来源：Engineering stress tolerance in Saccharomyces cerevisiae by overexpressing PIR3 and SPI1 for efficient ethanol production from high-concentration sugarcane molasses（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
高浓度甘蔗糖蜜中钾、钙离子共存是制约酿酒酵母乙醇发酵的主要瓶颈。本研究整合多组学分析、CRISPR介导的基因激活/抑制及靶向过表达策略，锁定PIR3、SPI1、AQR1、GUT2四个关键基因。过表达细胞壁相关基因PIR3与SPI1显著增强菌株胁迫耐受性，抑制AQR1与GUT2则重定向碳代谢流至乙醇合成。工程菌株在5-L发酵罐中乙醇产量达113.3 g/L，较野生型提升24.6%，同时使肉桂酸产量增加12.5%。
研究背景
化石燃料日益枯竭与环保压力迫使全球转向可持续替代能源。生物乙醇作为可再生碳中性能源，在减少温室气体排放与非可再生资源依赖方面扮演关键角色。第二代生物乙醇技术因利用稻草、甘蔗渣等非粮生物质及糖蜜等工业废弃物而备受关注。甘蔗糖蜜作为制糖副产物，富含蔗糖、葡萄糖和果糖等可发酵糖，兼具经济与生态优势，不与粮食作物争地，符合循环经济原则。然而，高浓度糖蜜中钾离子与钙离子共存严重抑制酿酒酵母生长与乙醇合成，成为工业化发酵的主要限制因素。
研究方法
2.1 菌株、质粒与引物
本研究所用酿酒酵母菌株与质粒汇总于表S1，引物汇总于表S2。
2.2 质粒构建
所用质粒均列于表S1。关键质粒包括CRISPR-VPR载体（pRS415-Cas9-VPR-NrsR和pRS423-TyrSgH-KanMX）及基因过表达载体（Yep352-KanMX），均采用无缝组装克隆试剂盒（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit, Genesand, 中国）构建。肉桂酸生物合成质粒（pRS42H-pADH1-PAL2-tADH1）由合成的AtPAL2基因与酵母调控元件组装而成。所有质粒的详细构建方案、引物序列及组装策略见补充方法S1和S2。
2.3 CRISPRa与CRISPRi靶向突变基因
在Dong等人工作基础上，研究团队将CRISPR激活子VPR与转录激活/抑制功能融合，构建了CRISPR-VPR系统。为增强质粒通用性，进行了两项关键改造：营养缺陷型标记替换为显性药物抗性标记，以及开发新型穿梭载体pRS415-Cas9-VPR-NrsR和pRS423-TyrSgH-KanMX。引导RNA（gRNA）依据Benchling CRISPR工具（https://benchling.com/crispr/）设计，采用截短的14-bp靶向序列。CRISPRa选取编码序列上游250–400 bp区域，CRISPRi选取编码序列下游50–150 bp区域。酵母转化采用优化的醋酸锂法。重组质粒pRS415-Cas9-VPR-NrsR与pRS423-TyrSgH-KanMX共转化至酿酒酵母BY4742，通过诺尔丝菌素（NrsR；50 µg/mL）和遗传霉素（G418；150 µg/mL）双重筛选。
2.4 乙醇生产与肉桂酸合成的摇瓶发酵工艺
挑取单菌落接种于含15 mL YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）的100 mL锥形瓶中，30°C、200 rpm振荡培养24 h。所得种子培养液以10%（v/v）接种量转接至50 mL含250 g/L总可发酵糖（TFS）甘蔗糖蜜培养基（含0.2%尿素）。为维持选择压力，两种培养基均添加NrsR（50 µg/mL）和G418（150 µg/mL）。乙醇合成发酵时，发酵容器以气体通透膜（0.22 µm孔径）覆盖并叠加灭菌牛皮纸密封，建立微氧环境同时减少乙醇挥发。肉桂酸生产菌株：采用醋酸锂转化法将质粒pRS42H-pADH1-PAL2-tADH1转化至酿酒酵母GJ08和NGTM-F1（方法S2）。（乙醇生产与肉桂酸合成的培养方法相同。）
2.5 转录组水平分析
挑取单菌落接种于15 mL YPD培养基，30°C、200 rpm振荡培养24 h。种子液以10%（v/v）接种量转接至50 mL含250 g/L TFS甘蔗糖蜜培养基，相同条件下继续培养24 h。采用热酚法提取摇瓶培养24 h后细胞的总RNA。RNA质量通过分光光度法严格验证：仅满足A260/A230 > 2.0（试剂污染最低）及A260/A280 > 1.8（蛋白质干扰低）的样品用于下游实验。第一链cDNA使用FastKing一步法去基因组cDNA第一链合成预混试剂（TIANGEN，北京，中国）合成。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）使用2 × HyperMB SYBR Green qPCR预混液（Sangon Biotech，上海，中国），在iCycler iQ5实时PCR系统（Bio-Rad Laboratories，加利福尼亚，美国）上进行。模板为10–100 ng/μL的cDNA。PCR条件：95°C 2 min；40个循环的95°C变性10 s、60°C退火20 s。所有qRT-PCR定量均与PCR扩增标准品及无模板（水）对照同时进行。基因表达定量采用2^(−ΔΔCt)法，以ACT1为内参基因（ACT1在高浓度甘蔗糖蜜条件下保持相对稳定，数据未显示）。设置三个生物学重复（独立培养），每个重复三个技术重复，确保统计稳定性。
2.6 钙荧光白（CFW）染色
挑取单菌落接种于15 mL YPD培养基，30°C、200 rpm振荡培养24 h。种子液以10%（v/v）接种量转接至50 mL含250 g/L TFS甘蔗糖蜜培养基，相同条件下培养60 h。细胞染色分析时，收集细胞（1 × 10⁷ cells/mL）经离心（5,000 × g，4°C，5 min），用冰预冷磷酸盐缓冲液（PBS；0.01 M，pH 7.4）洗涤两次，重悬于1 mL新鲜PBS中。最后，依次将2 μL细胞悬液、CFW溶液和10%氢氧化钾转移到载玻片上，盖上盖玻片，静置1 min后进行显微镜观察。图像采集与统计分析：每个生物学重复至少随机采集10个视野，使用荧光显微镜400×放大倍数。每个样品至少手动计数300个细胞。与背景相比呈现明亮荧光的细胞计为"CFW阳性"（指示细胞壁损伤）。计算每个视野中CFW阳性细胞百分比。细胞完整性：100% − 明场显微镜下CFW染色细胞计数百分比。完整性（%）= 100 −（% CFW阳性细胞）。数据以三个独立生物学重复的平均值±标准差（SD）表示。组间统计显著性采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey事后检验，p < 0.05视为显著。
2.7 NAD+/NADH含量测定
挑取单菌落接种于15 mL YPD培养基，30°C、200 rpm振荡培养24 h。种子液以10%（v/v）接种量转接至30 mL含250 g/L TFS甘蔗糖蜜培养基，相同条件下培养24 h。收集细胞（5 × 10⁶）经离心（5,000 × g，4°C，5 min），PBS洗涤两次。NAD+/NADH水平使用商业检测试剂盒（#D799201-0050，Sangon Biotech，上海，中国）按说明书操作并略作修改。简要步骤：向细胞沉淀中加入0.5 mL酸性（或碱性）提取缓冲液，冰浴探头超声破碎（20%振幅或200 W输出，2 s脉冲/1 s间隔，共1 min）。裂解液沸水浴5 min，立即冰浴2 min，10,000 × g（4°C，10 min）离心。取200 μL上清液与等体积碱性（或酸性）缓冲液混合中和，涡旋30 s，相同条件下再次离心。所得上清液冰上保存，立即进行分光光度分析。测定前，分光光度计预热30 min，以蒸馏水为空白对照在570 nm校准。反应混合物按试剂盒说明书规定的加样方案在预冷的1.5 mL琥珀色微量离心管中配制。
2.8 搅拌罐发酵
种子培养物……（原文截断）
【数据】菌株：酿酒酵母BY4742、GJ08、NGTM-F1；质粒：pRS415-Cas9-VPR-NrsR、pRS423-TyrSgH-KanMX、Yep352-KanMX、pRS42H-pADH1-PAL2-tADH1；抗生素浓度：NrsR 50 µg/mL、G418 150 µg/mL；培养基：YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）、250 g/L TFS甘蔗糖蜜+0.2%尿素；温度：30°C；转速：200 rpm；时间：24 h、60 h；接种量：10%（v/v）；gRNA靶向序列：14 bp；CRISPRa靶区：上游250–400 bp；CRISPRi靶区：下游50–150 bp；离心条件：5,000 × g、4°C、5 min；RNA纯度标准：A260/A230 > 2.0、A260/A280 > 1.8；qPCR条件：95°C 2 min，40循环（95°C 10 s、60°C 20 s）；cDNA模板：10–100 ng/μL；CFW染色细胞数：1 × 10⁷ cells/mL、≥300细胞/样品、400×放大；NAD+/NADH检测细胞数：5 × 10⁶；超声参数：20%振幅或200 W、2 s脉冲/1 s间隔、1 min；离心：10,000 × g、4°C、10 min；检测波长：570 nm
研究结果
3.1 突变基因筛选
基于K⁺和Ca²⁺共存是HCSM发酵关键胁迫因子的发现，研究团队寻求鉴定该响应的遗传介导因子。与相同发酵条件下的野生菌株酿酒酵母GJ08相比，酿酒酵母NGTM-F1呈现1920个差异表达基因（DEGs），其中795个上调、1125个下调（图S1）。同样，酿酒酵母NGK+&Ca2+-F1呈现215个DEGs，其中77个上调、138个下调。全基因组比较显示，酿酒酵母NGK+&Ca2+-F1与NGTM-F1共享240个共同突变基因（表S1）。鉴于K⁺和Ca²⁺共存是主要限制因素，其诱导的转录变化可能存在重叠。最终鉴定出30个兼具共享突变与一致转录变化的基因，其中8个上调、22个下调（表S3）。
3.2 突变基因的功能验证
Dong等人基于具有核酸酶活性的Cas9-VPR融合蛋白开发了CRISPR-VPR系统，用于酿酒酵母的转录激活（CRISPRa）、转录抑制（CRISPRi）和基因组编辑（CRISPRe）。Cas9-VPR系统由截短的14 nt gRNA引导，通过靶向转录起始位点上游或下游特定区域实现转录激活或抑制。为验证功能基因，使用pRS415-Cas9-VPR-NrsR和pRS423-TyrSgH-KanMX。选择实验室菌株酿酒酵母BY4742进行初步CRISPRa/i筛选，因其遗传背景明确、转化效率高、生长表型稳定。这些特征对于最小化实验变异、确保大规模遗传筛选的稳健性至关重要。酿酒酵母BY4742中发现的基本遗传原理与调控机制预计在工业相关菌株中高度保守，为后续验证提供关键基础。研究首先将该CRISPR-VPR系统应用于模式菌株酿酒酵母BY4742，激活和抑制靶基因以考察其对生长和乙醇生产的影响。共选取8个转录水平较高的上调基因进行CRISPRa激活，生长和乙醇产量与携带无gRNA空载体pRS415-Cas9-VPR-NrsR和pRS423-TyrSgH-KanMX的对照菌株酿酒酵母BY4742比较。阳性结果汇总于表1。如表1所示，NCA3、PIR3、SPI1、TIP1和GEX2的激活同时增强了细胞生长和乙醇产量。SPI1编码糖基磷脂酰肌醇锚定细胞壁蛋白，与酵母对除草剂、裂解酶及某些食品防腐剂的抗性相关。PIR3编码O-糖基化细胞壁蛋白，与胁迫条件下的细胞壁完整性和重塑有关。NCA3调控Atp6p和Atp8p的合成，参与不同培养基中的能量代谢及有毒物质抗性。Tip1p是主要细胞壁甘露糖蛋白，对维持细胞壁完整性至关重要。GEX2作为酵母谷胱甘肽交换器，影响pH和氧化还原稳态。然而，此前研究未报道这些基因能增强酿酒酵母对高浓度糖蜜的耐受性。全部22个下调基因均被选为CRISPRi抑制靶点，结果见表2。仅抑制6个基因导致乙醇产量增加。其中，AQR1编码负责氨基酸外排的内膜转运蛋白。GUT2编码线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，可能与辅酶平衡相关。TIR1是静态培养酵母细胞的主要结构细胞壁蛋白。FLO5和FLO10与酵母细胞絮凝相关，可能解释观察到的酵母细胞分散现象。DIT2编码P450家族蛋白，介导孢子形成过程中双甲酰二酪氨酸分子的交联。由于酿酒酵母NGTM-F1的表型归因于这些基因的完全突变，研究进一步考察多基因效应。激活方面，选取对生长促进效果最显著的SPI1和PIR3基因。SPI1与PIR3同时激活使生长提升20%，乙醇产量增加30%。抑制方面，选取对乙醇产量影响最显著的AQR1和GUT2基因。AQR1与GUT2同时抑制使乙醇产量进一步增加80%，但细胞生长未变化。这些发现进一步证明酿酒酵母NGTM-F1的表型由基因突变引起。
3.3 机制分析
关键基因座位的功能探索对工程菌改造具有重要意义。因此，研究考察了SPI1、PIR3、AQR1和GUT2的作用。野生菌株酿酒酵母GJ08在250 g/L TFS甘蔗糖蜜条件下过表达PIR3，细胞变为圆形且尺寸增大至6.6–8.6 µm。同样条件下，GJ08过表达SPI1未显著改变细胞大小，但明显增加细胞数量。相比之下，对照菌株GJ08在高浓度糖蜜环境中出现细胞裂解和黏附（图S2）。鉴于SPI1和PIR3均与细胞壁功能相关，推测它们可能发挥保护作用。为进一步验证，采用钙荧光白（CFW）染色——一种通过氢键与细胞壁中几丁质和多糖结合的荧光染料。完整细胞壁对CFW染色不敏感，而受损细胞壁更易被染色。如图S3和图S4所示，野生型酿酒酵母GJ08在250 g/L TFS甘蔗糖蜜条件下细胞壁完整性严重受损。定量分析显示，过表达PIR3或SPI1均使细胞壁完整性显著增强约60%。野生型菌株GJ08在250 g/L TFS甘蔗糖蜜条件下抑制AQR1和GUT2未引起可观察的细胞形态变化（数据未显示），但显著影响代谢通路（图S5）。如图1所示，红色箭头表示AQR1抑制下转录上调的基因，蓝色箭头表示GUT2抑制下转录上调的基因。该图表明，AQR1或GUT2抑制显著增强糖酵解至乙醇生产的代谢流。GUT2编码甘油-3-磷酸脱氢酶，氧化NADH再生NAD⁺。抑制GUT2催化步骤（消耗NAD⁺并产生NADH）将导致甘油-3-磷酸（G3P）积累。G3P积累可能驱动胞质甘油-3-磷酸脱氢酶催化的还原方向反应，消耗NADH并再生NAD⁺。这形成底物驱动的循环，有效增加总NAD(H)池并扰动NADH/NAD⁺比值。细胞必须采用替代策略（如增强发酵途径）来重新平衡氧化还原状态。
【数据】DEGs数量：NGTM-F1为1920个（795上调/1125下调），NGK+&Ca2+-F1为215个（77上调/138下调）；共享突变基因：240个；交集基因：30个（8上调/22下调）；SPI1+PIR3共激活：生长+20%、乙醇+30%；AQR1+GUT2共抑制：乙醇+80%、生长不变；PIR3过表达细胞尺寸：6.6–8.6 µm；细胞壁完整性提升：约60%
讨论与解读
本研究通过多组学联合CRISPR-VPR筛选策略，系统鉴定了酿酒酵母在高浓度甘蔗糖蜜胁迫下的关键耐受基因。PIR3与SPI1作为细胞壁相关蛋白，通过维持细胞壁完整性赋予菌株胁迫耐受性；AQR1与GUT2则通过代谢重编程将碳流导向乙醇合成。值得注意的是，GUT2抑制引发的NADH/NAD⁺再平衡机制为 redox 调控提供了新视角。该策略的普适性在肉桂酸合成增强中得到验证，表明这些遗传靶点具有广谱应用价值。工程菌株在5-L发酵罐中达到113.3 g/L乙醇产量，媲美工业菌株，展示了从实验室发现到工业放大的转化潜力。
编译者解读：本研究的方法论亮点在于将多组学筛选与CRISPRa/i功能验证无缝衔接，形成"发现-验证-机制-应用"的完整闭环。选择细胞壁完整性而非传统代谢工程靶点，体现了对工业发酵中复合胁迫（离子毒性、渗透压、氧化应激）的深刻理解。PIR3/SPI1与AQR1/GUT2的功能互补策略——一个"加固防线"、一个"疏通管道"——为工业酵母菌株设计提供了可推广的范式。局限在于机制解析仍以转录与辅酶水平为主，蛋白互作网络与细胞壁超微结构变化尚待深入。
参考来源
Wang, W.-Y. Engineering stress tolerance in Saccharomyces cerevisiae by overexpressing PIR3 and SPI1 for efficient ethanol production from high-concentration sugarcane molasses. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134191
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134191