来源：Development of a peptide-based KIM-1 biosensor utilizing computationally designed CCT3-derived peptides（Microchemical Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
肾损伤分子-1（KIM-1）是临床公认的肾损伤生物标志物。本研究通过计算设计获得两种CCT3衍生结合肽（CCT3-BP03与CCT3-BP04），与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合表达后构建电化学KIM-1传感器。分子对接预测结合亲和力分别为−8.8和−8.1 kJ/mol，MD模拟显示MBP-CCT3-BP04结构稳定性更优，最终传感器的检测限达1.02 ng/mL，落入临床尿样KIM-1浓度范围。
研究背景
现代生活方式推动了非传染性疾病的全球性增长，急性肾损伤（AKI）可进展为慢性肾病（CKD）。2021年数据显示，与高体重指数相关的慢性肾病在全球导致约418,400人死亡和1040万伤残调整生命年（DALYs）。自1990年以来，CKD相关死亡率增加了354%，受影响人数超过6.74亿。CKD以肾小球滤过率持续降低和/或白蛋白尿水平升高为特征，早期常无症状，往往在明显肾损伤后才被发现。因此，开发可及的即时检测工具对CKD的早期发现和监测至关重要。KIM-1作为肾损伤的公认生物标志物，建立准确灵敏的检测方法具有重要临床价值。本研究旨在通过计算设计KIM-1结合肽，并利用蛋白结合肽融合策略开发生物传感器。
研究方法
2.1 化学试剂与仪器
结合亲和力最高的肽序列由GenScript（日本福冈）化学合成。氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、十二水合磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、铁氰化钾（K₃[Fe(CN)₆]）和亚铁氰化钾（K₄[Fe(CN)₆]）购自FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪）。酵母提取物、胰蛋白胨和N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺（EDC）购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州）。均苯四甲酸二酐（PMDA）和KIM-1蛋白分别购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州）和Elabscience Biotechnology Inc.（美国德克萨斯州）。在最优条件下，结合亲和力测试使用工作电极为4 mm直径的丝网印刷碳电极（SPCEs），购自DropSens（西班牙奥维耶多）。KIM-1生物传感器的构建使用碳对电极和工作电极（4 mm）SPCEs，购自Biogenes Sdn. Bhd.（马来西亚塞尔当），银参比电极Ag/AgCl购自ALS（日本东京）。电化学分析使用Metrohm（瑞士黑里绍）的μStat-i 400 s恒电位仪/恒电流仪/阻抗分析仪。
2.2 肽设计模板的计算机筛选
利用Yang等人[22]在急性肾损伤模型中通过免疫共沉淀研究鉴定的20个结合伴侣蛋白数据集，筛选潜在的KIM-1结合蛋白。所有20种蛋白均经过计算机筛选以选择合适的肽设计模板。首先，使用AutoDock Vina 2软件[23]进行蛋白-蛋白分子对接分析，评估KIM-1与各结合伴侣蛋白表面暴露区域的结合方式。KIM-1（PDB ID: 5DZO）及其他结合伴侣蛋白的三维结构均从Protein Data Bank数据库获取。对接分析前，使用AutoDockTools软件对蛋白结构进行预处理，网格参数和旋转自由度设置根据各蛋白的尺寸定制。此外，使用GROMACS软件对所有结合伴侣蛋白-KIM-1对进行分子动力学（MD）模拟，采用CHARMM36m全原子力场模拟天然蛋白行为[24–26]。每个模型在TIP3P水模型中溶剂化，以0.15 M KCl作为中和离子进行能量最小化。能量最小化使用最陡下降算法，直至最大力达到<1000 kJ/mol/nm。随后进行两阶段平衡：先进行100 ps NVT系综，使用V-rescale恒温器在300 K下运行；再进行100 ps NPT系综，使用Parrinello–Rahman恒压器在1 bar下稳定系统密度。初始能量最小化和平衡步骤后，进行100 ns模拟，采用周期性边界条件、Particle Mesh Ewald（PME）静电和LINCS约束（应用于所有涉及氢原子的共价键），以观察蛋白间的动态相互作用。分子对接结果通过预测结合亲和力分析，MD模拟数据使用分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）计算量化总结合能。将初始对接结合亲和力与MM/PBSA总结合能结果耦合，选择与KIM-1表现出最有利结合相互作用的结合蛋白作为肽设计模板模型。
2.3 结合肽设计与计算机验证
模板蛋白在KIM-1及其结合伴侣蛋白的高性能对接模型筛选中确定。随后，使用PDBsum服务器（https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html）识别并定位参与蛋白-蛋白相互作用的特定氨基酸残基。结合伴侣蛋白中与KIM-1结合的残基在其基因图谱中被标记。随后，根据相互作用图谱设计了5种结合肽，即CCT3-BP01、CCT3-BP02、CCT3-BP03、CCT3-BP04和CCT3-BP05，长度介于30至44个氨基酸之间。每种结合肽的设计整合了PDBsum分析鉴定的部分残基，以确保结合功能得到保留。使用AlphaFold3服务器（https://alphafoldserver.com/）预测这些设计结合肽的三维结构，生成各肽的PDB文件。预测3D模型的可靠性使用PROCHECK（https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/PROCHECK）和MolProbity（https://molprobity.biochem.duke.edu/index.php）验证。验证后的结合肽结构随后通过分子对接和MD模拟进行计算机重新评估，考察其与KIM-1的结合行为。在对接结合亲和力和MM/PBSA总结合能方面表现良好的结合肽被选择用于合成和实验测试。
2.4 含MBP融合肽载体的构建及其在大肠杆菌表达系统中的表达
选择pMAL-p5x载体承载合成基因，重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)。基因连接到malE基因下游，形成MBP-肽融合蛋白。两种质粒的构建见补充图S2。含pMal-p5x/CCT3-peptide的大肠杆菌BL21 (DE3)在以下优化条件下表达：1 mL起始培养物加入50 mL Luria-Bertani（LB）培养基，补充0.1 mM氨苄青霉素，37°C、160 rpm孵育至OD600达到0.5。随后加入0.1 mM IPTG，在相同温度下以120 rpm的较慢转速诱导6小时。收集的培养沉淀重悬于结合缓冲液（20 mM Tris-HCl，0.2 M NaCl，1 mM EDTA，pH 7.4）中，超声处理获得可溶性融合蛋白。融合蛋白使用填充在重力柱中的直链淀粉树脂（New England Biolabs，美国马萨诸塞州贝弗利）进一步纯化。柱子先用5倍体积结合缓冲液平衡，再加入样品，结合的融合蛋白用补充10 mM麦芽糖的相同缓冲液洗脱。洗脱组分合并，用10 mM磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4透析。
2.5 MBP融合肽结合亲和力评估
评估设计的结合肽对KIM-1的结合亲和力：将500 pg/mL KIM-1通过EDC-NHS交联固定在多壁碳纳米管（MWCNT）修饰SPE的工作电极上，随后用10 mM均苯四甲酸二酐（PMDA）和1%牛血清白蛋白（BSA）进行封闭步骤以消除非特异性结合。构建的电极随后暴露于不同浓度的MBP融合结合肽（1 μM至1000 μM），各MBP融合肽的结合亲和力通过差分脉冲伏安法（DPV）分析测量，电位范围为−0.3至0.6 V，步进电位0.005 V，脉冲振幅0.2 V，扫描速率0.025 V/s。信号响应与MBP融合肽浓度作图。
【数据】对接软件：AutoDock Vina 2；MD引擎：GROMACS（CHARMM36m力场）；溶剂模型：TIP3P；离子浓度：0.15 M KCl；能量最小化阈值：<1000 kJ/mol/nm；NVT平衡：100 ps/300 K；NPT平衡：100 ps/1 bar；模拟时长：100 ns；表达宿主：E. coli BL21(DE3)；载体：pMAL-p5x；IPTG浓度：0.1 mM；诱导时间：6 h；诱导温度：37°C；摇速：160 rpm（培养）/120 rpm（诱导）；结合缓冲液：20 mM Tris-HCl/0.2 M NaCl/1 mM EDTA pH 7.4；洗脱液：结合缓冲液+10 mM麦芽糖；透析缓冲液：10 mM PBS pH 7.4；KIM-1固定浓度：500 pg/mL；封闭剂：10 mM PMDA + 1% BSA；肽浓度范围：1–1000 μM；DPV参数：−0.3至0.6 V，步进0.005 V，脉冲振幅0.2 V，扫描速率0.025 V/s
研究结果
3.1 计算筛选确定CCT3为肽设计模板
在评估的蛋白中，基于分子对接和MD模拟，CCT3与KIM-1表现出最强的计算机模拟相互作用（表S1）。CCT3的预测对接结合亲和力为−12.4 kJ/mol，MM/PBSA结合能为−49.48 kJ/mol。在对接模型中，KIM-1被观察到与CCT3顶端结构域内的残基广泛相互作用（图1a、b）。这种结合模式提示可能与内源性底物存在竞争或对底物识别具有潜在调节作用[30]。结合界面分析确定了参与KIM-1相互作用的13个关键CCT3残基：Arg229、Tyr231、Ile232、Lys233、Asn234、Arg236、Gln283、Leu284、Lys285、Glu339、Val342、Thr344和Lys366（图1c）。这些残基构成了五种结合肽候选物合理设计的基础。设计的结合肽结构模型在分子对接和分子模拟的计算机重新评估前使用AlphaFold服务器预测。设计结合肽的序列和结构验证（PROCHECK、MolProbity）见表S2、表S3和图S3。值得注意的是，两个结合肽候选物CCT3-BP03和CCT3-BP04在模拟过程中始终表现出良好的结合亲和力、相互作用能和稳定的复合物形成。CCT3-BP03的预测对接结合亲和力为−8.8 kJ/mol，计算MM/PBSA结合能为−45.70 kJ/mol；CCT3-BP04的预测对接结合亲和力为−8.1 kJ/mol，计算MM/PBSA结合能为−36.01 kJ/mol（表1）。MD模拟结构分析包括均方根偏差（RMSD）、氢键数量、回转半径（rGyr）和溶剂可及表面积（SASA），见补充图S4（a-d）。两种肽在模拟过程中均表现出稳定的复合物形成，因此被选择用于实验验证。计算分析在此用于候选物排序而非结合亲和力的定量预测。
【数据】CCT3对接结合亲和力：−12.4 kJ/mol；CCT3 MM/PBSA结合能：−49.48 kJ/mol；CCT3-BP03对接亲和力：−8.8 kJ/mol；CCT3-BP03 MM/PBSA：−45.70 kJ/mol；CCT3-BP04对接亲和力：−8.1 kJ/mol；CCT3-BP04 MM/PBSA：−36.01 kJ/mol；关键残基数：13个；肽长度范围：30–44个氨基酸
3.2 MBP融合CCT3衍生肽的结构与结合评估
为促进可溶性表达和表面固定化，CCT3-BP03和CCT3-BP04与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合。MBP作为重组蛋白纯化的亲和标签，具有内在的伴侣活性，可增强融合肽的正确折叠、溶解性和稳定性[31]。此外，MBP对淀粉的强亲和力允许在淀粉包被电极上进行受控取向，确保肽暴露以与KIM-1相互作用。为评估融合是否影响肽-靶标相互作用，对MBP融合构建体进行了计算机重新评估。两种融合蛋白的对接分数相当（−14.6 kJ/mol）。MM/PBSA计算得出MBP-CCT3-BP03的结合能为−64.39 kJ/mol，MBP-CCT3-BP04为−42.85 kJ/mol（表2）。能量分解分析表明，范德华相互作用是计算结合能的主要有利贡献，特别是对MBP-CCT3-BP03而言。然而，这些相互作用能来源于溶液相模拟，未考虑表面固定化约束、空间效应、肽取向或电化学传感构型固有的可及性限制。因此，计算能量及其各组分在计算框架内进行比较性解释，而非作为实验传感器性能的定量预测指标。100 ns分子动力学模拟的结构分析揭示了两种构建体之间不同的稳定性特征。骨架RMSD分析显示，MBP-CCT3-BP04相对于其初始结构的偏差比MBP-CCT3-BP03更小且更稳定（图2a）。RMSF分析表明两种系统的MBP结构域（残基1–370）波动均较低，提示融合未破坏整体支架的稳定性（图2b）。在肽区域内，MBP-CCT3-BP04表现出相对较低的波动幅度，表明构象灵活性受到更多限制。MBP-CCT3-BP04的回转半径在整个模拟过程中保持相对稳定（图2c），而MBP-CCT3-BP03表现出较大波动，提示更大的构象扩张。一致地，MBP-CCT3-BP04的溶剂可及表面积（SASA）值较低（图2d），表明结构更紧凑。氢键分析进一步显示，MBP-CCT3-BP04在模拟期间维持了更高的平均氢键数量（图2e），反映了良好的结构内聚性。总体而言，这些发现突出了溶液相条件下动态行为和结构紧凑性的差异。计算结合能（倾向于MBP-CCT3-BP03）与电化学性能（倾向于MBP-CCT3-BP04）之间的差异可能源于当前模拟模型未捕获的表面固定化和取向效应，强调了实验验证的重要性。
【数据】MBP-CCT3-BP03对接分数：−14.6 kJ/mol；MBP-CCT3-BP04对接分数：−14.6 kJ/mol；MBP-CCT3-BP03 MM/PBSA：−64.39 kJ/mol；MBP-CCT3-BP04 MM/PBSA：−42.85 kJ/mol；MD模拟时长：100 ns；MBP结构域残基范围：1–370
3.3 MBP-CCT3-BP03和MBP-CCT3-BP04的表达与纯化
重组构建体在IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。可溶性组分的SDS-PAGE分析显示，两种MBP融合构建体均在4至6小时之间达到最大表达量，表现为约48 kDa处的粗条带，与构建体大小相符（图3a）。随后，可溶性组分纯化的SDS-PAGE分析在约48 kDa处产生相同条带，另有一条约42 kDa的可见条带，对应仅含标签的MBP，与融合构建体共纯化（图3b）。此处，MBP-CCT3-BP03的条带比MBP-CCT3-BP04更淡，表明前者回收率较低。纯化蛋白随后缓冲液交换至10 mM PBS（pH 7），用于下游结合亲和力测定，以避免Tris缓冲液在表面固定化期间的潜在干扰[32]。
【数据】表达宿主：E. coli BL21(DE3)；诱导剂：IPTG；最大表达时间：4–6 h；融合蛋白条带大小：约48 kDa；MBP标签条带大小：约42 kDa；缓冲液：10 mM PBS pH 7
3.4 表观亲和常数（K_app）的实验测定
MBP-CCT3-BP03和MBP-CCT3-BP04对KIM-1的结合使用Langmuir图进行电化学评估，见图S5。MBP-CCT3-BP03和MBP-CCT3-BP04对KIM-1的K_app分别为0.079 nM（R² = 0.92）和0.13 nM（R² = 0.98）。两种MBP融合肽的K_app值表明对KIM-1具有良好的结合亲和力，其中MBP-CCT3-BP04比MBP-CCT3-BP03表现出更强的结合亲和力。为确认测量的相互作用归因于设计的肽而非融合标签，单独评估MBP作为对照。MBP的计算K_app为0.0005 nM（R² = 0.94），显著低于融合构建体，确认MBP对KIM-1的内在亲和力极小。尽管计算预测提示两种构建体之间的相对结合能略有不同，但实验亲和力测量确定MBP-CCT3-BP04为更强结合者。基于这些结果，选择MBP-CCT3-BP04用于后续生物传感器开发。
【数据】MBP-CCT3-BP03 K_app：0.079 nM（R² = 0.92）；MBP-CCT3-BP04 K_app：0.13 nM（R² = 0.98）；MBP对照K_app：0.0005 nM（R² = 0.94）
3.5 电极制备与表面优化
KIM-1生物传感器构建在SPCE工作电极上（图S6）。根据先前报道，电极首先用MWCNT-壳聚糖（MWCNT-CS）修饰以增强导电性和粘附性[33,34]，然后包被1%淀粉，通过MBP-多糖亲和力实现MBP-CCT3-BP04的取向固定化。更高的淀粉浓度（>2%）导致表面问题。
【数据】MWCNT-壳聚糖修饰：用于增强导电性；淀粉包被浓度：1%；更高淀粉浓度（>2%）导致表面问题（原文未详述具体问题）
讨论与解读
本研究证明了计算设计的CCT3衍生肽可作为KIM-1检测的功能识别元件。据作者所知，除Yang等人的质谱研究外，这是首个探索CCT3衍生序列与KIM-1相互作用并用于生物传感的工作。肽候选物CCT3-BP04通过分子对接和分子动力学模拟合理设计，与MBP融合实现受控固定化，并成功整合到电化学传感平台。在优化条件下，传感器表现出浓度依赖性信号响应。需指出，报告的亲和力值代表受MBP融合和电极界面效应影响的表面限制相互作用，而非溶液中测定的内在热力学常数。淀粉中间层利用了MBP与多糖之间的天然亲和力，实现温和且可能取向化的固定化；但无淀粉固定化策略未在本研究中探讨，留待未来探索。该系统在缓冲液和模拟尿液样本中均表现出选择性检测，确认了在复杂基质中的功能性能。
编译者解读：本研究展示了计算设计与实验验证相结合的有效路径——用AutoDock Vina和GROMACS筛选模板、AlphaFold3预测肽结构、再以电化学实验落地验证。值得关注的是，计算结合能排序（偏好BP03）与实验亲和力排序（偏好BP04）出现分歧，作者将其归因于表面固定化效应，这提示计算设计在溶液相与界面条件下的预测差异仍是实际应用中的关键瓶颈。MBP融合策略兼具表达辅助与定向固定双重功能，设计巧妙；但传感器目前仅在模拟尿液验证，距临床样本应用仍有距离。检测限1.02 ng/mL落在临床尿样范围内，具备转化潜力。
参考来源
Razib, M. S. M. (2026). Development of a peptide-based KIM-1 biosensor utilizing computationally designed CCT3-derived peptides. Microchemical Journal, 118092. DOI: 10.1016/j.microc.2026.118092
DOI: 10.1016/j.microc.2026.118092