来源：Development of a noncanonical redox cofactor platform in Saccharomyces cerevisiae（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
酿酒酵母是生物制造的核心底盘生物，但异源途径与天然代谢之间的氧化还原辅因子串扰长期制约代谢工程效率。本研究基于烟酰胺单核苷酸（NMN(H)）构建了一套与天然NAD(P)H代谢完全解耦的正交氧化还原辅因子系统。通过重编程糖酵解、筛选高效烯酸还原酶、工程化细胞内NMN+合成通路，研究团队实现了葡萄糖向NMN H的定向电子供给，并首次在真核生物中建立了自维持的新型氧化还原辅因子系统，细胞内NMN+积累达~2.9 mM。
研究背景
酿酒酵母是分子生物学与工程领域的模式生物，广泛应用于次级代谢产物生产、工具开发和新型重组产品筛选。然而，细胞内共享的代谢物池可被内源代谢网络自由访问，导致目标功能与副反应途径之间的交叉干扰。传统代谢工程策略依赖大量基因敲除或空间区隔化来减少非特异性中间体消耗，过程繁琐且代价高昂。
近年来，非经典氧化还原辅因子（NRCs）作为精准控制细胞内电子流向的新工具受到关注。NRCs是天然辅因子NAD(P)+的类似物，但天然酶无法识别，因此由NRC介导的途径网络仅包含少量用户定义的反应，优化难度大幅降低。本研究选择NMN(H)作为目标NRC——其结构较NAD(H)缺少AMP部分，天然酶几乎无法利用，但可通过蛋白质工程改造的酶实现特异性氧化还原循环。
研究方法
2.1 质粒与菌株构建
所有分子克隆操作在大肠杆菌 XL1-Blue 细胞（Stratagene）中完成。本研究所用菌株和质粒汇总于表 S1。质粒组装采用限制性酶切连接法和 Gibson 组装法。用于酶切连接的基因片段通过聚合酶链式反应（PCR）扩增，使用 PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TaKaRa）和 KOD One DNA Polymerase（Toyobo）。所有酿酒酵母转化使用 Zymo Research Frozen-EZ Yeast Transformation II 试剂盒完成。除非另有说明，所有酿酒酵母培养均在 30°C 下进行。所有大肠杆菌培养在 37°C、2x YT 培养基中进行，培养基含 16 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母提取物和 5 g/L 氯化钠。
质粒构建方法如下。xenA 基因从本实验室前期构建的质粒中扩增获得（Black et al., 2020a）。PCR 引物在 5' 端含有悬垂区域，用于在基因两侧添加多克隆酶切位点。所得 DNA 片段用适当的限制性内切酶消化。含有 CEN6/ARS4 复制起点、KanMX 表达盒以及两个带有 TEF1 启动子和 CYC1 终止子的基因表达盒（含多克隆位点）的载体，用相同的限制性内切酶在多克隆位点之一进行消化，使用 T4 DNA Ligase（Roche）与 xenA 连接。所得质粒用于后续以相同方法将枯草芽孢杆菌 gdh 连接至第二个表达盒，生成最终质粒 pW601。其余质粒以相同方式构建。
枯草芽孢杆菌 gdh、枯草芽孢杆菌 gdh S17E-Y39Q-A93K-I195R、土拉弗朗西斯菌 nadE∗、土拉弗朗西斯菌 nadV、杜克雷嗜血杆菌 nadV、青枯菌 nadV、集胞藻属 nadV 和细长聚球藻 nadV 均从本实验室前期构建的质粒中分离获得（Black et al., 2020a, 2020b）。酿酒酵母 nrt1、nrk1、oye2 和 oye3 从酿酒酵母 BY4741 基因组 DNA 中分离。其余烯酸还原酶和 NadV 候选基因以合成基因片段形式购买（Integrated DNA Technologies），基因片段针对酿酒酵母表达进行了密码子优化。
zwf1、pgi1、ydr248c 敲除菌株（WB601）按顺序使用两种基因组编辑方法构建。首先，使用 CRISPR/Cas9 在酿酒酵母 BY4741 中敲除 zwf1。CRISPR/Cas9 系统通过质粒 pRCC-K（Addgene #81191）引入，gRNA 靶序列为 CGGGTCTAAGCCCGCCTACG。本研究所用全部 gRNA 靶序列见表 S2。用于修复双链断裂的供体 DNA 含有 zwf1 起始密码子和终止密码子前后各 40 个碱基对的同源区域。供体 DNA 通过 PCR 从购自 Integrated DNA Technologies 的合成基因构建体扩增获得。供体 DNA PCR 产物使用 Zymo Research DNA Clean and Concentrator Kit 浓缩。将质粒和供体 DNA 共转化至 BY4741，涂布于含 10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、20 g/L 葡萄糖和 50 mg/L G418 的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基平板上。转化子重新划线至相同组成的固体培养基。敲除后，CRISPR/CAS9 质粒通过在非选择性 YPD 培养基上连续传代丢失。敲除通过菌落 PCR 确认，引物结合在修饰区域之外。
pgi1 的后续敲除通过线性供体 DNA 的同源重组完成，方法参照 Akada 等（2006）。具体而言，供体 DNA 含有 pgi1 起始密码子和终止密码子上下游各 1000 个碱基的同源臂，两侧为 URA3 表达盒。两个同源臂通过 PCR 分离，利用重叠延伸 PCR 与 URA3 表达盒拼接生成供体 DNA 片段。供体 DNA 转化至 zwf1Δ 细胞，涂布于合成尿嘧啶缺陷培养基，含 1.8 g/L 酵母氮碱基（不含氨基酸）、5 g/L 酪蛋白氨基酸、5 g/L 硫酸铵、40 mg/L 腺嘌呤、20 g/L 果糖、0.1 g/L 葡萄糖和 15 g/L 琼脂糖。转化子重新划线至新鲜固体培养基，含 1.8 g/L 酵母氮碱基（不含氨基酸）、5 g/L 酪蛋白氨基酸、5 g/L 硫酸铵、40 mg/L 腺嘌呤、5 g/L 果糖、0.1 g/L 葡萄糖和 15 g/L 琼脂糖，以确认生长表型。敲除通过菌落 PCR 确认。所得菌株为 BY4741 zwf1Δ pgi1Δ::URA3。
ydr248c 的后续敲除通过 PCR 生成的供体 DNA 进行同源重组。具体而言，含有 LEU2 表达盒及 ydr248c 起始密码子和终止密码子上下游各 1000 个碱基同源臂的 PCR 片段，通过分别扩增上游、下游和 LEU2 表达盒区域后组装。随后各片段通过 4 片段 Gibson 等温 DNA 组装装入质粒载体。该质粒载体在同源臂上下游含有 EcoRI 限制性酶切位点。敲除用供体 DNA 通过 EcoRI-HF 限制酶（New England Biolabs）消化质粒制备，使用 Zymo Research DNA Clean and Concentrate Kit 浓缩，转化至酿酒酵母 BY4741 zwf1Δ pgi1Δ::URA3 细胞，涂布于合成亮氨酸缺陷培养基平板，含 6.7 g/L 酵母氮碱基（不含氨基酸）、1.46 g/L 酵母合成缺陷培养基补充物（不含尿嘧啶、亮氨酸和色氨酸）、76 mg/L 色氨酸、76 mg/L 尿嘧啶、20 mg/L 腺嘌呤、20 g/L D-果糖、0.1 g/L D-葡萄糖和 15 g/L 琼脂糖。在限定培养基中，低浓度葡萄糖的添加对细胞生长至关重要。细胞在 30°C 培养。单菌落形成后，划线至相同平板确认生长表型，敲除通过 PCR 分离代表性编码区并测序确认。所得菌株为 WB601（BY4741 zwf1Δ pgi1Δ::URA3 ydr248cΔ::LEU2）。
为在 WB601 菌株基因组 DNA 中整合额外拷贝的酿酒酵母 nrt1 和 nrk1 以生成菌株 WB606，使用 ho 位点的同源重组。P PGK1 -nrk1-T ADH1 -P TEF2 -nrt1-T ENO1 片段通过 PCR 从前期构建的质粒中分别分离各组分。启动子、终止子和连接片段从 Yeast Toolkit 的质粒中分离（Lee et al., 2015）。PCR 片段通过重叠延伸 PCR 拼接。所得 PCR 片段通过 Gibson 等温 DNA 组装（Gibson et al., 2009）环化至高拷贝大肠杆菌表达质粒中，该质粒含有两个被 NatMX6 表达盒分隔的 500 碱基对同源臂。P PGK1 -nrk1-T ADH1 -P TEF2 -nrt1-T ENO1 构建体置于 NatMX6 表达盒与上游同源臂之间。用于基因组整合时，所得质粒用 EcoRI-HF 限制酶在同源臂两侧消化，使完整同源片段线性化。消化产物用 Zymo Research DNA Clean and Concentrate Kit 浓缩，转化至 WB601 菌株，涂布于选择性合成培养基，含 6.7 g/L 酵母氮碱基（不含氨基酸）、5 g/L 酪蛋白氨基酸、5 g/L 醋酸铵、40 mg/L 腺嘌呤、20 g/L 果糖、0.1 g/L 葡萄糖、15 g/L 琼脂糖和 100 mg/L 诺尔丝菌素。整合通过 PCR 测序确认，引物结合在操作基因组 DNA 区域上下游（同源臂之外）。酿酒酵母 BY4741 上 NMA1、POF1、NMA2、PNC1、SDT1 和 ISN1 的基因组敲除在……
【数据】菌株：E. coli XL1-Blue、S. cerevisiae BY4741 及衍生菌株；培养基：2x YT（16 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母提取物、5 g/L NaCl）、YPD（10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、20 g/L 葡萄糖）；温度：E. coli 37°C、S. cerevisiae 30°C；抗生素：G418 50 mg/L、诺尔丝菌素 100 mg/L；敲除方法：CRISPR/Cas9（gRNA：CGGGTCTAAGCCCGCCTACG）、同源重组（同源臂 1000 bp）；菌株：WB601（BY4741 zwf1Δ pgi1Δ::URA3 ydr248cΔ::LEU2）、WB606（整合 nrt1/nrk1 至 ho 位点）
研究结果
3.1 建立 NMN(H)介导生物转化的电子来源
酿酒酵母利用多种丰富的原料，如乙醇、甘油和果糖。本研究设想将这些原料作为生物制造中的碳源，而将葡萄糖保留为 NMN(H) 的专用电子来源。因此，产生 NAD(P)H 的天然葡萄糖代谢必须被破坏，并替换为仅利用葡萄糖产生 NMNH 还原力的合成途径。
首先，通过敲除编码糖酵解途径和磷酸戊糖途径关键入口酶的基因——Pgi1、Zwf1 和推定葡糖酸激酶 Ydr248c——破坏了产生天然还原力（NADH 和 NADPH）的糖酵解途径（图1B）。与文献报道一致，该菌株不再能在葡萄糖上生长（Boles et al., 1993; Al-Fahad et al., 2020），因此在生长培养基中补充果糖。该表型确认了细胞无法利用葡萄糖作为原料。
其次，为开放葡萄糖作为电子来源，研究引入了来自枯草芽孢杆菌的工程化葡萄糖脱氢酶（GDH），即 GDH Ortho（Black et al., 2020a）。该酶仅特异性还原 NMN+ 为 NMNH，同时将葡萄糖转化为葡糖酸；其与天然辅因子 NAD(P)+ 的活性已通过蛋白质工程消除。由于同时破坏了推定葡糖酸激酶 Ydr248c（图1B），葡糖酸不会被进一步代谢。这使得 GDH Ortho 成为一条独立的葡萄糖代谢途径，其唯一功能是补充 NMNH。
接下来，研究引入了来自恶臭假单胞菌的烯酸还原酶 XenA（图1C），该酶能够从 NMNH 接受还原力（Black et al., 2020a），同时也能利用 NAD(P)H。通过将底物酮异佛尔酮（KIP）转化为左旋二酮——一种有价值的药物合成砌块——XenA 作为报告酶，用于检测体内不同还原当量的可用性。细胞转化了组成型表达 GDH 和 XenA 的着丝粒质粒。进行静息细胞生物转化：转化子经培养、洗涤、透化后，加入含有 33 mM KIP、葡萄糖和 2 mM NMN+ 的反应缓冲液。
当不存在 GDH 时（XenA 配空表达盒），左旋二酮产量极低（<0.2 mM）（图1D），表明未从葡萄糖获得还原力。这一低水平左旋二酮产量可能归因于反应起始时细胞内存在的内源 NAD(P)H。相反，当 NAD(P) 依赖的野生型 GDH（GDH WT）与 XenA 共表达时，NAD(P)H 形成，驱动了高得多的左旋二酮产量（∼1.2 mM）（图1D）。当 GDH Ortho 与 XenA 共表达时，形成了 NMN 特异性氧化还原循环，产生了 0.83 mM 左旋二酮（图1D）。重要的是，当不补充 NMN+ 时，左旋二酮产量下降至仅 0.42 mM，表明 GDH Ortho 确实在酿酒酵母细胞中特异性产生 NMNH 介导的还原力。未添加 NMN+ 时 GDH Ortho 系统仍产生左旋二酮，可能归因于 NAD+ 补救途径中存在的内源低水平 NMN+（Evans et al., 2010），下文将详述。
【数据】底物：33 mM KIP；辅因子：2 mM NMN+；产量：无 GDH <0.2 mM、GDH WT ~1.2 mM、GDH Ortho 0.83 mM（+NMN+）、GDH Ortho 0.42 mM（−NMN+）；菌株：透化静息细胞
3.2 优化 NMN(H)介导的左旋二酮生产
初步概念验证成功后，研究着手提高 NMN(H) 系统的生产力。首先，从细菌、真菌和植物来源生物勘探了九个额外的烯酸还原酶候选基因。烯酸还原酶已被充分表征，能够利用广泛的天然和非经典氧化还原辅因子（Black et al., 2020a; Knaus et al., 2016）。当烯酸还原酶面板与共表达 GDH Ortho 的细胞配合、并补充 2 mM NMN+ 时，表达额外酿酒酵母 Oye2（ScOYE2）的细胞在 72 小时后左旋二酮产量较表达 XenA 的细胞增加了 ∼2.5 倍（图2A）。先前报道已证明 ScOYE2 是酿酒酵母中将酮异佛尔酮还原为 R-左旋二酮的主要烯酸还原酶（Raimondi et al., 2011）。
其次，研究假设细胞内 NMN+ 辅因子池的浓度可能限制了系统整体活性。为验证该假设，向表达 XenA 和 GDH Ortho 的透化静息细胞在 KIP 生物转化过程中供给浓度梯度为 0.5 至 10 mM 的 NMN+。与假设一致，NMN+ 浓度增加与系统整体活性之间呈强正相关——当补充 10 mM 外源 NMN+ 时，产生了 1.3 mM 左旋二酮（图2B）。重要的是，当省略 GDH（无 GDH，空表达盒）时，随着 NMN+ 浓度增加，左旋二酮产量保持低水平且不变（∼0.1 mM）（图2B），表明细胞中存在干净的代谢背景用于控制 NMNH 产生。
值得注意的是，当优化的酿酒酵母 Oye2 表达系统与 10 mM NMN+ 补充相结合时，各优化组分的效益呈加性效应，48 小时内产生了 2.8 mM 左旋二酮（图2C）。表达 XenA 的系统在补充 10 mM NMN+ 时，相同时间内仅产生 1.9 mM 左旋二酮（图2C）。对外源 NMN+ 补充（最高 10 mM）的这种剂量响应可能源于 NMN+ 跨酿酒酵母细胞膜转运受阻——因为 GDH Ortho 和烯酸还原酶对 NMN(H) 的 K M 均远小于 10 mM（Black et al., 2020a）。事实上，NMN(H) 系统在大肠杆菌中仅需培养基中补充低至 0.25-0.5 mM 的 NMN+ 即可高效工作，且无需细胞透化（King et al., 2022a; Aspacio et al., 2024b），这可能归因于酵母和细菌细胞膜组成和生理状态的差异。进一步挑战的是，静息细胞生物转化反应中 NMN+ 浓度在观察的 96 小时反应期内从 10 mM 下降至 1.9 mM（补充图1），降低了额外补充 NMN+ 对反应系统的效益，尽管在前 24 小时内仍保持高于 GDH Ortho K M 的 NMN+ 池（补充图1）。为增加酵母中 NMN+ 的可用性，可引入最近发现的真核来源 NMN+ 转运蛋白（Grozio et al., 2019），并可采用代谢工程手段支持 NMN+ 的内源生物合成和维持，如下文所述。
【数据】烯酸还原酶筛选：9 个候选；ScOYE2 提升 ∼2.5 倍（72h）；NMN+ 梯度：0.5–10 mM；10 mM NMN+ 时左旋二酮 1.3 mM（XenA）；无 GDH 对照：∼0.1 mM；ScOYE2 + 10 mM NMN+：2.8 mM（48h）；XenA + 10 mM NMN+：1.9 mM（48h）；NMN+ 消耗：10 mM → 1.9 mM（96h）
3.3 利用 NMN(H) 系统引导酿酒酵母中的还原力流向
NMN(H) 相对于 NAD(P)/H 的结构偏差特性（图1A）使其在生物复杂环境（即全细胞和粗裂解液催化）中具备独特能力（Black et al., 2020a; Richardson et al., 2020; Aspacio et al., 2024a）。在此，NMNH 可以特异性传递至目标反应，因为只有经过工程改造能够接受 NMNH 的酶才能访问这一专属电子来源。
为展示 NMN(H) 传递正交还原力的能力，研究使用 ScOYE2 介导的香茅醛生产作为模型系统（图3A）——香茅醛是薄荷醇合成中的宝贵前体（Ribeaucourt et al., 2022）。ScOYE2 将香茅醛还原为香茅醛，而底物和产物均为醛类。醛类在酿酒酵母中高度不稳定，因为众多醇脱氢酶和醛脱氢酶（分别简称 ADHs 和 ALDHs）会迅速将醛类消耗为相应的醇和羧酸。当进行还原性生物转化时，这一挑战进一步加剧——因为 ScOYE2 所需的还原当量同样会供能给 ADHs。当不提供还原力时（无 GDH，空表达盒），香茅醛主要转化为氧化副产物香茅酸和香叶酸/……
【数据】模型底物：香茅醛 → 香茅醛；副产物：香茅酸、香叶酸/橙花酸（原文未详述具体数值）
3.4 酿酒酵母中 NMN+ 的胞内生产与积累
（本节原文节选未完整提供，以下为可获得的实验结果内容）
【数据】原文未详述本节完整数据
3.5 自足型 NMN(H) 介导的酿酒酵母生物转化
（本节原文节选未完整提供，以下为可获得的实验结果内容）
【数据】原文未详述本节完整数据
讨论与解读
本研究在酿酒酵母中成功建立了基于 NMN(H) 的正交氧化还原辅因子平台。通过外源补充或通过异源及从头生物合成途径在胞内生产 NMN+，实现了这一辅因子池的引入。前体饲喂（NR）和额外整合一份 NR 补救途径酶 NRT1 和 NRK1，使胞内 NMN+ 积累达到 ∼2.9 mM，与胞内 NAD+ 水平相当。葡萄糖被重新定位为专门还原 NMN(H) 池的电子来源——工程化 GDH Ortho 特异性还原 NMN+，而用于还原 NAD(P)+ 的糖酵解途径已被消除。
在香茅醛生物合成的概念验证应用中，NMN H 依赖反应在氧化性代谢环境的全局背景下具有独特的驱动力可用性，提示 NMN(H) 的截短结构可能抵抗了细胞内众多电子汇（如呼吸作用、发酵途径、脂质或糖原储存的合成）对其还原力的消耗，从而完成了"池-源-汇"基础设施的构建。本工作选择葡萄糖作为 NMN(H) 电子来源，但 NMN 特异性磷酸脱氢酶（Ping et al., 2025）和醇脱氢酶（Aspacio et al., 2024a）也已被工程化改造。
编译者解读
该研究将非经典辅因子概念从原核拓展至真核底盘，策略上"重编程葡萄糖代谢为专属电子源"与"双层敲除消除内源竞争"的组合尤为巧妙。~2.9 mM 的胞内 NMN+ 积累达到与 NAD+ 相当的水平，是自维持正交系统的关键突破。局限在于 NMN+ 跨膜转运效率低导致需高浓度外源补充，以及多基因敲除对菌株鲁棒性的潜在影响。该平台为真核生物中多步氧化还原途径的精准调控提供了可推广的范式。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2026
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102488
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102488