来源：A label-free 2D MnO2 nanozyme-based tension-gauge tether biosensor for voltametric detection of cell-generated adhesion force through cell determination（Microchemical Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
细胞产生的黏附力在肿瘤生长与局部侵袭中扮演关键角色，但这一pN尺度的力学信号测量长期缺乏简便手段。本研究构建了基于二维MnO₂纳米酶和DNA张力栓绳结构（TGT）的伏安型力学生物传感器，利用无铜漆酶模拟纳米酶的电催化活性，通过DNA双链在约12 pN和约56 pN阈值力下的解链来报告HeLa细胞黏附力。传感器在500至5×10⁶细胞范围内呈现线性响应，最低可检测500个贴壁细胞，且无需标记、信号开启式输出，为细胞力学与肿瘤研究提供了新工具。
研究背景
细胞诱导的黏附力不仅调控生长、分裂、分化及信号转导等基础细胞功能，还驱动维持稳态和组织再生所需的拉伸、弯曲与排列过程。该力通过影响癌细胞从原发肿瘤脱离、穿透血管或淋巴管、侵袭周围组织并最终形成新肿瘤的能力，成为癌症转移的关键因素。此外，细胞诱导的黏附力产生不规则的液体和固体应力，促进肿瘤生长和局部侵袭，并损害多种治疗的效果。细胞膜黏附分子（整合素、选择素、钙黏蛋白等）通过与靶配体结合，在皮牛（pN）尺度上施加力。然而，pN尺度的黏附力测量颇具挑战——细胞牵引力显微镜（TFM）虽为非侵入性光学成像技术，但操作程序精密、数据分析复杂；微柱阵列也可用于测量，同样存在局限性。本研究探索了开发一种能响应HeLa细胞不同水平黏附力并产生伏安信号的TGT探针的可行性，设计了基于预设DNA双链结构的两种伏安TGT力传感器，其解链阈值力分别约为12 pN和约56 pN，并将这些双链结构连接到二维MnO₂纳米酶覆盖的电极表面。
研究方法
2.1 材料与方法
磷酸盐缓冲液（PBS）购自伊朗Kawsar Biotech Co.。合成寡核苷酸序列由伊朗Faza Pajooh Co.制备。除非另有说明，所有化学品均购自Sigma-Aldrich。
2.2 二维Mn-uNF纳米酶的制备
二维Mn-uNF纳米酶采用化学沉淀法结合碱蚀刻法合成，具体参照Wu等人先前报道的方法。该过程初始步骤为通过化学沉积法在介孔二氧化硅材料（SBA-15）表面直接形成MnO₂纳米膜，随后用化学蚀刻去除Si。合成步骤概括如下：
1. 将3 mL MnSO₄·4H₂O（0.334 mM）加入分散于20 mL蒸馏水中的5 mg SBA-15中。
2. 将1 mL三乙醇胺水溶液（2.338 mM）逐滴加入上述悬浮液，在30°C下反应2小时。
3. 所得浅黄色悬浮液离心，沉淀产物用双蒸水洗涤三次。
4. 产物在70°C烘箱中干燥，最后在450°C下煅烧3小时以去除残留挥发性组分。
5. 采用湿化学蚀刻法制备Mn-uNF：将25 mL蒸馏水加入0.5 g NaOH和4.0 g Mn-uNF/Si的混合物中，转移至烧瓶。
6. 该混合物在40°C油浴中加热，然后在30°C恒温机械摇床中振荡。
7. 蚀刻20小时后，产物用双蒸水冲洗三次，然后在−45°C下干燥。
8. 该合成方法的产率为1 g。MnO₂纳米片在水中分散良好，形成棕色溶液。
【数据】MnSO₄·4H₂O用量：3 mL（0.334 mM）；SBA-15：5 mg；蒸馏水：20 mL；三乙醇胺：1 mL（2.338 mM）；反应温度：30°C；反应时间：2h；干燥温度：70°C；煅烧：450°C，3h；NaOH：0.5 g；Mn-uNF/Si：4.0 g；蚀刻温度：40°C油浴+30°C摇床；蚀刻时间：20h；干燥温度：−45°C；产率：1 g
2.3 伏安生物传感器的构建
将二维Mn-uNF纳米酶（200 μL，1 mg mL⁻¹）与2-甲基咪唑（2-MD）（30 μL，50 mM）的混合物滴加到电抛光的玻碳电极（GCE）表面，覆盖整个电极表面，在室温下干燥。将2D Mn-uNF-2-MD固定于GCE后，将氢醌（HQ，0.05 mM）滴加到修饰电极表面。
为设计基于可被约12 pN力破坏的DNA双链结构的电化学TGT生物传感器，将100 μL锚定链（C6-GTGTCGTGCCTCCGTGCTGTG，10 μM）滴加到GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ表面，室温放置过夜。孵育期间，锚定DNA链与MnO₂偶联形成DNA-MnO₂纳米复合物。随后，用双蒸水冲洗修饰后的GCE以去除非特异性吸附的锚定DNA链。为尽量减少GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ/Anchor DNA表面的非特异性结合，将100 μL BSA（0.25%）滴加到修饰后的GCE表面，室温孵育30分钟。
DNA可通过其磷酸骨架有效偶联到MnO₂表面。Polyanichko等人报道锰阳离子可与磷酸氧和DNA碱基（尤其是胞嘧啶）相互作用。红外光谱也显示锰与胞嘧啶的CO基团存在相互作用。基于磷酸根与锰的配位作用，DNA被用作软模板引导Mn₃(PO₄)₂纳米颗粒的生成。总体而言，锰对ssDNA和双链DNA具有独特的行为，可轻易形成涉及核碱基和磷酸氧原子的两类直接键合。更重要的是，单链DNA（ssDNA）可有效吸附在纳米片表面。研究也证实双链DNA（dsDNA）的吸附量显著低于ssDNA。尽管ssDNA与氧化石墨烯（GO）可通过强相互作用结合，但基于盐休克实验，ssDNA对MnO₂的亲和力强于对GO的亲和力。ssDNA在MnO₂纳米片基面上的物理吸附以及磷酸骨架和核碱基的配位作用解释了DNA对MnO₂的强亲和力。这些相互作用对生物传感和生物成像等多种应用至关重要。DNA-MnO₂纳米复合物用于电极修饰的潜力在电化学生物传感器设计中非常有用。
锚定链通过DNA与MnO₂的偶联固定到修饰后的GCE表面后，将100 μL生物素化DNA链（CACAGCACGGAGGCACGACAC-biotin）（配体DNA，10 μM）滴加到电极表面，然后与链霉亲和素和生物素化cRGDfK孵育，以在电极表面完成TGT探针的组装。最后，将设计好的TGT生物传感器用PBS洗涤，储存在4°C。
【数据】2D Mn-uNF纳米酶：200 μL（1 mg mL⁻¹）；2-MD：30 μL（50 mM）；HQ：0.05 mM；锚定链：100 μL（10 μM）；孵育条件：室温过夜；BSA：100 μL（0.25%），室温30 min；配体DNA：100 μL（10 μM）；储存条件：4°C
2.4 HeLa细胞产生力的传感流程
HeLa细胞在含10%胎牛血清（FBS）、100 U mL⁻¹链霉素和100 U mL⁻¹青霉素的DMEM培养基中培养，培养箱为Eppendorf Galaxy，CO₂浓度设定为5%（v/v）。该CO₂浓度模拟人血液中的CO₂水平，有助于将培养基pH调节至适合细胞生长和存活的生理范围。
为脱附HeLa细胞，用HEPES缓冲液（0.1 M，pH = 7.6）中的EDTA（2 mM）处理细胞10分钟，然后以1400 rpm离心三次，每次10分钟。EDTA结合在细胞黏附中起重要作用的Mg和Ca离子，从而促进细胞从表面脱附。HEPES缓冲液在孵育期间维持稳定的pH。
分析前，将HeLa细胞重悬于50% v/v DMEM和50% v/v PBS（0.2 M，pH = 7.2）组成的溶液中。为测定HeLa细胞产生的力，将100 μL含5 × 10³细胞的溶液滴加到TGT生物传感器表面。采用DPV模式记录生物传感器信号，脉冲幅度为80 mV，步进电位为20 mV。
【数据】培养基：DMEM+10% FBS+100 U mL⁻¹链霉素+100 U mL⁻¹青霉素；CO₂浓度：5% v/v；EDTA浓度：2 mM（HEPES缓冲液0.1 M，pH=7.6）；处理时间：10 min；离心：1400 rpm×3次×10 min；重悬液：50% v/v DMEM+50% v/v PBS（0.2 M，pH=7.2）；细胞用量：100 μL含5×10³细胞；DPV参数：脉冲幅度80 mV，步进电位20 mV
研究结果
3.1 二维Mn-uNF纳米酶的微观与电化学表征
采用扫描电子显微镜（SEM）（ZEISS，德国）表征Mn-uNF的形貌。如图2A所示，Mn-uNF呈现片状结构，与先前文献的SEM结果一致。将2D Mn-uNF-2-MD固定在GCE表面后，用SEM分析修饰后的电极（图2B）。采用EDX（能量色散X射线光谱）谱图确认O和Mn的存在（图2C）。通过粉末X射线衍射（XRD）系统（Philips，荷兰）研究二维MnO₂的晶体结构（图2D）。XRD谱图在2θ = 12.3°、27.1°、36.2°和43.4°处显示明显衍射峰，分别对应米勒指数（001）、（002）、（−111）和（−112）。MnO₂的晶面与标准δ-MnO₂（JCPDS No. 80–1098）一致。
MnO₂的结晶度（α-、β-、γ-、δ-和ε-MnO₂）在调节类漆酶氧化性能中起重要作用。五种MnO₂纳米材料的类漆酶活性按以下顺序降低：γ-MnO₂ > ε-MnO₂ > δ-MnO₂ > α-MnO₂ > β-MnO₂。δ-MnO₂的（−111）晶面在提高其氧化性能中起关键作用。如图2D所示，合成的δ-MnO₂具有大量（−111）晶面。MnO₂纳米片可通过快速单电子转移反应氧化HQ等酚类化合物。此外，这些纳米片具有高电导率、大比表面积、良好生物相容性和强DNA吸附能力等优异性能。
采用三电极体系（恒电位仪/恒电流仪，Autolab PGSTAT302N），通过循环伏安法（CV）比较了GCE/2D Mn-uNF（图3A，曲线a）和GCE/2D Mn-uNF-2-MD（图3A，曲线b）在PBS（pH = 7.2）中对HQ（0.05 mM）的电化学行为。在2D Mn-uNF悬浮液中加入2-甲基咪唑后，HQ催化氧化为对苯醌的速率显著提高。换言之，将2-MD加入纳米酶后，阳极峰电流增加了1.3倍，表明2-MD的电催化活性得到放大。催化性能的增强可归因于2D Mn-uNF表面原位形成的弱N-Mn键，该键能显著稳定纳米酶结构中的表面活性Mn。
将锚定DNA链引入GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ导致纳米酶中催化活性中心被覆盖，随后生物传感器信号减弱（图3A，曲线c）。事实上，与GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ相比，GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ/Anchor DNA的阳极峰电流明显降低。纳米酶表面这些活性中心的密度可显著影响其催化活性。因此，锚定DNA链与纳米酶偶联后（GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ/Anchor DNA），HQ电子传递被阻断，氧化还原信号相对于GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ的峰电流（IP）降低。DNA可通过多种途径削弱或增强合成酶的活性。DNA分子能够阻断合成酶的表面，从而抑制其催化活性。加入配体DNA链后（GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ/Anchor DNA/Ligand DNA），氧化电流强度再次降低（图3A，曲线d）。事实上，互补DNA（配体DNA）的加入进一步降低了峰电流强度。然而，将HeLa细胞引入GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ/Anchor DNA/Ligand DNA后，峰电流显著增加（图3A，曲线e），这可归因于αvβ3整合素与cRGDfK的偶联。HeLa细胞膜上表达的αvβ3整合素与标记cRGDfK的配体DNA结合，导致TGT双链分离。
本TGT生物传感器的信号机制基于利用DNA抑制剂阻断纳米酶活性位点。图3B展示了双链DNA对MnO₂活性中心的掩蔽，导致HQ与2D Mn-uNF之间的电子传递被阻断。与HeLa细胞孵育后，12 pN TGT生物传感器可被破坏。这种破坏的发生是因为传感器被设计为在施加一定水平的力时断裂并释放互补配体链。由于TGT链的分离取决于细胞力，12 pN TGT内的DNA链被HeLa细胞施加的力拉开。因此，当TGT中的两条链解离时，电极电流强度增加。
【数据】XRD峰位：2θ=12.3°（001）、27.1°（002）、36.2°（−111）、43.4°（−112）；标准卡片：δ-MnO₂ JCPDS No. 80–1098；类漆酶活性顺序：γ>ε>δ>α>β；2-MD加入后阳极峰电流增加倍数：1.3倍；HQ浓度：0.05 mM；PBS pH：7.2
3.2 12 pN TGT生物传感器伏安法评估HeLa细胞诱导的黏附力
为检测HeLa细胞产生的黏附力，首先在90分钟孵育期间测定12 pN TGT生物传感器的DPV信号。结果表明，TGT生物传感器的氧化电流强度在60分钟时达到最大值，并在HeLa细胞（5 × 10²）-配体DNA孵育完成后趋于稳定（图4A）。在60分钟孵育时间观察到最高IP，该时间值被选用于其他实验。cRGDfK标记的配体DNA因cRGDfK与HeLa细胞膜上表达的αvβ3整合素结合而从12 pN探针（12 pN TGT）解离的趋势，使所设计的传感器能够通过修饰电极电流的增加来检测细胞力。
此处采用差分脉冲伏安法（DPV）检测细胞黏附引起的电极电流强度变化。为此，在优化条件下，记录了GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ/Anchor DNA/Ligand DNA与5 × 10²个HeLa细胞孵育前后的差分阳极伏安图（图4B）。为进一步研究cRGDfK标记的配体DNA链与HeLa细胞膜上表达的αvβ3整合素的结合，在分别与0、5 × 10²、1×10³、5 × 10³、1 × 10⁴、5 × 10⁴、1 × 10⁵、5 × 10⁵、1 × 10⁶和5 × 10⁶个HeLa细胞孵育60分钟后考察电极响应（图4C）。
与细胞孵育后，12 pN TGT传感器可被破坏并释放互补配体链。结果，大部分双链结构转化为单链形式。所得结果表明，随着HeLa细胞数量从500增加到5 × 10⁶，电流强度呈线性增加（图4D）。随着细胞数量的增加，细胞产生的黏附力增强，更多配体DNA链从电极表面脱离，导致电流强度增加。
酶促生物传感测定的主要局限是长期不稳定性。因此，将GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ/Anchor DNA/Ligand DNA在磷酸盐缓冲液（pH = 7.2）中于4°C储存45天后，评估其对HeLa细胞测定的性能。15天后，GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ/Anchor DNA/Ligand DNA/HeLa细胞（5 × 10²）的电流强度为初始氧化电流的99.6%。30天和45天后，GCE/2D Mn-uNF-2-MD-HQ/Anchor DNA/Ligand DNA/HeLa细胞（5 × 10²）的信号分别达到初始响应的98.9%和97.5%。所提出的TGT生物传感器长期稳定性的关键因素是在该传感装置的制造中使用了2D Mn-uNF纳米酶而非天然漆酶。Gray等人报道了MnO₂纳米片在细胞培养基中的良好稳定性。纳米酶作为克服天然酶化学和热力学不稳定性限制的有效选择，在生物传感器设计中引起了广泛关注。更重要的是，与DNA对纳米酶的抑制作用相反，DNA编码策略可以……
【数据】最佳孵育时间：60 min；HeLa细胞数量范围：0–5×10⁶；线性范围：500–5×10⁶细胞；稳定性测试：15天99.6%，30天98.9%，45天97.5%；储存条件：PBS（pH=7.2），4°C；细胞用量（稳定性测试）：5×10²
3.3 56 pN TGT生物传感器的响应
为验证更高阈值力的TGT探针能否被HeLa细胞产生的力破坏，设计了阈值力约56 pN的TGT生物传感器。将56 pN TGT生物传感器与0、1 × 10⁷、1 × 10⁸、1 × 10⁹和1 × 10¹⁰个HeLa细胞孵育60分钟后记录DPV信号（图5A）。结果显示，即使高达1 × 10¹⁰个HeLa细胞产生的力也不足以破坏56 pN TGT探针，传感器响应未发生明显变化（图5B）。这表明HeLa细胞产生的黏附力水平低于56 pN，进一步验证了12 pN TGT传感器检测细胞力的合理性。由于TGT探针的断裂阈值力较高，所制造的生物传感器的响应不会发生显著变化。
【数据】56 pN TGT孵育时间：60 min；HeLa细胞数量：0–1×10¹⁰；检测介质：0.1 M PBS（pH=7.2）；结果：56 pN探针未被破坏
讨论与解读
本策略展示了纳米酶-DNA生物偶联物在伏安生物传感器中的应用前景。纳米酶与DNA链结合用于生物传感器制造具有以下主要优势：（I）DNA在纳米酶的化学和热力学稳定性中发挥重要作用；（II）纳米酶的活性可通过与DNA链的生物偶联进行调控，同时DNA还可用于识别广泛的靶标。换言之，DNA链能够抑制或增强纳米酶的活性。本研究基于DNA阻断纳米酶活性位点并降低纳米酶活性的作用，设计了一种检测HeLa细胞产生力的伏安生物传感器。结果表明，当HeLa细胞数量从500增加到5 × 10⁶时，电流强度呈线性增加。随着细胞数量的增加，细胞产生的黏附力增强，更多配体DNA链从电极表面脱离，导致电流强度增加。本研究是将基于类漆酶二维MnO₂纳米膜的纳米酶应用于伏安TGT力生物传感器的开创性工作，该传感器表现出良好的测定性能，同时具备无标记和信号开启的特点。
【编译者解读】本研究巧妙地将DNA张力栓绳的力学敏感性与MnO₂纳米酶的催化信号放大相结合，实现了无需昂贵仪器的细胞黏附力电化学检测。选择δ-MnO₂而非天然漆酶，显著提升了传感器的长期储存稳定性（45天仍保持97.5%响应），这对实际转化至关重要。12 pN与56 pN双阈值设计形成对照，有效验证了HeLa细胞产生的力低于56 pN。不过，目前仅在体外细胞模型验证，且检测下限500个细胞对于单细胞力学测量仍有距离。未来若能与微流控结合实现单细胞捕获，或拓展至其他整合素亚型，将进一步提升其生物医学应用价值。
参考来源
Farzin, M.A. A label-free 2D MnO₂ nanozyme-based tension-gauge tether biosensor for voltametric detection of cell-generated adhesion force through cell determination. Microchemical Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.microc.2026.117508
DOI: 10.1016/j.microc.2026.117508