来源：Adaptively evolved chitin overproduction in Saccharomyces cerevisiae（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
几丁质是一种高价值生物聚合物，传统上从甲壳类动物中提取。本研究利用适应性实验室进化（ALE）策略，在卡泊芬净（CAS）压力下对酿酒酵母进行约200代驯化，成功筛选出几丁质过量积累的进化菌株。全基因组测序鉴定出88个独特突变，其中特定突变组合（Fks1 p. Pro647Arg、Fks2 p. Arg1203∗和Ecm21 p. Glu642∗）可将细胞几丁质含量提升至野生型的7倍，为无动物源几丁质的工业化生物生产奠定了基础。
研究背景
几丁质是由(1,4)连接的N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（GlcNAc）组成的多糖，在生物医学、化妆品和材料等领域具有广阔应用前景。传统几丁质从甲壳类动物中提取，而利用微生物真菌可在任何地理位置全年进行无动物源、高品质几丁质的生物技术生产。近期，利用双孢蘑菇进行工业规模几丁质生物生产已被证明可行，但提高单位生物量的几丁质产量是提升经济吸引力的关键。
真菌细胞壁中几丁质的沉积受细胞生长阶段的严格调控。当细胞面临细胞壁完整性威胁时，几丁质合成速率可迅速增加。研究表明，葡聚糖合成、糖基化、内吞作用、脂质代谢或应激反应缺陷的真菌细胞会出现几丁质过量生产。通过过表达酿酒酵母和库德毕赤酵母中的几丁质生物合成基因，已实现最高2.9倍和4.43倍的几丁质积累提升。然而，几丁质含量受多条细胞调控通路控制，遗传基础复杂，需要更系统的策略来实现大幅提升。
研究方法
2.1 酵母菌株构建
所有酵母菌株均来源于酿酒酵母BY4742（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）。为构建KRE6基因敲除菌株（kre6Δ0），使用引物对kre6_fw和kre6_rv（表S1）从pUG 6质粒扩增KRE6敲除 cassette，采用Phusion™高保真DNA聚合酶（ThermoFisher Scientific）进行PCR扩增。PCR条件如下：98°C初始变性30秒；6个循环的98°C 10秒、60°C 30秒、72°C 30秒；34个循环的98°C 10秒、68°C 30秒、72°C 30秒；最后72°C延伸10分钟。敲除cassette包含KRE6开放阅读框（ORF）5′和3′端各50 bp同源臂，中间为KanMX筛选标记。PCR扩增的敲除cassette经1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳后，使用Macherey-Nagel™ NucleoSpin™ Gel和PCR Clean-up试剂盒（Fisher Scientific）纯化，然后采用醋酸锂法转化至酿酒酵母BY4742中。转化子在含有200 μg/ml G418的YPD琼脂平板（10 g/L酵母提取物、20 g/L细菌蛋白胨、20 g/L葡萄糖、20 g/L细菌琼脂）上筛选。敲除菌株通过使用KAPA2G hotstart mastermix（Roche）对基因组DNA进行KanMX cassette的PCR扩增确认，基因组DNA使用MasterPure Yeast DNA Purification Kit（Biosearch Technologies）提取，引物为kanmiyai和kanmiyai（表S1）。PCR条件如下：95°C初始变性5分钟；35个循环的95°C 15秒、60°C 15秒、72°C 15秒；最后72°C延伸2分钟。
【数据】菌株：酿酒酵母BY4742（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）；敲除基因：KRE6；筛选标记：KanMX（G418抗性）；G418浓度：200 μg/ml；PCR退火温度：60°C/68°C；延伸温度：72°C
2.2 卡泊芬净IC50测定
CAS对酿酒酵母BY4742和kre6Δ0的半抑制浓度（IC50）参照CLSI M27-A2指南进行测定，并作部分修改。简言之，细胞在YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L细菌蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中于30°C、220 rpm振荡过夜培养。取适量过夜培养物接种至含或不含CAS的YPD培养基中，置于Nunc™ 96孔聚苯乙烯圆底微量培养板（ThermoFisher Scientific）中，起始OD600为0.1，总体积100 μl。CAS浓度范围为0至5 μg/ml。背景对照（Blank）仅含100 μl YPD培养基。96孔板在Biotek 2 Synergy酶标仪（Agilent BioTek）中培养，设置如下：30°C、轨道振荡、OD600连续监测48小时，间隔15分钟。数据以空白对照归一化，使用OriginPro v 10.2.5.234绘图。
【数据】菌株：BY4742和kre6Δ0；起始OD600：0.1；CAS浓度范围：0-5 μg/ml；温度：30°C；振荡：轨道振荡；监测时间：48h；监测间隔：15min
2.3 卡泊芬净对酵母几丁质含量的影响
酿酒酵母BY4742和kre6Δ0菌株分别在YPD和YPD + G418琼脂上于30°C培养48小时。从每个平板挑取3个单菌落接种至5 ml YPD中，于30°C、220 rpm振荡培养24小时。这些预培养物用于接种24孔板中的3 ml YPD，起始OD600为0.1。在30°C、220 rpm振荡培养10小时后，向一半培养物中加入0.1 μg/ml CAS，向其余培养物中加入等体积水。随后继续培养至总培养时间达48小时，之后收取1 ml培养物用于几丁质定量。
【数据】预培养体积：5 ml YPD；培养温度：30°C；振荡：220 rpm；预培养时间：24h；接种体积：3 ml；起始OD600：0.1；CAS添加浓度：0.1 μg/ml；CAS添加时间点：培养10h后；总培养时间：48h
2.4 适应性实验室进化
酿酒酵母BY4742和kre6Δ0菌株分别在YPD和YPD + G418琼脂上划线，于30°C培养48小时。从每个平板挑取5个菌落分别接种至5 ml YPD预培养液中，于30°C、220 rpm振荡培养24小时，为每个菌株创建5个重复亲本培养物以启动ALE谱系。从每个预培养物制备1 ml 20%甘油的冷冻保藏液，作为酿酒酵母BY4742和Δkre6各重复ALE谱系的亲本。
紫外线（UV）处理群体通过以下方法制备：首先制备酿酒酵母BY4742预培养物——从YPD平板挑取单菌落接种至5 ml YPD培养基中，于30°C、220 rpm振荡培养24小时。然后将此预培养物用10 ml无菌水稀释至OD600为0.1，转移至培养皿中。含细胞的培养皿在GS Gene Linker UV腔室（Bio-Rad）中暴露于UV光，能量设置为30 mJ，以确保75%致死率。培养皿随后在室温下避光放置30分钟，然后将细胞悬液收集至离心管中。细胞通过3900 rpm离心5分钟收集，重悬于1 ml YPD中。该悬液直接用于启动5个ALE谱系（UV处理组）。同时从细胞悬液制备1 ml 20%甘油的冷冻保藏液，作为所有UV处理ALE谱系的亲本。
ALE在24孔板中进行，每孔含3 ml培养培养基。酿酒酵母野生型（BY4742）和UV处理谱系的培养培养基为含0.1 μg/ml CAS的YPD，kre6Δ0谱系的培养培养基为含0.14 μg/ml CAS的YPD。酿酒酵母野生型（BY4742）和kre6Δ0菌株的预培养物以及UV处理细胞的悬液用于接种各孔培养培养基，起始OD600为0.1，为每个菌株和UV细胞悬液创建5个独立ALE谱系。平板于30°C、220 rpm振荡培养。每两或三天进行连续传代，将30 μl前一代培养物转移至新鲜培养培养基中，然后按上述条件培养。ALE持续进行30次传代，CAS浓度每周递增，最高达16 μg/ml。每次传代前和最终培养结束后，从每个ALE谱系培养物制备甘油冷冻保藏液。
【数据】亲本菌株：BY4742、kre6Δ0、UV处理BY4742；每个菌株谱系数：5个重复；起始OD600：0.1；培养温度：30°C；振荡：220 rpm；传代体积：30 μl；传代间隔：2-3天；总传代数：30次；CAS浓度范围：0.1→16 μg/ml（每周递增）；UV能量：30 mJ；致死率：75%；UV后避光时间：30min；离心：3900 rpm 5min
2.5 几丁质定量
对于ALE进化群体，从每个群体的冷冻保藏液中取少量接种至3 ml含与ALE期间相同CAS浓度的YPD中，于30°C、220 rpm振荡培养48小时，然后收集1 ml用于几丁质定量。
对于重工程菌株，每个菌株从冷冻保藏液划线至YPD琼脂平板以获得单菌落，平板在30°C培养箱中培养48小时。随后挑取单菌落接种至3 ml YPD中，于30°C、220 rpm振荡预培养24小时。取适量预培养物加入3 ml新鲜YPD中，使最终起始OD600为0.1，于30°C、220 rpm振荡培养48小时，然后收集1 ml培养物用于几丁质定量。
酵母细胞壁中几丁质含量采用Nguyen等人（2025）开发的染色方法进行测定，并作部分修改。收集1 ml细胞培养物，8000 rpm离心1分钟去除培养基。细胞沉淀重悬于1 ml Milli-Q水中，使用Q500 Sonicator（QSONICA，美国）进行超声处理以释放细胞聚集体，设置如下：25%振幅、10秒、2秒脉冲开启、2秒脉冲关闭。超声后记录OD600，取相当于OD600为1.24（约2 × 10⁷个细胞，图S1）的适量细胞悬液，14,000 rpm离心3分钟收集。去除上清液后，将超声处理的细胞沉淀与100 μl染色溶液混合，染色溶液含2%葡萄糖、10 mM Na-HEPES pH 7.2和25 μM Calcofluor White M2R。混合物于30°C、1200 rpm振荡孵育45分钟。孵育后，14,000 rpm离心3分钟去除上清液。染色细胞沉淀用100 μl TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM EDTA）洗涤一次以去除多余染色液。随后沉淀重悬于100 μl TE缓冲液中并转移至……
【数据】ALE群体培养：3 ml YPD + 对应CAS浓度；温度：30°C；振荡：220 rpm；时间：48h；取样量：1 ml；重工程菌株预培养：3 ml YPD 24h；起始OD600：0.1；培养时间：48h；超声条件：25%振幅、10s、2s脉冲开/关；OD600：1.24（约2×10⁷细胞）；染色液：2%葡萄糖、10 mM Na-HEPES pH 7.2、25 μM Calcofluor White M2R；染色条件：30°C、1200 rpm、45min；离心：8000 rpm 1min / 14,000 rpm 3min
研究结果
3.1 CAS暴露富集酿酒酵母kre6Δ0菌株的几丁质
为量化CAS暴露对野生型（BY4742）和β-1,6-葡聚糖合成受损的kre6Δ0菌株几丁质积累的影响，两种菌株均培养至指数期后向培养基中加入0.1 μg/ml CAS（抑制β-1,3-葡聚糖合成）。0.1 μg/ml是CAS对BY4742菌株的半抑制浓度（IC50），而kre6Δ0菌株具有更高的CAS IC50（即0.14 μg/ml），这可能是由于几丁质过量积累所致（图S2）。CAS暴露后，野生型和kre6Δ0菌株的细胞壁几丁质含量均增加约四倍（图1）。在无CAS条件下，kre6Δ0细胞的几丁质含量约为野生型的三倍。因此，CAS暴露使野生型菌株的几丁质含量超过了由糖基水解酶缺失（即kre6Δ0）导致β-1,6-葡聚糖生物合成受损所引发的几丁质过量积累水平。
【数据】菌株：BY4742（WT）和kre6Δ0；CAS浓度：0.1 μg/ml（WT的IC50）；kre6Δ0的IC50：0.14 μg/ml；CAS暴露后几丁质增加：约4倍（两菌株）；无CAS时kre6Δ0几丁质含量：约为野生型的3倍
3.2 ALE有效提升谱系的CAS耐受性
由于CAS暴露被证实可导致野生型酿酒酵母（BY4742）和kre6Δ0菌株的几丁质过量积累，因此进行了CAS存在下的ALE（图1B）。野生型（BY4742）（即WT谱系）、kre6Δ0菌株（即kre6Δ0谱系）和UV处理的BY4742（即UV处理谱系）各5个重复谱系在连续批次培养中独立无性进化约200代。在连续批次培养ALE中，进行了30次1%转移至新鲜生长培养基的操作，CAS浓度从0.1 μg/ml逐渐增加至16 μg/ml，直至28次转移。
来源于野生型（BY4742）和kre6Δ0亲本菌株的ALE终点群体在16 μg/ml CAS存在下分别约20和30小时达到饱和生长（图2）。由于这与野生型菌株在无CAS条件下的生长速率相似，所有谱系的ALE终点群体均已发展出CAS耐受表型。
为评估进化谱系的几丁质含量，使用Calcofluor White染色测定了亲本、ALE中点进化（ALE 23）和ALE终点进化（ALE 30）群体的几丁质含量。细胞在CAS浓度与ALE化学环境相对应的条件下培养（即ALE 23为8 μg/ml，ALE 30为16 μg/ml），以保持克隆组成。无法在CAS存在下生长的亲本细胞则在无CAS条件下培养。
如预期所料，几乎所有ALE谱系（无论是ALE终点还是中点群体）的几丁质含量均高于相应亲本群体在无CAS条件下的含量（图2）。最高几丁质含量出现在野生型ALE谱系3的ALE中点进化群体（WT3_ALE23）中，其比几丁质含量比相应亲本群体在无CAS条件下高7.5倍（ANOVA和Tukey检验，n = 3，P值 < 0.01）。部分进化群体表现出温和的几丁质含量增加，包括来源于野生型酿酒酵母菌株的谱系。WT1、WT4和UV处理3的ALE谱系在ALE过程中几丁质含量较相应亲本群体增加不到两倍（ANOVA和Tukey检验，n = 3，P值 < 0.01）。此外，kre6Δ0谱系5的进化终点群体未观察到几丁质含量增加。然而，kre6Δ0谱系的所有其他终点进化群体较相应亲本kre6Δ0群体显示1.2至2.2倍的几丁质含量增加（ANOVA和Tukey检验，n = 3，P值 < 0.01）。
在ALE后期（即从第23次到第30次转移），CAS浓度最高时，所有来源于UV处理群体的谱系（UV处理）的几丁质含量均有所增加，UV3除外。在来源于kre6Δ0亲本菌株的谱系中，kre6Δ0-1和kre6Δ0-3的几丁质含量从第23次到第30次转移期间增加，而kre6Δ0-5在ALE后期下降。因此，最高几丁质含量并不总是在ALE终点群体中发现。在来源于野生型（BY4742）亲本菌株的ALE谱系（WT）中，最高几丁质含量出现在ALE中点群体。这表明，除了几丁质过量积累外，ALE过程中还发展出了其他耐受CAS的解决方案。
【数据】ALE代数：约200代；传代比例：1%；CAS递增范围：0.1→16 μg/ml；终点群体饱和时间：WT来源约20h、kre6Δ0来源约30h（16 μg/ml CAS下）；最高几丁质含量：WT3_ALE23，为亲本的7.5倍（ANOVA/Tukey检验，n=3，P<0.01）；kre6Δ0终点群体增加倍数：1.2-2.2倍（n=3，P<0.01）；WT1/WT4/UV3增加倍数：<2倍
3.3 ALE期间富集的变异揭示应对β-1,3-葡聚糖合成抑制的解决方案
为鉴定可能介导CAS耐受和几丁质丰富表型的变异，对亲本群体（BY4742、kre6Δ0、UV处理）和进化群体（第23次和第30次转移）进行了全基因组测序。全基因组测序数据分析揭示两个超突变谱系（WT1和UV处理5），其具有超过77个等位基因频率超过20%的变异（表S5）。在这两个超突变谱系中，MSH2基因中检测到一个移码变异（p. Asp38fs）和一个非同义变异（p. Lys39Gln），变异等位基因频率均超过98%。MSH2参与酿酒酵母的错配修复系统，MSH2的无效突变此前已被用于提高突变率。携带MSH2突变的超突变WT1和UV处理5谱系被排除在进一步变异分析之外。
其余26个进化群体共显示43个编码序列（CDS）上的88个独特非同义、终止获得或移码变异，其中大部分属于脂质代谢过程GO类别（图3和表S6）。编码酿酒酵母主要β-1,3-葡聚糖合酶的FKS1和FKS2不仅在重复谱系中反复突变，而且独立于菌株来源。FKS1变异在26个分析群体中的24个中被鉴定到，而FKS2变异出现在全部26个群体中。在进化群体中，FKS2和FKS1分别发现13个和22个独特变异。FKS1中的大多数变异为置换，且落入此前报道的两个热点（HS）区域HS1（即氨基酸位置635至649）和HS2（即氨基酸位置1354至1361）（表1）。然而，还发现了许多发生在先前报道的HS区域之外的移码和截短变异（即终止获得），其中大部分在kre6Δ0来源的进化群体中检测到。
除FKS1和FKS2外，SUR1、YHR217C、ECM21、WHI2和ELO2中的变异也出现在两个以上进化群体中。WHI2、ELO2和YHR217C中的变异仅在共享来源的谱系中发现。WHI2和ELO2中的变异仅在kre6Δ0菌株来源的谱系中检测到，而YHR217C中的变异仅在UV处理群体来源的谱系中观察到。相比之下，SUR1在野生型和UV处理谱系中均发现突变，但SUR1（p. Ala121Asp）变异与YHR217C变异同时出现（表S5）。
【数据】超突变谱系：WT1和UV5（>77个变异，等位基因频率>20%）；MSH2变异：p. Asp38fs和p. Lys39Gln（频率>98%）；纳入分析的进化群体：26个；独特变异总数：88个；受影响CDS：43个；FKS1变异群体数：24/26；FKS2变异群体数：26/26；FKS1独特变异数：22个；FKS2独特变异数：13个；热点区域：HS1（aa 635-649）、HS2（aa 1354-1361）
3.4 ALE富集变异的重工程揭示几丁质丰富表型的遗传基础
接下来，对显示最高几丁质含量的进化群体（WT3_ALE23）中检测到的变异进行深入研究，以鉴定哪些变异可能介导几丁质过量积累（表2）。Fks1编码序列中的两个非同义突变（p. Pro647Arg和p. Arg1357Cys）和Fks2中的一个突变（p. Leu1203∗）已在群体中固定（即变异等位基因频率>98%）。Fks1 p. Pro647Arg突变在膜蛋白中可能是有害的，因为α-螺旋中L-脯氨酸到L-精氨酸的转换会影响螺旋形状（图S3）。Fks1 p. Arg1357Cys突变将一个带正电荷的……
【数据】分析群体：WT3_ALE23；Fks1变异：p. Pro647Arg、p. Arg1357Cys（等位基因频率>98%）；Fks2变异：p. Leu1203∗（等位基因频率>98%）
讨论与解读
通过在ALE化学环境中引入CAS实现几丁质过量积累的适应性耦合似乎是成功的，因为大多数进化群体表现出增加的几丁质含量。类似地，通过在过氧化氢（H₂O₂）存在下对酿酒酵母和红冬孢酵母进行适应性进化，抗氧化剂β-胡萝卜素的产量也得到了改善。在这两个案例中，通过使用影响细胞调控和代谢系统的化学试剂（即CAS和H₂O₂）直观地创建了目标性状的适应性耦合。计算模型可以促进适应性耦合的创建，全基因组规模代谢模型已被证明可用于预测酶抑制剂效应和设计适合选择特定代谢性状的化学环境。
对在递增CAS浓度下适应性进化的群体进行全基因组测序表明，β-1,3-葡聚糖合酶Fks1和Fks2的突变很可能是CAS耐受的原因，这与先前研究结果一致。此外，在所有CAS耐受的进化群体中均检测到FKS1和FKS2以外基因的一个或多个高频突变。先前研究表明，神经酰胺生物合成、线粒体呼吸链或……
编译者解读
本研究巧妙地将"细胞壁胁迫→几丁质补偿性积累"这一天然应激机制转化为定向进化筛选压力，通过CAS梯度递增实现了几丁质产量的7倍提升。方法学上，ALE结合全基因组测序与靶向重工程验证的策略，系统解析了多基因协同调控几丁质积累的遗传网络，为真菌细胞壁工程提供了可复用的研究范式。值得注意的是，研究揭示了几丁质过量积累与CAS耐受性之间的非耦合关系，提示工业生产中可将性状筛选与耐受性筛选解耦设计。该工作为构建工业级几丁质生产菌株提供了明确的基因靶点，但菌株在工业发酵条件下的表现仍需进一步验证。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2026
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102499
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102499