物传感器分析仪测量残留NH4⁺浓度。需要时，添加275 g/L硫酸铵溶液以维持残留铵浓度在0.2–1.0 g/L。
【数据】种子培养基：NDG，30 mL/100 mL摇瓶；温度：37°C；转速：250 rpm；时间：4–6 h；OD600：2.0–3.0；活化时间：12 h；生理盐水：5 mL/平板；接种量：6 mL/52 mL发酵培养基；葡萄糖：60%（w/v），2 mL初始+1 mL补加；pH：7.3（NH4OH控制）；硫酸铵：275 g/L；残留铵浓度：0.2–1.0 g/L；发酵时间：24 h
补料分批发酵
种子培养：菌株从甘油菌种中复苏，按2.3节所述制备生理盐水细胞悬液。种子扩培时，将1 mL所得细胞悬液接种至含100 mL种子培养基I的500 mL摇瓶中，于37°C、250 rpm条件下培养3–4 h，直至OD600达到2.0–3.0。
补料分批发酵在7.5-L生物反应器（上海T&J Bioengineering）中进行，初始工作体积为2.4 L发酵培养基，接种比例为16%（v/v）。使用NH4OH控制pH为7.3，温度维持在37°C。通过将搅拌速率从400 rpm提高至1000 rpm控制溶解氧（DO）为30%，通气量设定为2–3 L/min，罐压调节至0.02–0.05 MPa。初始葡萄糖浓度调整为15 g/L。当残留葡萄糖降至1 g/L以下时，补加800 g/L葡萄糖溶液以维持葡萄糖低于1 g/L。当NH4⁺降至0.2 g/L以下时启动(NH4)2SO4补料，葡萄糖和(NH4)2SO4按固定比例供给。3-m³发酵罐的种子培养和发酵过程控制详见补充材料。
【数据】发酵罐：7.5-L（T&J Bioengineering）；初始工作体积：2.4 L；接种比例：16%（v/v）；pH：7.3（NH4OH）；温度：37°C；DO：30%；搅拌：400–1000 rpm；通气：2–3 L/min；罐压：0.02–0.05 MPa；初始葡萄糖：15 g/L；补料葡萄糖：800 g/L；残留葡萄糖控制：<1 g/L；NH4⁺补料阈值：<0.2 g/L
分析方法
OD600值使用紫外-可见分光光度计测量。残留葡萄糖和铵分别使用生物传感器分析仪（M-100和E-10；深圳西尔曼科技有限公司）测量。氨基酸采用2,4-二硝基氟苯（DNFB）柱前衍生化HPLC分析，使用ZORBAX Eclipse AAA分析柱（4.6 × 150 mm，5 μm；Agilent Technologies Inc.）。流动相和色谱程序见补充材料。有机酸使用Aminex HPX-87H柱（7.8 × 300 mm；Bio-Rad Laboratories, Inc.）在55°C下以5 mM H2SO4为流动相进行HPLC定量，进样量10 μL，流速0.6 mL/min。
【数据】HPLC柱：ZORBAX Eclipse AAA（4.6 × 150 mm，5 μm）；有机酸柱：Aminex HPX-87H（7.8 × 300 mm）；柱温：55°C；流动相：5 mM H2SO4；进样量：10 μL；流速：0.6 mL/min
启动子强度评估
启动子活性通过GFP荧光评估。菌株从甘油菌种复苏至NDG培养基中，37°C培养12 h。随后将菌液转移至补充20 g/L葡萄糖的新鲜发酵培养基中，初始OD600为0.1。培养物于37°C、250 rpm条件下培养12 h。使用SpectraMax M3酶标仪（Molecular Devices，USA）记录GFP荧光。激发和发射波长按Guo等人（2020）先前报道设定。随后测量培养物OD600，荧光值归一化至细胞密度。
【数据】葡萄糖：20 g/L；初始OD600：0.1；温度：37°C；转速：250 rpm；时间：12 h；检测仪器：SpectraMax M3
胞内草酰乙酸测定
胞内代谢物分析：细胞在4°C下以5000 rpm离心10 min收集，用冰预冷PBS缓冲液洗涤两次。细胞沉淀在液氮中速冻后于−80°C保存。准确称取约0.1 g（精确至0.0001 g）细胞沉淀至1.5 mL离心管中，加入0.5 mL预冷试剂1和0.5 mL超纯水，置于摇床上振荡混匀1 min，4°C超声处理1 h，随后4°C下10,000 r/min离心10 min。取0.25 mL上清液进行衍生化。将0.25 mL各样品提取液转移至1.5 mL棕色离心管中，依次加入试剂2（60 μL）、试剂3（200 μL）和试剂4（175 μL），涡旋混匀。25°C孵育30 min后，上清液经0.22-μm滤膜过滤，进行HPLC分析。柱前衍生化HPLC使用C18色谱柱（4.6 × 250 mm，5 μm；Agilent Technologies Inc.）。流动相和色谱程序见补充材料。
【数据】离心：5000 rpm，10 min，4°C；保存：−80°C；样品量：0.1 g（精确至0.0001 g）；试剂1：0.5 mL；超纯水：0.5 mL；超声：4°C，1 h；离心：10,000 r/min，10 min，4°C；衍生化试剂：试剂2 60 μL+试剂3 200 μL+试剂4 175 μL；孵育：25°C，30 min；滤膜：0.22 μm；HPLC柱：C18（4.6 × 250 mm，5 μm）
胞内氨基酸测定
胞内代谢物分析中，细胞按2.7节所述方法收集和保存。准确称取0.1 g（精确至0.0001 g）混匀样品至15 mL透明离心管中，加入1 mL 6 M HCl，置于摇床混匀5 min，然后放入预热至105°C的烘箱中水解24 h。水解完成后立即取出，用冷水冷却至室温，观察是否需要补充盐酸。随后加入1 mL 6 M NaOH溶液，用摇床振荡5 min充分混匀中和至中性，4000 r/min离心10 min，取0.5 mL上清液进行衍生化。将0.5 mL样品水解液转移至15 mL棕色离心管中，加入0.5 mL碳酸氢钠缓冲液（pH 9.0）和DNFB，混合物在60 ± 0.5°C水浴中避光孵育60 min。孵育后立即用冷水冷却至室温淬灭反应。随后加入3.5 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.0）充分混匀，室温避光反应15 min。上清液经0.22-μm滤膜过滤后进行HPLC分析。柱前衍生化HPLC分析按前述方法进行。
【数据】样品量：0.1 g（精确至0.0001 g）；HCl：6 M，1 mL，105°C，24 h；NaOH：6 M，1 mL；离心：4000 r/min，10 min；上清液：0.5 mL；碳酸氢钠缓冲液：0.5 mL（pH 9.0）；衍生化：60 ± 0.5°C，60 min，避光；磷酸盐缓冲液：3.5 mL（pH 7.0）；室温反应：15 min，避光；滤膜：0.22 μm
研究结果
酶约束模型预测L-精氨酸生产菌株的基因靶点
本研究所用起始底盘菌株Arg4为前期从大肠杆菌MG1655通过随机诱变和代谢工程构建的L-精氨酸生产菌株。为鉴定强化L-精氨酸生物合成的关键基因靶点，使用酶约束模型ec_iML1515对菌株Arg4进行了蛋白需求分析。以葡萄糖为碳源模拟大肠杆菌L-精氨酸生产，基于模型模拟共鉴定出120个蛋白，包括29个高需求蛋白和91个低需求蛋白。随后，基于代谢途径分析、文献挖掘和预测通量排序，从鉴定蛋白中筛选出14个直接影响L-精氨酸生物合成途径的候选蛋白。其中，9个高需求蛋白（AspA、AspC、GltA、AcnA、Icd、GdhA、GlnA、ArgF和CarAB）的丰度增加被预测可增强L-精氨酸产量，5个低需求蛋白（PrpC、Pck、PykA、LysC和SucAB）的丰度降低被预测可改善L-精氨酸产量。代谢途径分析显示，这些预测的需求蛋白主要分布于三个代谢节点：草酰乙酸、天冬氨酸和瓜氨酸。因此，相应基因靶点被分为三个功能模块：草酰乙酸模块（prpC、pck和pykA）、天冬氨酸模块（aspC、aspA和lysC）以及瓜氨酸模块（gltA、acnA、icd、sucAB、gdhA、glnA、carAB和argF）（图1a）。
为筛选能够提高L-精氨酸产量的基因靶点，将对应高需求蛋白的基因aspA、aspC、gltA、acnA、icd、gdhA、glnA、argF和carAB分别在菌株Arg4中过表达，构建菌株Arg4-1至Arg4-9。摇瓶发酵显示，菌株Arg4-1至Arg4-9的L-精氨酸产量分别为16.78、15.86、18.76、17.23、16.49、20.36、18.94、12.34和17.82 g/L，相对于菌株Arg4（14.58 g/L）的变化分别为+15.1%、+8.8%、+28.7%、+18.2%、+13.1%、+39.6%、+29.9%、−15.36%和+22.2%（图1b）。此外，将对应低需求蛋白的基因靶点prpC、pck、pykA、lysC和sucAB分别在菌株Arg4中下调表达，得到菌株Arg4-10至Arg4-14。与菌株Arg4（14.58 g/L）相比，菌株Arg4-10至Arg4-14的产量分别为18.45、18.14、14.11、16.56和9.02 g/L，对应变化为+26.54%、+24.42%、−3.2%、+13.58%和−38.13%（图1c）。上述结果表明，共鉴定出11个增强L-精氨酸产量的基因，包括aspA、aspC、gltA、acnA、icd、gdhA、glnA、carAB、prpC、pck和lysC。
【数据】Arg4产量：14.58 g/L；Arg4-1至Arg4-9产量：16.78、15.86、18.76、17.23、16.49、20.36、18.94、12.34、17.82 g/L；变化幅度：+15.1%、+8.8%、+28.7%、+18.2%、+13.1%、+39.6%、+29.9%、−15.36%、+22.2%；Arg4-10至Arg4-14产量：18.45、18.14、14.11、16.56、9.02 g/L；变化幅度：+26.54%、+24.42%、−3.2%、+13.58%、−38.13%；高需求蛋白：9个；低需求蛋白：5个；总鉴定蛋白：120个
胞内草酰乙酸库的扩展
为通过重新分配碳通量扩展胞内草酰乙酸库（图2a），在菌株Arg4中敲除prpC基因以阻断草酰乙酸降解，构建菌株Arg5。摇瓶发酵显示，菌株Arg5的L-精氨酸产量为19.54 g/L，比菌株Arg4（14.58 g/L）高34.02%（图2b）。随后，分别将来源于Mycolicibacterium smegmatis、Corynebacterium glutamicum、Geobacillus stearothermophilus、Pseudomonas aeruginosa和Arthrobacter globiformis的丙酮酸羧化酶在菌株Arg5中单独过表达，构建菌株Arg5-1至Arg5-5。其中，菌株Arg5-1获得最高L-精氨酸产量22.39 g/L，比菌株Arg5（19.54 g/L）提高14.59%（图2c）。因此，将来源于M. smegmatis的pyc基因整合至菌株Arg5中，并通过启动子工程进一步组合优化pyc和pck的表达水平，构建菌株Arg5-6至Arg5-11。结果表明，Arg5-9中pyc和pck分别由启动子PJ23119和PJ23105调控（PJ23119-pyc-PJ23105-pck），其L-精氨酸产量最高达24.13 g/L，被命名为菌株Arg6（图2d）。
在7.5 L发酵罐中发酵48 h后，菌株Arg6的L-精氨酸产量、得率和生产强度分别达到66.92 g/L、0.37 g/g和1.39 g/L/h，与前期报道的菌株Arg4基线性能（52.83 g/L、0.30 g/g和1.10 g/L/h）相比分别提高26.67%、23.33%和26.74%（图2e）。此外，菌株Arg6的胞内草酰乙酸含量达到20.27 nmol/(L·g DCW)，比菌株Arg4（14.10 nmol/(L·g DCW)）提高43.76%（图2f）。
【数据】Arg5产量：19.54 g/L（+34.02%）；Arg5-1产量：22.39 g/L（+14.59%）；Arg6产量：24.13 g/L；7.5-L发酵罐：产量66.92 g/L、得率0.37 g/g、生产强度1.39 g/L/h；Arg4基线：52.83 g/L、0.30 g/g、1.10 g/L/h；提升幅度：26.67%、23.33%、26.74%；胞内草酰乙酸：Arg6 20.27 nmol/(L·g DCW) vs Arg4 14.10 nmol/(L·g DCW)（+43.76%）
胞内天冬氨酸和瓜氨酸库的改善
天冬氨酸和瓜氨酸是L-精氨酸生物合成的两个重要前体，因此在菌株Arg6中扩展了胞内天冬氨酸和瓜氨酸库（图3a和图4a）。为增强天冬氨酸供应，首先在菌株Arg6中优化aspA的拷贝数。分别整合1、2或3个额外的aspA染色体拷贝，其中2个额外拷贝获得最高L-精氨酸产量，构建菌株Arg7。Arg7的L-精氨酸产量提高至25.98 g/L，比菌株Arg6（24.13 g/L）增加7.67%（图3b）。随后，在菌株Arg7中通过启动子工程组合优化aspC和lysC的表达水平，构建菌株Arg7-1至Arg7-6。其中，菌株Arg7-2（PJ23119-aspC-PJ23110-lysC）获得最高L-精氨酸产量29.31 g/L，因此被命名为菌株Arg8（图3c）。结果表明，弱aspC表达降低L-精氨酸产量，而强aspC表达结合优化的lysC调控获得最高产量。
为进一步增强瓜氨酸前体供应，在菌株Arg8中分别整合gltA、acnA和icd各1个额外拷贝，随后进行组合启动子优化，构建菌株Arg8-1至Arg8-27（图4a）。其中，菌株Arg8-4（PJ23115-gltA-PJ23118-acnA-PJ23115-icd）获得最高L-精氨酸产量33.57 g/L，被命名为菌株Arg9（图4b）。随后，在菌株Arg9中分别整合gdhA、glnA和carAB各1个额外拷贝，并进一步组合优化其表达水平，构建菌株Arg9-1至Arg9-27。其中，菌株Arg9-22（PJ23119-gdhA-PJ23118-glnA-PJ23115-carAB）产生最高L-精氨酸产量38.06 g/L，被命名为菌株Arg10（图4c）。
在7.5-L发酵罐中发酵48 h后，菌株Arg10的L-精氨酸产量、得率和生产强度分别达到87.24 g/L、0.48 g/g和1.82 g/L/h，与菌株Arg6（66.92 g/L、0.37 g/g和1.39 g/L/h）相比分别提高30.36%、29.73%和30.94%。同时，菌株Arg10的胞内天冬氨酸和瓜氨酸含量分别达到27.43和35.54 nmol/(L·g DCW)，相对于菌株Arg6（17.52和20.71 nmol/(L·g DCW)）分别增加56.56%和71.61%（见补充材料）。然而，在菌株Arg10发酵过程中观察到天冬氨酸作为主要副产物的明显积累，达到8.4 g/L，比菌株Arg6（1.3 g/L）增加约6.5倍。因此，在菌株Arg10中分别整合1或2个额外拷贝的argG，构建菌株Arg10-1和Arg10-2。然而，菌株Arg10-1和Arg10-2仍分别积累7.60和7.12 g/L天冬氨酸（见补充材料）。综上，这些结果表明胞内天冬氨酸和瓜氨酸库的扩展有效实现了高水平的L-精氨酸生物合成，但也导致发酵液中天冬氨酸的大量积累。
【数据】Arg7产量：25.98 g/L（+7.67%）；Arg7-2产量：29.31 g/L；Arg8-4产量：33.57 g/L；Arg9-22产量：38.06 g/L；7.5-L发酵罐Arg10：产量87.24 g/L、得率0.48 g/g、生产强度1.82 g/L/h；提升幅度：30.36%、29.73%、30.94%；胞内天冬氨酸：Arg10 27.43 vs Arg6 17.52 nmol/(L·g DCW)（+56.56%）；胞内瓜氨酸：Arg10 35.54 vs Arg6 20.71 nmol/(L·g DCW)（+71.61%）；天冬氨酸积累：Arg10 8.4 g/L vs Arg6 1.3 g/L（约6.5倍）；Arg10-1天冬氨酸：7.60 g/L；Arg10-2天冬氨酸：7.12 g/L
ArgG的蛋白工程改造及菌株Arg11的发酵评估
（注：此段原文节选在方法/结果部分被截断，完整内容需参见论文原文）
【数据】原文未详述
发酵过程优化与放大
（注：此段原文节选在方法/结果部分被截断，完整内容需参见论文原文）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究利用酶约束模型ec_iML1515鉴定出11个对L-精氨酸生物合成有正向贡献的基因靶点。aspA、lysC、gltA、icd、gdhA、glnA和carAB此前已被证实可促进L-精氨酸生产，验证了模型预测的准确性和有效性；而prpC、pck、aspC和acnA是本研究首次鉴定的关键靶点，深化了对L-精氨酸生物合成的机制理解。酶约束基因组规模模型（ecGEMs）通过纳入酶容量约束扩展了传统基因组规模代谢模型，使代谢通量直接受酶可用性限制。代表性建模框架包括FBAwMC、MOMENT和GECKO等。通过前体工程系统扩展草酰乙酸、天冬氨酸和瓜氨酸的胞内库，重新平衡了代谢通量。此外，对关键限速酶ArgG进行蛋白工程改造以提高其催化效率。最终优化菌株Arg11在3-m³发酵罐中实现L-精氨酸产量114.18 g/L、得率0.57 g/g、生产强度2.27 g/L/h。
编译者解读
本研究展示了系统代谢工程策略的典型路径：从酶约束模型预测靶点到多节点前体库协同扩展，再到限速酶蛋白工程改造，层层递进、逻辑严密。值得关注的是，研究团队没有止步于摇瓶优化，而是完成了从7.5-L到3-m³的放大验证，这一跨度在学术论文中并不常见。天冬氨酸副产物积累问题的识别与ArgG突变体的针对性改造，体现了代谢工程中"发现问题—解决问题"的闭环思维。酶约束模型首次鉴定出prpC、pck等新靶点，也为其他氨基酸生产菌株的改造提供了可借鉴的方法论。
参考来源
He, S. (2026). Metabolic flux reprogramming and protein engineering drive efficient l-arginine biosynthesis. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135500
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135500