破解酵母中衣康酸合成路径的动态机制

📅 2026-08-31 📰 Metabolic Engineering 2026-03-31 📂 研究进展 👁 13

来源：Elucidating the itaconic acid pathway dynamics in Saccharomyces cerevisiae（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：代谢通路设计

导读

衣康酸是一种重要的生物基平台化合物，广泛应用于聚合物、树脂和生物材料领域。本研究系统比较了土曲霉和玉米黑粉菌两条衣康酸生物合成路径在酿酒酵母中的表现，发现玉米黑粉菌的代谢路径与线粒体转运机制组合效率最高。通过计算机模拟确认了Aqr1p、Dtr1p和Qdr3p在衣康酸转运中的作用，并将通用转运蛋白Dtr1p替换为玉米黑粉菌特异性转运蛋白Itp1后，摇瓶产量达1.3 g/L，3.8 L生物反应器中最终效价达4.7 g/L，创下酿酒酵母衣康酸产量的最高纪录。

研究背景

衣康酸是一种不饱和二元羧酸，作为功能性（共）聚合物的（共）单体被广泛使用。作为可再生微生物发酵的产物，它为石油基丙烯酸和甲基丙烯酸提供了可持续替代方案，具备可生物降解性和更低的环境影响。衣康酸在塑料、树脂、粘合剂、涂料、高吸水性材料、合成乳胶及生物活性化合物递送基质等领域具有广泛的工业应用价值。此外，其潜在的抗菌和抗炎特性还拓展了医学领域的应用前景。这些特征使衣康酸被列为生物质来源的12种高附加值产品之一，预计到2031年市场规模将达1.78亿美元，2024年至2031年复合年增长率为6.80%。自20世纪50年代以来，利用土曲霉的代谢能力进行微生物发酵一直是衣康酸的大规模生产途径。

尽管曲霉属和黑粉菌属真菌是衣康酸的主要生产者，但将酿酒酵母和解脂耶氏酵母等酵母菌株重编程为替代生产平台，具有快速生长、遗传工具可及性好和发酵方法成熟等工业生物生产优势。本研究系统探究了衣康酸在酿酒酵母中的路径动态，以期提升异源生产效率。

研究方法

2.1 分子克隆

采用NEB® 5-α感受态大肠杆菌（New England Biolabs，美国马萨诸塞州）进行重组质粒扩增。细菌培养使用LB肉汤或LB琼脂平板，温度37°C。根据需要添加氨苄青霉素，终浓度为100 μg/mL。pUCIDT-Amp-Goldengate载体（Integrated DNA Technologies，美国爱荷华州）作为酿酒酵母表达质粒设计的模板（表S1）。一般而言，这些质粒包含一个强组成型启动子-终止子组合，控制目标基因编码序列（CDS）的表达（表S1）。这些基因的上下游侧翼为500 bp同源臂，与目标位点（具体为ARS308、HO、CAN1、AQR1、DTR1、QDR1、QDR3和YPRCdelta15）（表S1）一致，同源臂通过PCR扩增酿酒酵母Cen.PK113-7D基因组DNA获得。TDH3（pTDH3）和TEF1（pTEF1）启动子以及TEF2（tTEF2）、SPO1（tSPO1）、DIT1（tDIT1）和GAT2（tGAT2）终止子（表S1）通过PCR扩增酿酒酵母Cen.PK113-7D基因组DNA获得。来源于玉米黑粉菌的酿酒酵母密码子优化开放阅读框——Itp1（GenBank：ALS30797.1）、Mtt1（GenBank：KT852988.1）、Adi1（GenBank：ALS30798.1）和Tad1（GenBank：ALS30796.1），以及来源于土曲霉的CadA（GenBank：AWM95822.1）和MttA（GenBank：HG423568.1和MK026068.1）基因——均作为gBlocks从IDT（Integrated DNA Technologies，美国爱荷华州）购买（表S2）。这些DNA片段采用体内DNA组装方法进行组装（Watson and Garcia-Nafria, 2019）。每个DNA片段与上下游相邻部分具有20 bp同源性，通过热激导入感受态大肠杆菌菌株。使用侧翼插入区域的引物通过菌落PCR筛选转化菌落（表S3）。阳性扩增菌落的质粒回收使用Monarch® Plasmid Miniprep Kit（New England Biolabs，美国马萨诸塞州）。序列完整性通过Sanger测序验证（Eurofins Genomics，德国）。上述表达 cassette 在酿酒酵母中的基因组整合借助所谓的CRISPR质粒（表S1）实现。这些质粒源自pV1382载体（Gerald Fink惠赠，Addgene质粒#111436；http://n2t.net/addgene:111436；RRID：Addgene_111436）（Vyas et al., 2018），维持组成型表达的spCas9核酸酶和sgRNA转录机制。使用BsmBI限制酶（New England Biolabs，美国马萨诸塞州）和虾碱性磷酸酶（New England Biolabs，美国马萨诸塞州）线性化pV1382构建体后，使用T4 DNA连接酶连接保持目标20 bp sgRNA序列的5′-磷酸化杂交DNA引物。sgRNA序列（表S1）使用CRISPOR确定（Concordet and Haeussler, 2018）。

【数据】菌株：NEB® 5-α感受态大肠杆菌；温度：37°C；抗生素浓度：氨苄青霉素100 μg/mL；同源臂长度：500 bp；同源臂序列：20 bp；sgRNA长度：20 bp

2.2 菌株开发

实验室菌株酿酒酵母CEN.PK113-7D（MATa），即野生型，通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑改造为产衣康酸菌株（Eerlings et al., 2024）。预培养时，挑取单菌落接种于3 mL YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖）中，30°C、200 rpm振荡过夜培养。将所得培养物调整至OD600为0.1，接种于50 mL 2×YPAD培养基（20 g/L酵母提取物、40 g/L蛋白胨、80 mg/L腺嘌呤半硫酸盐、40 g/L葡萄糖）中，在相同条件下培养3–5小时至细胞达到对数生长期。对数期细胞通过离心（5000 g，5分钟）收集，并依次进行两次洗涤：先用10 mL无菌去离子水去除残留培养基，再用5 mL 0.1 M醋酸锂（LiOAc）增强转化感受态。沉淀重悬于100 μL LiOAc（0.1 M）中，室温平衡10分钟后分装为20 μL等份。转化时，每等份与1 μg靶向目标基因组位点的CRISPR质粒、5–10 μg携带异源目标基因的线性化表达cassette、40 μg变性单链载体DNA和750 μL PL溶液（42% PEG 3350，120 mM LiOAc）混合。混合物在30°C孵育30分钟，随后42°C热激20分钟促进DNA摄取。热激后，细胞离心沉淀，重悬于CaCl₂×2H₂O（5 mM）中，室温孵育5分钟。随后用YPD培养基洗涤两次，涂布于YPD琼脂平板，30°C过夜培养。转化子通过影印接种至补充有遗传霉素（200 mg/L，Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄）、潮霉素（300 mg/L，Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄）或诺尔丝菌素（100 mg/L，Jena Bioscience，德国耶拿）的YPD琼脂平板，具体取决于CRISPR质粒的抗生素抗性标记。平板在30°C孵育48–72小时。使用侧翼插入位点的引物通过菌落PCR筛选转化子，并通过DNA测序确认。所有菌株和构建体均可应要求提供。

【数据】培养基：YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）；2×YPAD（20 g/L酵母提取物、40 g/L蛋白胨、80 mg/L腺嘌呤半硫酸盐、40 g/L葡萄糖）；温度：30°C；转速：200 rpm；OD600：0.1；离心：5000 g，5 min；LiOAc浓度：0.1 M；转化DNA量：CRISPR质粒1 μg、线性化cassette 5–10 μg、载体DNA 40 μg；PL溶液：42% PEG 3350、120 mM LiOAc；孵育：30°C 30 min；热激：42°C 20 min；CaCl₂浓度：5 mM；抗生素浓度：遗传霉素200 mg/L、潮霉素300 mg/L、诺尔丝菌素100 mg/L；孵育时间：48–72 h

2.3 酵母生长的定量分析

通过连续生长监测评估异源基因添加对酵母整体稳态的影响。野生型酵母和转化子在补充20 g/L葡萄糖的Verduyn培养基或SCD培养基中培养。预培养物在30°C、200 rpm振荡过夜。从这些预培养物中，以OD600为0.1的密度接种于无菌、透明底96孔白色微量滴定板中，每孔工作体积300 μL，使用Growth Profiler 960（Enzyscreen，荷兰海姆斯泰德）监测生长。使用无菌透气三明治盖减少蒸发。细胞增殖监测在30°C下进行，轨道振荡250 rpm，每30分钟数字成像一次，总周期24小时。使用GP960 Analysis Suite分析图像，提供绿色值作为生物量密度的代理指标。绿色值通过校准曲线转换为OD600。每个菌株的最大生长速率（μmax）使用QurvE确定（Wirth et al., 2023）。

【数据】培养基：Verduyn或SCD（补充20 g/L葡萄糖）；温度：30°C；转速：200 rpm（预培养）/250 rpm（监测）；OD600：0.1；工作体积：300 μL/孔；成像间隔：30 min；总监测时间：24 h；分析软件：GP960 Analysis Suite、QurvE

2.4 酵母培养生产衣康酸

目标酿酒酵母菌株（表1和图S1）在Verduyn（Verduyn et al., 1992）或合成完全（SCD）培养基中培养以评估衣康酸产量。SCD培养基由6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮碱基、补充2 g/L Complete Supplement Mixture（MP Biomedicals，美国加利福尼亚州）和20 g/L葡萄糖组成。除缓冲SCD培养基外，pH调至5.4。Verduyn培养基每升含有5.0 g (NH₄)₂SO₄、3.0 g KH₂PO₄、0.5 g MgSO₄×7H₂O、20 g葡萄糖、10 mL微量元素溶液（100×）和1 mL微量维生素溶液（1000×）。微量元素溶液（100×）每升含有1.50 g Na₂EDTA×2H₂O、0.45 g ZnSO₄×7H₂O、0.10 g MnCl₂×2H₂O、0.03 g CoCl₂×6H₂O、0.03 g CuSO₄×5H₂O、0.04 g Na₂MoO₄×2H₂O、0.45 g CaCl₂×2H₂O、0.30 g FeSO₄×7H₂O、0.10 g H₃BO₃和0.01 g KI。微量维生素溶液（1000×）每升含有0.05 g D-生物素、1.00 g Ca-D-泛酸钙、1.00 g烟酸、25.00 g肌醇、1.00 g盐酸硫胺素、1.00 g盐酸吡哆醇、0.20 g对氨基苯甲酸。除缓冲Verduyn培养基外，pH调至5.0。对于缓冲SCD和Verduyn培养基，pH校准至6.0，不添加或添加100 mM邻苯二甲酸氢钾（KHP）或100 mM邻苯二甲酸钾。酵母预培养通过将单菌落接种于3 mL相应SCD或Verduyn培养基中，30°C、200 rpm振荡过夜制备。从过夜培养物中，酵母细胞稀释至目标密度进行后续培养。

▲ Construction and comparison of the itaconic acid biosynthesis pathways of Aspergillus terreus (blue) and Ustilago maydis (beige) in Saccharomyces cerevisiae (green). Starting from glucose, glycolysis leads to the generation of pyruvate, which is either transported into the mitochondria for conversio

【数据】SCD培养基成分：6.7 g/L酵母氮碱基、2 g/L Complete Supplement Mixture、20 g/L葡萄糖；pH：5.4（SCD）/5.0（Verduyn）；缓冲培养基pH：6.0；缓冲剂：100 mM KHP或100 mM邻苯二甲酸钾；Verduyn培养基成分：(NH₄)₂SO₄ 5.0 g/L、KH₂PO₄ 3.0 g/L、MgSO₄×7H₂O 0.5 g/L、葡萄糖20 g/L；微量元素溶液（100×）：Na₂EDTA×2H₂O 1.50 g/L、ZnSO₄×7H₂O 0.45 g/L、MnCl₂×2H₂O 0.10 g/L、CoCl₂×6H₂O 0.03 g/L、CuSO₄×5H₂O 0.03 g/L、Na₂MoO₄×2H₂O 0.04 g/L、CaCl₂×2H₂O 0.45 g/L、FeSO₄×7H₂O 0.30 g/L、H₃BO₃ 0.10 g/L、KI 0.01 g/L；微量维生素溶液（1000×）：D-生物素0.05 g/L、Ca-D-泛酸钙1.00 g/L、烟酸1.00 g/L、肌醇25.00 g/L、盐酸硫胺素1.00 g/L、盐酸吡哆醇1.00 g/L、对氨基苯甲酸0.20 g/L；预培养条件：30°C、200 rpm过夜

研究结果

3.1 酿酒酵母中衣康酸的异源生物合成

两条已充分表征的真菌衣康酸生物合成路径均以顺式乌头酸为起点（图1），在构建最高效的衣康酸生产酿酒酵母细胞工厂时，有必要进行直接比较。为此，将相应真菌衣康酸生物合成路径的酿酒酵母密码子优化基因导入CEN.PK 113-7D（野生型）酵母菌株。引入土曲霉顺式乌头酸脱羧酶（CadA）可实现顺式乌头酸一步脱羧生成衣康酸，获得ITA1菌株。同时，玉米黑粉菌通过反式乌头酸作为中间体的两步衣康酸合成路径，由乌头酸-Δ-异构酶1（Adi1）和反式乌头酸脱羧酶1（Tad1）介导，构建ITA2菌株（表1和图S1）。ITA1和ITA2菌株的衣康酸产量在SCD和Verduyn培养基中通过每日取样监测至72小时。通过将ITA1和ITA2菌株分为沉淀和上清液两部分，确定衣康酸的主要定位（图2和图S2）。在Verduyn培养基中培养72小时后，ITA1和ITA2上清液中的效价分别为8 mg/L和17 mg/L，而每个沉淀中为1 mg/L。类似地，在SCD培养基中培养72小时后，上清液中的效价达到34 mg/L（ITA1）和35 mg/L（ITA2），而相应的沉淀部分各含2 mg/L。这些结果表明，衣康酸主要分泌到两种菌株和两种培养基的上清液中，在SCD培养基中获得最高效价。尽管ITA1和ITA2在SCD培养基中的衣康酸效价差异极小，但在Verduyn培养基中培养时差异显著（图2）。总体而言，在Verduyn培养基中培养时，ITA2产生的衣康酸是ITA1的2倍。

▲ Comparison of the native itaconic acid biosynthetic routes from U. maydis and A. terreus in S. cerevisiae. Direct comparison of the itaconic acid formed using the A. terreus (CadA, blue) or the U. maydis (Tad1 and Adi1, beige) biosynthesis routes after 72 h in synthetic complete (SCD) or Verduyn sup

【数据】ITA1（Verduyn上清液）：8 mg/L；ITA2（Verduyn上清液）：17 mg/L；ITA1（Verduyn沉淀）：1 mg/L；ITA2（Verduyn沉淀）：1 mg/L；ITA1（SCD上清液）：34 mg/L；ITA2（SCD上清液）：35 mg/L；ITA1（SCD沉淀）：2 mg/L；ITA2（SCD沉淀）：2 mg/L；培养时间：72 h；倍数差异：2倍

3.2 真菌线粒体转运蛋白对衣康酸生产的影响

对真菌衣康酸代谢路径的深入认识强调了线粒体反向转运蛋白在增强衣康酸生物合成中的重要性。将玉米黑粉菌或土曲霉的线粒体转运蛋白（分别为Mtt1和MttA）引入ITA1和ITA2，提高了其相应的衣康酸生产能力。有趣的是，遇到了两个非同义MttA变体，它们在研究中被同等引用和互换使用，但存在八个氨基酸残基的差异。为进行衣康酸生物合成的合理比较，将标记为MttA1（GenBank：HG423568.1）（van der Straat et al., 2013）和MttA2（GenBank：MK026068.1）（Zhao et al., 2019）的两个变体以及Mtt1（GenBank：KT852988.1）均进行酿酒酵母密码子优化，并平行整合到ITA1和ITA2中，生成ITA3至ITA8（表1和图S1）。总体而言，添加线粒体转运蛋白增强了衣康酸生物合成，无论其来源、代谢路径或生长培养基如何（图3和图S3）。ITA3和ITA4菌株分别由ITA1整合MttA1和MttA2衍生而来，在Verduyn培养基中72小时内将衣康酸产量从亲本菌株的8 mg/L显著提高至14 mg/L和19 mg/L。将玉米黑粉菌线粒体转运蛋白Mtt1引入ITA1菌株，构建了ITA5菌株。在Verduyn培养基中培养ITA5，产量增加了4倍以上，达到36 mg/L。在ITA1背景下添加线粒体转运蛋白对沉淀部分也观察到类似的正效应，衣康酸效价从ITA1菌株的1 mg/L上升至ITA3菌株的2 mg/L和ITA5菌株的4 mg/L。ITA4菌株仅温和增加至1 mg/L，表明该背景下转运蛋白影响有限。在ITA2背景下整合线粒体转运蛋白时观察到类似结果。在ITA2菌株中整合土曲霉线粒体转运蛋白MttA1和MttA2，产生ITA6和ITA7菌株，在Verduyn培养基中培养72小时后，上清液中的衣康酸产量提高至24 mg/L和39 mg/L。值得注意的是，将玉米黑粉菌线粒体转运蛋白Mtt1整合到ITA2背景菌株中，构建ITA8菌株，在Verduyn培养基中培养时衣康酸产量增加了5倍以上，上清液中最高浓度达86 mg/L。ITA6、ITA7和ITA8菌株的沉淀部分观察到更显著的增加，衣康酸效价分别为2 mg/L、7 mg/L和8 mg/L。虽然在SCD培养基中培养这些转化子72小时时趋势相似，但衣康酸效价显著更高（图S3）。在ITA1背景下，整合线粒体转运蛋白后，ITA3、ITA4和ITA5菌株的上清液效价分别为39 mg/L、52 mg/L和82 mg/L。相应的沉淀部分效价为5 mg/L、6 mg/L和7 mg/L。在SCD培养基中培养来源于ITA2菌株的ITA6、ITA7和ITA8菌株72小时时，观察到类似的模式。从沉淀部分提取衣康酸分别获得2 mg/L、6 mg/L和13 mg/L，而上清液效价为43 mg/L、71 mg/L和110 mg/L。综合来看，这些观察结果表明，由线粒体转运蛋白Mtt1和两步生物合成级联组成的玉米黑粉菌整体代谢网络，可构建最有效的酿酒酵母衣康酸生产菌株。

▲ The introduction of mitochondrial transporters drastically improves itaconic acid production in S. cerevisiae. Itaconic acid titers in supernatant (top) and pellet (bottom) were obtained upon cultivation in Verduyn medium for 72 h. The checkmark indicates the presence of biosynthetic enzymes or mito

【数据】ITA3（Verduyn上清液）：14 mg/L；ITA4：19 mg/L；ITA5：36 mg/L（4倍以上）；ITA1背景沉淀：ITA1 1 mg/L、ITA3 2 mg/L、ITA4 1 mg/L、ITA5 4 mg/L；ITA6（Verduyn上清液）：24 mg/L；ITA7：39 mg/L；ITA8：86 mg/L（5倍以上）；ITA6/7/8沉淀：2/7/8 mg/L；SCD上清液：ITA3 39 mg/L、ITA4 52 mg/L、ITA5 82 mg/L；SCD沉淀：ITA3/4/5 5/6/7 mg/L；SCD上清液：ITA6 43 mg/L、ITA7 71 mg/L、ITA8 110 mg/L；SCD沉淀：ITA6/7/8 2/6/13 mg/L；培养时间：72 h

3.3 研究天然酿酒酵母膜转运蛋白的通用衣康酸分泌潜力

尽管酵母中不存在天然的衣康酸质膜转运蛋白，但衣康酸主要检测于上清液中，提示存在通用膜转运蛋白。Wierckx等人的研究假设酿酒酵母的Qdr1p、Qdr3p和Dtr1p是玉米黑粉菌衣康酸转运蛋白1（Itp1）和土曲霉主要促进子超家族蛋白（MfsA）的最接近同源物（Wierckx et al., 2020）。值得注意的是，Qdr1p有一个旁系同源物Aqr1p，起源于全基因组复制。鉴于其序列相似性，Aqr1p也可能作为通用的衣康酸转运蛋白。为评估它们在衣康酸转运中的潜在作用，在ITA8菌株中分别引入AQR1、DTR1、QDR1和QDR3的单独缺失，产生ITA9、ITA10、ITA11和ITA12菌株，每个菌株分别缺失其中一个基因（表1和图S1）。这些转化子在Verduyn培养基中培养72小时。除dtr1Δ null突变体（即DTR1基因缺失突变体）外，在Verduyn培养基中培养时，所提出的候选基因均未显著影响ITA8背景菌株的衣康酸分泌（图4A）。ITA9、ITA10、ITA11和ITA12菌株上清液中的相应衣康酸效价分别达到92 mg/L、23 mg/L、87 mg/L和66 mg/L。虽然在Verduyn培养基中仅dtr1Δ null突变体表现出统计学显著变化，但在SCD培养基中培养ITA9、ITA10、ITA11和ITA12菌株分别获得172 mg/L、39 mg/L、140 mg/L和97 mg/L，揭示aqr1Δ、dtr1Δ和qdr3Δ的衣康酸效价存在显著差异。这些发现表明，在SCD培养基中培养时，该膜转运蛋白子集中的Dtr1p、Aqr1p和Qdr3p参与了酿酒酵母中的衣康酸转运。比较从ITA9、ITA10、ITA11和ITA12菌株组沉淀部分提取的衣康酸浓度，在Verduyn或SCD培养基中培养时未观察到效价的显著变化（图S4）。72小时培养后，沉淀相关效价为8 mg/L、4 mg/L、7 mg/L。

▲ Landscaping plasma membrane transporters to characterize itaconic acid export mechanism in S. cerevisiae. (A) Deletion strains derived from the ITA8 strain with a deletion of AQR1, DTR1, QDR1, or QDR3 were used to assess itaconic acid titers in the supernatant. (B) The addition of the U. maydis itac

【数据】ITA9（Verduyn上清液）：92 mg/L；ITA10：23 mg/L；ITA11：87 mg/L；ITA12：66 mg/L；SCD上清液：ITA9 172 mg/L、ITA10 39 mg/L、ITA11 140 mg/L、ITA12 97 mg/L；沉淀效价（72 h）：8/4/7 mg/L；统计学显著性：Verduyn中仅dtr1Δ显著，SCD中aqr1Δ、dtr1Δ和qdr3Δ显著

3.4 质膜转运蛋白改造与Itp1的功能验证

鉴于Dtr1p被鉴定为主要的通用衣康酸转运蛋白，研究进一步探索了用玉米黑粉菌特异性衣康酸转运蛋白Itp1替换Dtr1p的效果。通过计算机模拟方法，确认了Aqr1p、Dtr1p和Qdr3p在酿酒酵母衣康酸转运中的作用。将ITA8菌株中的DTR1基因替换为玉米黑粉菌的Itp1转运蛋白，构建了ITA13菌株。在摇瓶培养中，ITA13菌株的衣康酸产量达到1.3 g/L，显著高于ITA8菌株。这一结果表明，用特异性转运蛋白替换通用转运蛋白可大幅提升衣康酸的分泌效率。

▲ pH buffering capacity alters itaconic acid product formation in S. cerevisiae. Cultivation of the ITA8 and ITA13 strains was carried out for 72 h in Verduyn medium (A) or SCD medium (B) supplemented with 20 g/L glucose at pH 5, pH 6, and pH 6 in the presence of 100 mM potassium chloride (KCl) or pot

【数据】ITA13摇瓶产量：1.3 g/L；培养时间：72 h

3.5 pH缓冲能力对衣康酸产物形成的影响

在不同pH条件下评估了ITA8和ITA13菌株的衣康酸生产能力。在Verduyn培养基（图5A）或SCD培养基（图5B）中，补充20 g/L葡萄糖，在pH 5、pH 6以及pH 6存在100 mM氯化钾（KCl）或邻苯二甲酸盐缓冲液的条件下培养72小时。结果显示，pH条件显著影响衣康酸的产量和分泌模式。缓冲能力的变化改变了衣康酸的产物形成，表明培养基的pH调控对优化衣康酸生产至关重要。

▲ 指数补料分批培养突出了酿酒酵母中生长耦合的衣康酸生产。将酿酒酵母产衣康酸菌株（ITA8和ITA13）在改良合成Verduyn培养基中进行好氧、葡萄糖限制的指数补料分批培养。指数补料分批发酵

【数据】pH条件：pH 5、pH 6、pH 6+100 mM KCl或邻苯二甲酸盐；葡萄糖浓度：20 g/L；培养时间：72 h

3.6 指数补料分批发酵揭示生长偶联的衣康酸生产

将ITA8和ITA13菌株在改良合成Verduyn培养基中进行好氧、葡萄糖限制的指数补料分批发酵。指数补料分批发酵揭示了衣康酸生产与酵母生长之间的偶联关系。ITA13菌株在3.8 L生物反应器发酵中最终效价达到4.7 g/L，这是迄今报道的酿酒酵母中最高衣康酸效价。

Elucidating the itaconic acid pathway dynamics in Saccharomy — ▲ 论文配图

【数据】ITA13生物反应器最终效价：4.7 g/L；反应器体积：3.8 L；发酵模式：好氧、葡萄糖限制指数补料分批

讨论与解读

本研究比较了来源于土曲霉和玉米黑粉菌的两条衣康酸代谢路径在酿酒酵母中的异源表达。尽管土曲霉顺式乌头酸脱羧酶（CadA）以单步方式将胞质顺式乌头酸代谢为衣康酸，但玉米黑粉菌通过反式乌头酸中间体的两步异构化和随后的脱羧反应，在Verduyn培养基中上清液衣康酸最终效价高出2倍。这种性能差异可归因于多个因素：酶性能依赖于温度、表达水平、酶动力学、蛋白质稳定性和密码子使用等多种因素。由于两条路径均已密码子优化、稳定整合于基因组并共享启动子-终止子组合，温度和酶动力学及稳定性成为决定性因素。土曲霉通常在37°C下培养，其酶在该条件下可能具有最佳活性，而玉米黑粉菌和酿酒酵母需要较低温度（30°C）进行正常生长。这种温度变化将影响酶动力学、蛋白质折叠和稳定性，从而影响其催化效率。

线粒体转运蛋白的引入显著增强了衣康酸生物合成，其中玉米黑粉菌的Mtt1效果最佳。将通用转运蛋白Dtr1p替换为特异性转运蛋白Itp1后，摇瓶产量从86 mg/L提升至1.3 g/L，3.8 L生物反应器中达4.7 g/L。尽管目前酵母产量仍低于天然真菌生产者，但本研究获得的分子和机制层面的见解对于改进酵母和现有真菌生产系统中的衣康酸生物合成均具有重要价值。

【编译者解读】本研究通过系统的路径比较与转运工程策略，揭示了酿酒酵母中衣康酸合成的关键瓶颈在于线粒体转运而非生物合成本身。将通用转运蛋白替换为特异性转运蛋白的策略尤为巧妙——不增加代谢通量，仅优化分泌环节即使产量提升15倍以上。这提示在异源宿主中，转运工程往往比代谢通量工程更具杠杆效应。不过，4.7 g/L的产量与天然土曲霉的工业水平仍有数量级差距，线粒体内部衣康酸的积累对细胞毒性的影响、以及Itp1的转运动力学机制，仍是未来优化的关键靶点。

参考来源

Eerlings R. Elucidating the itaconic acid pathway dynamics in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2025.11.010

DOI: 10.1016/j.ymben.2025.11.010

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