来源：Genome-wide exploration of beneficial Bacillus subtilis isolate from resistant banana cultivar Anaikomban towards the management of Fusarium wilt in banana（Journal of Agriculture and Food Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
香蕉枯萎病由尖孢镰刀菌古巴专化型（Foc）引起，长期威胁全球香蕉产业。本研究从抗性香蕉品种Anaikomban中分离到一株内生细菌AKPS2，经16S rRNA鉴定为枯草芽孢杆菌。体外对峙实验显示其对Foc S16的抑制率达61.11%。研究团队整合全基因组测序、泛基因组分析与分子对接技术，揭示该菌株通过编码surfactin等抗菌肽抑制病原菌的遗传基础。分子对接预测surfactin与Foc靶蛋白结合力最强（−12.1 kcal/mol），毒饵法实验进一步验证其85%的体外抑制率。该研究为香蕉枯萎病的生物防治提供了基因组层面的理论支撑。
研究背景
香蕉是全球第四大粮食作物，仅次于水稻、小麦和玉米，在热带和亚热带地区的饮食结构与经济中占据关键地位。其果实富含矿物质和维生素，全年可供应的特性使其成为许多发展中国家粮食安全战略的重要组成。然而，由土传病原真菌尖孢镰刀菌古巴专化型引起的枯萎病（又称巴拿马病）已困扰香蕉种植逾百年。该病原菌侵染香蕉维管束系统，导致植株萎蔫、叶片黄化乃至死亡。20世纪中期，热带1号小种（TR1）几乎摧毁了当时主导市场的Gros Michel品种，促使全球改种抗TR1的Cavendish品种。但热带4号小种（TR4）的出现再度威胁香蕉产业，亟需可持续的防控策略。生物防治——尤其是利用植物内生菌——被视为替代化学杀菌剂的重要方向。
研究方法
2.1 内生细菌分离与抗真菌活性评估
从抗性香蕉品种Anaikomban（AA）的不同组织——叶片、假茎、叶柄和根——分离内生细菌。该品种保存于印度泰米尔纳德邦农业大学种质资源收集中心（北纬11°07′3.36″，东经76°59′39.91″）。每种组织采集3个代表性样品，无菌装入塑料袋后运抵实验室。内生细菌分离参照Ravi等[19]的标准流程。分离所得菌株以对峙培养法[20]筛选对Foc S16（登录号：PP239076）的抗真菌活性。具体操作：从培养7天的Foc S16菌落边缘切取5 mm菌丝块，置于含PDA培养基的无菌培养皿一侧；待测细菌培养物调至OD600=0.5后，用接种环在距培养皿边缘1 cm处、与菌丝块正对的位置划线接种。对照平板仅接种真菌菌丝块、不接细菌。对峙实验独立进行3轮，每株菌每轮设3个重复。所有平板于28°C培养7天后评估真菌生长抑制情况。真菌菌落径向生长量通过校准直尺沿两条垂直轴线测量菌落中心至边缘的距离，取两次测量均值为径向生长值。径向生长抑制率按公式计算：抑制率(%) = (C−T)/C × 100，其中C为对照平板真菌菌落径向生长量，T为处理平板（有细菌存在）的径向生长量。抑制率最高的菌株经16S rRNA基因测序鉴定，并选作全基因组测序，以开展基因组表征和生物防治潜力挖掘。
【数据】菌株来源：香蕉品种Anaikomban组织（叶、假茎、叶柄、根）；靶标菌：Foc S16（登录号PP239076）；菌丝块直径：5mm；菌龄：7天；培养基：PDA；接种OD600：0.5；划线距离：距边缘1cm；培养条件：28°C、7天；抑制率公式：(C−T)/C×100
2.2 全基因组测序与组装
基因组DNA提取前，先培养B. subtilis AKPS2以获得足量生物量。挑取纯化单菌落划线于Luria-Bertani（LB）琼脂平板，37°C培养24小时以确保纯度。随后将单菌落接种于50 mL LB肉汤（组分：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl），37°C、180 rpm振荡培养16小时至对数生长后期。培养物于4°C、6000 rpm离心10分钟收集菌体，所得细胞沉淀用于基因组DNA提取。使用QIAGEN DNA提取试剂盒（Qiagen）提取B. subtilis AKPS2的基因组DNA。DNA质量与浓度经NanoDrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳评估。高质量基因组DNA在Illumina HiSeq 2500平台（Illumina, Inc., USA）上进行双端测序。原始测序读段经生物信息学流程处理，包括综合基因组分析平台PATRIC（Pathosystems Resource Integration Center）[21]和TORMES-1.0流程。Unicycler v0.4.8用于组装。原始读段质量控制使用Trimmomatic进行接头修剪和质量过滤，采用默认参数。
【数据】培养基：LB琼脂/LB肉汤（10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl）；培养：37°C、24h（平板）、37°C、180rpm、16h（液体）；离心：6000rpm、10min、4°C；测序平台：Illumina HiSeq 2500；组装工具：Unicycler v0.4.8；质控工具：Trimmomatic（默认参数）
2.3 基因组注释与功能分析
使用SPAdes[22]组装获得的AKPS2基因组，随后以RAST工具包（RASTtk）[23]进行注释，遗传密码表版本为11。注释流程鉴定了编码序列（CDS）、转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）及其他基因组特征。蛋白质功能注释及相应酶学委员会（EC）编号的分配参照Ref.[24]的方法。基因本体论（GO）术语依据Ashburner[25]的方法分配。代谢通路通过KEGG（京都基因与基因组百科全书）数据库[26]进行映射。AKPS2基因组中蛋白质家族注释遵循Davis[27]的框架，亚系统分析用于探究特定蛋白质在各种生物学过程和结构功能中的参与情况[28]。为挖掘基因组次级代谢产物潜力，使用antiSMASH 6.0.0（‘relaxed’严格度）[29]鉴定与抗菌化合物生物合成相关的基因簇。基因组进一步用Abricate和PATRIC筛查毒力相关基因，剔除覆盖率或一致性低于90%的基因。转运蛋白、毒力因子、药物靶点和抗生素抗性基因等专化基因，基于CARD、NDARO、PATRIC、DrugBank、TTD、TCDB、PATRIC_VF、VFDB和Victors等多个数据库的同源搜索进行注释。这些基因与各自数据库比对，以突出其与已知生物学功能的关联。基因组还采用基于k-mer的检测方法筛查 antimicrobial resistance（AMR）基因，该方法将序列与代表性AMR基因变体的精选集合比对，赋予功能注释，详述抗生素耐药机制及与每个AMR基因关联的特定药物类别或抗生素。注释后的基因组揭示数个可能参与抗菌肽生物合成的基因簇。
【数据】组装工具：SPAdes；注释工具：RASTtk（遗传密码表11）；次级代谢簇预测：antiSMASH 6.0.0（relaxed模式）；毒力基因筛选：Abricate和PATRIC（覆盖率/一致性>90%）；数据库：CARD、NDARO、PATRIC、DrugBank、TTD、TCDB、PATRIC_VF、VFDB、Victors
2.4 比较基因组学与泛基因组分析
比较基因组学分析用于将Bacillus subtilis AKPS2基因组置于相近菌株的背景下，理解其功能潜力。分析整合了多种工具和流程，包括M1CR0B1AL1Z3R[30]，用于基因注释、直系同源检测、序列比对和系统发育重建。M1CR0B1AL1Z3R提供综合框架，提取并比较所选基因组的特征，确保系统分析基因组相似性与差异性。B. subtilis AKPS2及选定参考菌株的基因组使用Prodigal以“normal”模式[31]注释。该工具采用无监督机器学习准确预测开放阅读框（ORF），从而鉴定高置信度的蛋白质编码序列。随后使用M1CR0B1AL1Z3R进行同源搜索，每个ORF与数据集中的所有其他ORF比对。直系同源群使用马尔可夫聚类（MCL）算法鉴定，膨胀参数设为2.0[32]。B. subtilis AKPS2的基因组岛（GIs）使用Island Viewer 4工具[33]预测。该集成平台结合多种GI预测方法以保证准确性。将B. subtilis AKPS2完整基因组序列上传至Island Viewer 4界面，基于组成偏差、移动相关基因和序列特征分析基因组区域。Island Viewer整合三种预测工具——IslandPick、IslandPath-DIMOB和SIGI-HMM，分别基于比较基因组学、编码序列特征和密码子使用偏好鉴定GIs。跨工具重叠的预测被归类为高置信度GI。B. subtilis AKPS2的泛基因组分析使用Roary[34]进行。该分析共纳入31个基因组，包括AKPS2分离株和30个公开可用的基因组。
【数据】直系同源检测：MCL算法（膨胀参数2.0）；基因组岛预测：Island Viewer 4（IslandPick、IslandPath-DIMOB、SIGI-HMM）；泛基因组工具：Roary；基因组数：31（AKPS2+30公开基因组）；ORF预测：Prodigal（normal模式）
研究结果
3.1 高效内生细菌的分离、筛选与鉴定
从抗性香蕉品种Anaikomban（AA）的不同组织共成功分离到15株内生细菌，该品种保存于哥印拜陀泰米尔纳德邦农业大学种质资源收集中心。其中，叶片获得3株，假茎获得3株，叶柄获得6株，根获得3株，各组织均产生形态不同的细菌菌落。这15株菌基于形态特征的差异被选入抗真菌筛选，以确保来自不同植物组织的内生微生物组具有多样性代表。采用对峙培养法评估这些菌株对Foc S16的生物防治潜力，通过比较处理组与对照组中Foc菌丝生长抑制情况确定各菌株的抗真菌效力。全部15株菌均表现出可测量的抗真菌活性，抑制率范围为23.33%至61.11%（图1，图S2）。其中，编号为AKPS2的菌株表现出最高的菌丝抑制率——61.11%。其他抗真菌效果显著的菌株包括AKPt3（52.22%）、AKRt1（50.00%）和AKPS3（48.61%）。体外对峙实验独立进行3轮，每株菌每轮设3个重复以保证可重复性。AKPS2持续表现出明显的抑菌圈，显示其对Foc S16具有强拮抗效果。鉴于其优越的抗真菌性能，AKPS2被选作分子鉴定。AKPS2的16S rRNA基因测序显示其与Bacillus subtilis具有高达99%的序列相似性，确认了其分类学身份。该鉴定结果经NCBI数据库比对验证，最终将该菌株命名为Bacillus subtilis strain AKPS2。AKPS2的16S rRNA基因序列已提交GenBank，获得登录号OR827192。
【数据】分离菌株数：15（叶3、假茎3、叶柄6、根3）；抑制率范围：23.33%–61.11%；AKPS2抑制率：61.11%；AKPt3：52.22%；AKRt1：50.00%；AKPS3：48.61%；16S rRNA相似性：≥99%；GenBank登录号：OR827192；重复：3轮×3重复
3.2 枯草芽孢杆菌AKPS2的完整基因组组装与注释
来自抗性香蕉品种的B. subtilis AKPS2基因组组装产生单条重叠群（contig），总长4,572,713 bp，表明该基因组完整且高度连续。基因组G+C含量为43.60%，符合枯草芽孢杆菌物种的典型特征。N50和L50值均等于整个基因组长度，进一步证明组装的高质量和完整性。未检测到质粒，提示AKPS2菌株完全依赖其染色体基因组执行生物学功能，不含任何染色体外遗传元件。基因组使用RAST工具包（RASTtk）注释，确认该菌株的分类学归属为Bacillus subtilis。其分类谱系为：细胞生物 > 细菌 > 陆生菌群 > 厚壁菌门 > 芽孢杆菌纲 > 芽孢杆菌目 > 芽孢杆菌科 > 芽孢杆菌属 > 枯草芽孢杆菌群 > 枯草芽孢杆菌。基于遗传密码表11的注释共揭示5035个蛋白质编码序列（CDS）、93个蛋白质合成所必需的转运RNA（tRNA）基因和27个核糖体RNA（rRNA）基因，反映出该生物体具备高效蛋白质翻译的能力（表1）。在B. subtilis AKPS2基因组的5035个蛋白质编码序列中，4249个蛋白质被赋予特定功能角色。这些功能分配表明基因组中有相当一部分编码参与各种生物学过程的、特征明确的蛋白质。其中相当数量的蛋白质（1205个）被赋予酶学委员会（EC）编号，将其与特定酶活性关联，为理解该生物的代谢途径和生化能力提供了信息。此外，994个蛋白质被注释了基因本体论（GO）术语，帮助将其归入生物学过程、分子功能和细胞组分三类。另有900个蛋白质被映射至KEGG通路，有助于勾勒该细菌的代谢网络和信号转导通路，揭示Bacillus subtilis AKPS2如何与环境互作并执行基本生理过程。PATRIC数据库鉴定出4711个蛋白质属于属特异性蛋白家族（PLFams），4812个蛋白质属于跨属蛋白家族（PGFams），说明这些蛋白质在不同细菌属间的进化保守性，以及它们在芽孢杆菌属内的特化角色（表2）。B. subtilis AKPS2的注释基因组可视化展示于图2，图中呈现了重叠群、正负链编码序列、潜在目标遗传元件以及GC含量和GC偏斜等核苷酸组成特征。
【数据】基因组长度：4,572,713 bp；G+C含量：43.60%；N50=全长；L50=1；质粒：未检出；CDS：5035；tRNA：93；rRNA：27；功能注释蛋白：4249；EC编号：1205；GO注释：994；KEGG通路：900；PLFams：4711；PGFams：4812
3.3 枯草芽孢杆菌AKPS2基因组的亚系统分析
B. subtilis AKPS2基因组的亚系统分析揭示其生物学功能分布广泛，共涉及1962个基因，归入11个亚系统（图3）。最突出的亚系统是代谢，包含96个亚系统中的860个基因，表明该生物体具有复杂的生化途径。蛋白质加工是另一主要类别，41个亚系统中有236个基因参与，凸显蛋白质合成与修饰的重要性。与应激反应、防御和毒力相关的基因也得到充分体现，32个亚系统中有174个基因，展示了该生物的适应性和生存机制。细胞过程由27个亚系统中的266个基因代表，调控细胞分裂和信号传导等重要功能。能量产生涉及25个亚系统中的251个基因，确保旺盛的代谢活动。DNA加工功能在17个亚系统中占110个基因，支持复制、修复和转录调控等关键角色。膜转运——细胞边界分子交换所必需——在16个亚系统中包含91个基因。RNA加工亚系统在13个亚系统中分布61个基因，对基因表达调控至关重要。细胞包膜形成涉及4个亚系统中的22个基因，对维持细胞完整性至关重要。较小但同样重要的贡献来自杂项功能（4个亚系统中14个基因）和调控与细胞信号传导（3个亚系统中10个基因），它们帮助调节细胞反应和通讯。
【数据】亚系统基因总数：1962；亚系统数：11；代谢：860基因/96亚系统；蛋白质加工：236基因/41亚系统；应激/防御/毒力：174基因/32亚系统；细胞过程：266基因/27亚系统；能量产生：251基因/25亚系统；DNA加工：110基因/17亚系统；膜转运：91基因/16亚系统；RNA加工：61基因/13亚系统；细胞包膜：22基因/4亚系统；杂项：14基因/4亚系统；调控与信号：10基因/3亚系统
3.4 枯草芽孢杆菌AKPS2的专化基因
B. subtilis AKPS2基因组含有多种与已知转运蛋白、毒力因子、药物靶点和抗生素抗性基因同源的基因。这些专化基因通过与多个成熟数据库比对鉴定，为理解该菌株的潜在功能能力提供了信息。使用三个独立数据库鉴定B. subtilis AKPS2中潜在的抗生素抗性基因：综合抗生素抗性数据库（CARD）获得13个同源基因，国家耐药生物数据库（NDARO）鉴定出4个基因，而通过PATRIC数据库比对获得的抗生素抗性相关基因数量最多，达59个。这些抗生素抗性基因的多样性提示B. subtilis AKPS2可能具备多种抵御不同抗菌化合物的机制。基因组分析还揭示了可能作为潜在药物靶点的基因。其中78个基因与DrugBank数据库条目同源，该数据库收录已知和潜在药物靶点。另有3个基因与治疗靶点数据库（TTD）条目存在相似性。此外，大量基因……
【数据】CARD同源基因：13；NDARO同源基因：4；PATRIC抗生素抗性基因：59；DrugBank同源基因：78；TTD同源基因：3
3.5 泛基因组分析
泛基因组分析揭示了B. subtilis物种的基因组多样性与核心基因组特征。图7展示了核心基因、软核心基因、外壳基因和云基因的分布情况，以及泛基因组稀有化曲线。稀有化曲线描述了随着更多基因组被纳入分析，累积基因簇数量的变化趋势。蓝色线条代表基因簇累积的趋势线。
【数据】基因组数：31（AKPS2+30公开基因组）；工具：Roary；原文未详述核心/软核心/外壳/云基因具体数量
3.6 分子对接分析
分子对接研究评估了抗菌肽和杀菌剂与Foc靶蛋白的结合亲和力。热图（图8）展示了各抗菌肽和杀菌剂与Foc蛋白靶标的结合亲和力。其中，surfactin表现出最强的结合亲和力，与关键Foc靶蛋白的结合能达到−12.1 kcal/mol。图9展示了surfactin与Foc多种靶蛋白的3D对接复合物（a）以及2D相互作用图（b）。
【数据】surfactin最强结合亲和力：−12.1 kcal/mol
3.7 surfactin的体外抗真菌活性验证
采用毒饵法技术评估surfactin对Foc S16的抗真菌活性（图10）。结果显示，surfactin对Foc S16实现了85%的体外抑制率，从而验证了计算预测的准确性。该实验结果将分子对接的预测与实际的生物学功能联系起来，证实了surfactin作为AKPS2菌株主要抗真菌因子的作用。
【数据】surfactin体外抑制率：85%；靶标：Foc S16；方法：毒饵法
讨论与解读
B. subtilis AKPS2的综合分析展示了其作为香蕉枯萎病生物防治剂的卓越潜力。该研究强调了微生物内生菌在植物保护和生长促进中的多重角色，为可持续农业策略提供了关键见解。研究结果与越来越多支持使用有益微生物作为化学杀菌剂环保替代品的证据相吻合。通过全基因组分析、分子对接研究和体外抗真菌实验的组合，本研究提供了AKPS2生物防治效力的遗传、生化与分子基础。
B. subtilis作为生物防治剂的效力已在多种病理系统中得到广泛报道。例如，B. subtilis GLB191对引起葡萄霜霉病的活体营养卵菌Plasmopara viticola表现出显著的生物防治效果[47]。类似地，B. subtilis 1JN2被报道可抑制由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病[48]。AKPS2基因组分析揭示了预测编码抗菌化合物的生物合成基因簇，包括surfactin、bacillibactin、locillomycin和fengycin，提示其针对Foc所观察到的抗真菌活性的潜在机制。这些预测抗菌化合物的分子对接研究……
编译者解读：该研究展示了"基因组驱动"的生物防治菌株开发范式——从抗性品种内生菌分离出发，经全基因组测序锁定次级代谢产物基因簇，再以分子对接筛选先导化合物，最后用体外实验闭环验证。这种策略将传统的"随机筛选抗菌株"升级为"先看基因再验功能"，显著提高了活性化合物发现的效率。尤其值得肯定的是，surfactin的分子对接预测（−12.1 kcal/mol）与毒饵法验证结果（85%抑制率）高度一致，体现了计算生物学与实验生物学良好互证。局限在于，研究仍停留在体外与基因组层面，缺乏温室和田间条件下的防效数据；且基因组中预测的多个抗菌肽基因簇（如locillomycin、fengycin）尚未逐一进行功能验证。未来若能结合基因敲除或异源表达实验，将更完整地阐明各抗菌肽在生防过程中的实际贡献。
参考来源
期刊：Journal of Agriculture and Food Research, 2025
DOI: 10.1016/j.jafr.2025.101834
DOI: 10.1016/j.jafr.2025.101834