来源：Design, characterization, and application of novel antimicrobial peptides against Bacillus cereus（International Journal of Food Microbiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是引发食源性疾病的常见病原菌，其芽孢和生物膜对食品安全构成持续威胁。本研究基于宿主防御肽（HDPs）γ-core序列的氨基酸保守模式，结合机器学习预测模型构建了约1.84×10⁷条候选抗菌肽（AMP）虚拟文库，从中筛选出50条进行合成验证。其中，肽XWC26展现出最强抑菌活性（MIC 2 μg/mL），可在10分钟内杀灭B. cereus，并能抑制芽孢萌发。机制研究表明XWC26通过破坏细菌细胞膜导致快速死亡，在污染米饭模型中2小时内即可清除B. cereus，显示出作为新型食品防腐剂的潜力。
研究背景
食品安全直接关系人类生命健康。世界卫生组织估计，每年约有6亿人罹患食源性疾病，其中约42万人死亡，细菌是主要致病因素。在美国，与B. cereus相关的食源性疾病每年约达100万例。B. cereus是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，常见于食品和农产品中，除引起食源性疾病外，还可导致多种局部和全身感染。在食品工业中，B. cereus能在食品加工设备表面形成生物膜，抵抗化学消毒剂和机械清洗，对食品安全和公共卫生构成持续威胁。
抗菌肽（AMPs）是由10-50个氨基酸组成的短肽，天然存在或人工设计合成，具有广谱抗菌活性，在食品保鲜中具有应用潜力。然而，从基因组数据库中挖掘AMP虽有效，但许多序列可能未被生物进化保存或探索；而从全序列空间生成文库则因序列数量过于庞大而不切实际——仅10个氨基酸的肽库就包含约10¹³种可能序列。因此，将理性设计与机器学习预测相结合，聚焦功能优化序列，为开发新型高效AMP提供了有力替代方案。
研究方法
2.1 AMPs的设计、鉴定与合成
候选AMP文库基于HDPs的对映序列特征构建，参照Yount和Yeaman的方法（Yount and Yeaman, 2004）。选取HDPs的levomeric isoform 1，其氨基酸共有模式为CX₃₋₉CXGX₁₋₃，符合HDPs的γ-core基序。为简化计算筛选，出现频率大于50%的位点赋予特定氨基酸，频率低于50%的位点允许容纳任意氨基酸（X）。
随后应用Ma等人（Ma et al., 2022）开发的基于机器学习的AMP识别模型预测每条候选序列的抗菌潜力。该模型生成三个独立概率分数，分别来自LSTM、Attention和BERT，表示序列为AMP的可能性。三个分数相乘计算综合预测分数，预测分数大于0.5的序列被归类为候选AMP。根据该评分系统对文库中所有序列排序，选取前50条候选序列进行化学合成和实验验证。
50条候选AMP由广州IGE生物技术公司（中国）商业合成，纯度>90%。多肽重新悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）或去离子水中，储存于−20°C备用。使用ExPASy（Gasteiger et al., 2003）、AlphaFold2（Bryant et al., 2022）和抗菌肽数据库3（Wang et al., 2016）分析多肽关键特性，包括疏水性、两亲性和净电荷，并预测其结构。
【数据】文库规模：1.84×10⁷条序列；预测阈值：>0.5；合成纯度：>90%；储存温度：−20°C；合成机构：广州IGE生物技术公司
2.2 菌株与生长条件
本研究所用标准菌株包括B. cereus ATCC 14579、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19115、大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）ATCC 14028和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）ATCC 17802。此外还使用了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、乳酸链球菌（Streptococcus lactis）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）等菌株。所有菌株均来自实验室保存。实验前，所有菌株在Luria-Bertani（LB）肉汤或Mueller-Hinton（MH）肉汤中于37°C过夜培养至对数期。通过测定OD600监测细菌浓度。
【数据】培养温度：37°C；培养基：LB或MH肉汤；监测方法：OD600
2.3 抗菌活性测定
最低抑菌浓度（MIC）参照标准程序并适当修改进行（Wiegand et al., 2008）。菌株活化后于37°C、200 rpm振荡培养至对数期。用新鲜MH肉汤将菌悬液调整至5 × 10⁵ CFU/mL。将AMP溶解于PBS中至浓度2560 μg/mL。
MIC测定中，取20 μL肽储备液（20倍浓缩）加入96孔板（板1）第一列，同时加入20 μL溶液A。用移液器吹打6-8次充分混匀。随后从第一列取10 μL混合液转移至含10 μL溶液B的第二列，充分混匀。重复该过程至第2-10列，形成二倍梯度稀释，第10列混匀后弃去10 μL。接着，在第二个96孔板（板2）第1-10列各孔中加入90 μL菌悬液。将板1中的肽稀释液（10 μL）转移至板2对应孔中，最终肽浓度从第1列到第10列依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL。第11列加入100 μL MH肉汤作为无菌对照，第12列加入100 μL菌悬液作为生长对照。板2用塑料膜密封，于37°C孵育16小时。肉眼观察各孔浊度，并用酶标仪测定OD600吸光度。
对B. cereus，确定MIC后，从各孔取10 μL悬液均匀涂布于MH琼脂平板，评估最低杀菌浓度（MBC）。MBC定义为在体外条件下杀死99.9%细菌的最低肽浓度。
【数据】菌悬液浓度：5 × 10⁵ CFU/mL；肽储备液浓度：2560 μg/mL；MIC测定浓度梯度：128-0.25 μg/mL（二倍稀释）；孵育条件：37°C、16h；MBC定义：杀死99.9%细菌的最低浓度
2.4 稳定性测定
为评估AMP的热稳定性，将多肽在PBS中于25、50、75和100°C孵育1小时，以4°C孵育的肽作为对照。孵育后通过测定对B. cereus的MIC评估多肽的热稳定性。
为评估AMP的酸碱稳定性，将多肽在pH 2（50 mM甘氨酸-盐酸缓冲液）、pH 6（50 mM磷酸钠缓冲液）和pH 10（50 mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）中孵育1小时。以PBS中孵育的AMP作为对照。处理后通过测定对B. cereus的MIC评估多肽的酸碱稳定性。
为评估AMP对蛋白酶的稳定性，将胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K溶解于PBS中至终浓度20 μg/mL。将AMP分别与蛋白酶按1:1体积比混合，于37°C孵育1小时。随后将肽-蛋白酶混合物在60°C加热15分钟以灭活蛋白酶。以PBS中的AMP作为对照。通过测定对B. cereus的MIC评估多肽的蛋白酶耐受性。
【数据】热稳定性温度：25、50、75、100°C（1h），对照4°C；pH稳定性：pH 2、6、10（1h）；蛋白酶浓度：20 μg/mL；酶解条件：37°C、1h；酶灭活：60°C、15min
2.5 溶血活性测定
溶血活性参照Gao等人（Gao et al., 2022）的方法并稍作修改。简要而言，向96孔板中加入100 μL 6%（v/v）小鼠红细胞悬液，随后加入100 μL不同浓度的AMP溶液（PBS配制）。最终肽浓度为128、64、32、16、8、4、2和1 μg/mL。以PBS和1%（v/v）Triton X-100分别作为阴性和阳性对照。板于37°C孵育1小时，1000 rpm离心3分钟，小心将上清转移至新的96孔板。用酶标仪测定540 nm吸光度，按以下公式计算溶血率：
溶血率% = (OD肽 − OD PBS) / (OD TritonX − OD PBS) × 100%
其中OD肽为XWC26处理的小鼠红细胞上清在540 nm的吸光度，OD PBS为PBS处理的细胞上清的吸光度，OD TritonX为1% Triton X-100处理的细胞上清的吸光度。
【数据】红细胞悬液：6%（v/v）；肽浓度范围：128-1 μg/mL；孵育条件：37°C、1h；离心：1000 rpm、3min；检测波长：540nm；阳性对照：1% Triton X-100
2.6 细菌杀灭时间-动力学
B. cereus活化后于37°C、200 rpm培养至对数期。用新鲜MH肉汤将菌悬液调整至10⁵ CFU/mL。将菌悬液与AMP溶液混合，终浓度为1 × MIC和2 × MIC，或与8 μg/mL蜂毒肽（melittin）混合。混合物于37°C孵育，在不同时间点（0、10、30、60、120和240分钟）取样，适当稀释后点样于MH琼脂平板。37°C孵育后计数菌落（Petersen et al., 2007）。以PBS处理的菌悬液作为阴性对照。
【数据】菌悬液浓度：10⁵ CFU/mL；AMP浓度：1 × MIC、2 × MIC；蜂毒肽浓度：8 μg/mL；取样时间点：0、10、30、60、120、240min；孵育温度：37°C
2.7 扫描电子显微镜和共聚焦显微镜
扫描电子显微镜（SEM）用于观察XWC26对B. cereus细胞膜的影响，参照Zhong等人（Zhong et al., 2020）的方法并稍作修改。B. cereus活化后于37°C、200 rpm培养至对数生长期。用新鲜MH肉汤培养基调整细菌浓度至10⁸ CFU/mL，加入XWC26至终浓度4 μg/mL。细胞以8000 rpm离心3分钟，弃上清，用PBS洗涤三次。
（原文该节后续内容未在节选中完整呈现）
【数据】细菌浓度：10⁸ CFU/mL；XWC26浓度：4 μg/mL（2 × MIC）；离心：8000 rpm、3min；洗涤：PBS×3次
研究结果
3.1 AMPs的设计、鉴定与表征
HDPs的levomeric isoform 1具有约19个氨基酸的共有序列（Yount and Yeaman, 2004）。基于此，我们推导出潜在AMP的通用氨基酸序列公式：[KR]GG[KR]XC[FWY]C[KR]X[KR][FWY]C[LIAV]CXG[KR][KR]。该公式中方括号内的氨基酸表示该位置可被所列任一残基占据，“X”表示20种标准氨基酸中的任意一种。
利用该公式，我们构建了约1.84 × 10⁷条序列的候选AMP文库。随后，基于ML的AMP识别模型（Ma et al., 2022）为文库中每条序列分配综合预测分数。令人惊讶的是，约1.69 × 10⁷条序列（占总数91.6%）的预测分数>0.5（表1），表明它们可能是具有活性的AMP。该文库中所有序列的平均分和中位分数分别为0.88和0.98。
作为对照，我们还生成了一个包含1 × 10⁵条随机序列的对照文库，每条序列长度为19个氨基酸。其中仅3.61%（3600条序列）被预测为潜在活性AMP，平均分和中位分数分别为4.60 × 10⁻³和4.58 × 10⁻⁵。当预测分数阈值设为0.95和0.99时，我们文库中潜在活性AMP的比例分别降至63.04%和27.58%，仍包含大量序列。相比之下，随机文库中潜在活性AMP的比例急剧下降至0.59%和0.08%。这些结果表明，基于公式生成的文库质量很高。
随后，我们选取预测排名前50的AMP（命名为XWC1至XWC50）进行进一步研究。这些序列的分子量范围为2167.74至2373.95 Da，等电点介于9.62至10.24之间，表明其碱性特征。在生理pH下，其净电荷为+6至+8，反映出高含量的正电荷残基，属于阳离子AMP（表S1）。AlphaFold2预测这些多肽的三级结构具有两条反向平行β-折叠，由短转角区域连接，形成γ-core基序（图S1）。该结构特征与防御素中观察到的显著保守性一致（Bauer et al., 2001; Yeaman and Yount, 2007; Yount and Yeaman, 2004）。
【数据】文库规模：1.84 × 10⁷条；预测阳性率：91.6%（分数>0.5）；平均分：0.88；中位分数：0.98；随机文库阳性率：3.61%；阈值0.95时阳性率：63.04%；阈值0.99时阳性率：27.58%；分子量范围：2167.74-2373.95 Da；等电点：9.62-10.24；净电荷：+6至+8
3.2 预测AMP的抗菌效力
为评估抗菌活性，我们将预测排名前50的AMP商业合成，并测定其对B. cereus的MIC（表S2）。其中48条（96%）表现出显著抗菌活性，MIC≤64 μg/mL。值得注意的是，XWC26显示出最强抑制活性，MIC低至2 μg/mL。此外，XWC1、XWC7、XWC35和XWC46也表现出低MIC（4 μg/mL）。这些结果验证了所用ML预测模型的准确性，并进一步证实了公式生成文库的高质量。
抗菌剂通常当MBC/MIC比值≤4时被归类为杀菌剂，否则为抑菌剂（Pankey and Sabath, 2004）。我们测定了MIC≤4 μg/mL的AMP对B. cereus的MBC。结果表明，除XWC7的MBC为其MIC的2倍外，其余四种肽的MBC与其MIC一致（表2）。这些发现表明这些AMP对B. cereus具有显著的杀菌活性。
随后，我们测定了MIC≤4 μg/mL的AMP对14种细菌菌株的体外抗菌谱。结果显示，XWC1、XWC26和XWC46对所有14种菌株的MIC≤8 μg/mL，表现出比氨苄青霉素显著更广谱、更强的抗菌活性。值得注意的是，XWC26对革兰氏阴性菌S. lactis和S. haemolyticus显示出最强活性，MIC低至1 μg/mL（表3）。这些结果表明这些肽作为对抗多种细菌病原体的有效抗菌剂具有广阔前景。
为更直观地展示所测AMP的抗菌效力，我们计算了针对革兰氏阳性菌（G1MIC）、革兰氏阴性菌（G2MIC）和所有测试菌株（GMIC）的几何平均MIC（表4）。XWC1、XWC7、XWC26和XWC46的G1MIC均低于其对应的G2MIC，表明候选AMP对革兰氏阳性菌的抗菌效果优于革兰氏阴性菌。这一趋势与已知的革兰氏阳性和阴性菌结构差异一致：革兰氏阴性菌的外膜常作为渗透屏障，限制抗菌肽到达细胞质膜。在候选AMP中，XWC26表现出最低的G1MIC（2.83 μg/mL）、G2MIC（4.49 μg/mL）和GMIC（3.45 μg/mL），表明其抗菌活性最为显著。
【数据】AMP阳性率：48/50（96%）MIC≤64 μg/mL；XWC26 MIC：2 μg/mL；XWC1/7/35/46 MIC：4 μg/mL；XWC26对S. lactis和S. haemolyticus MIC：1 μg/mL；XWC26 G1MIC：2.83 μg/mL；G2MIC：4.49 μg/mL；GMIC：3.45 μg/mL
3.3 AMP的体外稳定性
我们考察了XWC1、XWC7、XWC26、XWC35和XWC46在不同温度、pH和蛋白酶处理下的稳定性（表5）。热稳定性测试显示，所有肽在100°C加热1小时后仍保持全部抗菌活性。因此，这些AMP可被认为是热稳定的。
pH稳定性结果显示，XWC7在pH 2.0至10.0的广泛范围内保持稳定。XWC1、XWC26、XWC35和XWC46在pH 2.0-7.4范围内维持抗菌活性，但在pH 10时活性略有降低。这些结果表明所测肽在酸性和中性条件下表现出显著稳定性，其中XWC7具有更广的pH耐受性。
蛋白酶稳定性测试结果显示，XWC1、XWC26、XWC35和XWC46暴露于胃蛋白酶时保持抗菌活性，而XWC7活性略有降低。然而，所有AMP暴露于胰蛋白酶或蛋白酶K后，抗菌活性降低了8至16倍。这些结果表明，AMP在酸性蛋白酶存在下表现出更高的稳定性，但更容易被碱性蛋白酶降解。
【数据】热稳定性：100°C、1h后活性完全保持；pH范围：XWC7稳定于pH 2.0-10.0，其余肽稳定于pH 2.0-7.4；蛋白酶处理：胰蛋白酶/蛋白酶K处理后活性降低8-16倍
3.4 AMP的溶血活性
我们使用小鼠红细胞测定了XWC1、XWC7、XWC26、XWC35和XWC46的溶血活性，以初步评估其体外安全性（图1A）。所有AMP在浓度低于2 μg/mL时均表现出可忽略的溶血活性。在4 μg/mL时观察到轻度溶血，在8 μg/mL时检测到显著溶血活性，溶血率超过20%。XWC26在其MIC浓度下溶血率低于5%，表明其选择性作用于革兰氏阳性菌膜而非哺乳动物细胞膜。
【数据】溶血活性：<2 μg/mL可忽略；4 μg/mL轻度溶血；8 μg/mL溶血率>20%；XWC26在MIC（2 μg/mL）时溶血率<5%
3.5 XWC26的时间-杀菌动力学
XWC26在所有测试AMP中效力最高，这直接促成了其在溶血活性测试中的更好表现。此外，其稳定性与其他AMP相当。这些结果促使我们将其作为重点进行深入研究。
我们随后评估了XWC26随时间抑制B. cereus生长的能力（图1B）。结果表明，在XWC26终浓度为1 × MIC（2 μg/mL）时，所有B. cereus细胞在10分钟内被杀死，与蜂毒肽（8 μg/mL）的效果相似。这表明XWC26具有快速杀菌活性，可能使其能够迅速破坏细菌细胞，减少细菌适应或产生耐药性的机会，这在各种应用场景中可能非常有利。
【数据】杀菌时间：1 × MIC（2 μg/mL）下10分钟内全部杀死B. cereus；对照：蜂毒肽8 μg/mL
3.6 XWC26的作用机制
我们进一步研究了XWC26对B. cereus的作用机制。对照组SEM图像显示完整、光滑的细胞膜。相比之下，经XWC26处理的细胞表现出显著的形态变化，细胞表面不规则，出现明显……
（原文该节后续内容未在节选中完整呈现）
【数据】XWC26处理浓度：2 × MIC（4 μg/mL）；处理时间：1h；观察方法：SEM、激光共聚焦显微镜
讨论与解读
本研究通过结合HDPs γ-core保守序列的理性设计与机器学习预测，成功构建了高质量AMP候选文库。文库中91.6%的序列被预测为潜在AMP，远高于随机文库的3.61%，验证了基于保守序列设计策略的有效性。前50条候选肽中96%表现出实际抗菌活性，ML预测模型的准确性得到实验证实。
XWC26脱颖而出，具有最低MIC（2 μg/mL）、广谱抗菌活性、快速杀菌动力学（10分钟内）和良好的热稳定性。机制研究表明其通过破坏细胞膜发挥作用，这与阳离子AMP的典型作用模式一致。XWC26对B. cereus污染米饭的清除效果（16 μg/mL、2小时）表明其在实际食品体系中的应用潜力。
编译者解读
从合成生物学应用角度审视，本研究展示了一条高效的抗菌肽开发路径：以天然保守结构基序为骨架、以机器学习为筛选引擎、以实验验证为闭环。该方法显著提高了阳性命中率（96%），避免了传统随机筛选的低效。XWC26的快速杀菌特性对食品防腐尤为可贵——速效意味着细菌耐药突变机会大幅降低。然而，胰蛋白酶和蛋白酶K处理导致活性下降8-16倍，提示其在富含蛋白酶的食品体系（如肉类）中的稳定性可能受限，未来可考虑D-型氨基酸替换或肽环化等策略加以改善。此外，溶血活性在8 μg/mL时超过20%，治疗窗口较窄，实际应用浓度需谨慎把控。
参考来源
Chen, X. (2025). Design, characterization, and application of novel antimicrobial peptides against Bacillus cereus. International Journal of Food Microbiology. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2025.111398
DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2025.111398