来源：CRISPRi allows optimal temporal control of N-acetylglucosamine bioproduction by a dynamic coordination of glucose and xylose metabolism in Bacillus subtilis（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
葡萄糖和木糖是木质纤维素中最丰富的两种糖，但碳代谢物阻遏效应使微生物难以同时利用二者。本研究在枯草芽孢杆菌中构建了木糖诱导的CRISPRi基因抑制系统，通过动态下调zwf、pfkA、glmM三个关键基因，同时解除葡萄糖阻遏并将碳流导向N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）合成。最终在3-L发酵罐中实现103.1 g/L的GlcNAc产量，为多碳源协同利用提供了新范式。
研究背景
随着对气候变化的日益关注，越来越多的化学品和材料正在利用可再生生物质资源通过微生物细胞工厂生产。葡萄糖和木糖是可再生的木质纤维素碳源中含量最丰富的两种糖。然而，包括枯草芽孢杆菌在内的大多数微生物，由于碳代谢物阻遏效应（CCR）而无法同时利用这两种糖，这限制了生物质资源的高效转化。
为解决细胞天然代谢调控机制带来的这一问题，研究者对葡萄糖和木糖代谢途径的改造进行了广泛探索。例如，通过灭活大肠杆菌的磷酸转移酶系统（PTS）产生了许多不敏感CCR的突变株。然而，这种修饰会影响葡萄糖的转运和磷酸化，因为PTS是葡萄糖摄取的主要途径。另一种解除葡萄糖对木糖代谢CCR的方法是替换该途径中基因的启动子或引入异源木糖途径。然而，可能需要额外的优化步骤（如进化工程）来进一步平衡葡萄糖和木糖的利用。
研究方法
2.1 菌株与试剂
大肠杆菌JM109用于基因克隆。实验室前期构建的重组GlcNAc合成枯草芽孢杆菌菌株BNY（B. subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔldhΔptaΔglcKΔpckAΔpyk::lox72, ΔnagAB::Pveg-yqaB, Pveg-glmS, pP43-GAN1）作为初始宿主，本研究所用菌株列于表1。LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）用于细菌培养。摇瓶发酵培养基含12 g/L酵母提取物、6 g/L胰蛋白胨、6 g/L (NH4)2SO4、12.5 g/L K2HPO4·3H2O、2.5 g/L KH2PO4、60 g/L葡萄糖和10 mL/L微量元素溶液。微量元素溶液含4 g/L FeSO4·7H2O、4 g/L CaCl2、1 g/L MnSO4·5H2O、0.4 g/L CoCl2·6H2O、0.2 g/L NaMoO4·2H2O、0.2 g/L ZnSO4·7H2O、0.1 g/L AlCl3·6H2O、0.1 g/L CuCl2·H2O和0.05 g/L H3BO4。接种后4 h向发酵液中加入15 g/L木糖以诱导dCas9表达（在诱导条件优化之前）。抗生素使用浓度如下：氨苄青霉素100 μg/mL；卡那霉素50 μg/mL；氯霉素5 μg/mL； zeocin 30 μg/mL；壮观霉素100 μg/mL。
【数据】菌株：E. coli JM109、B. subtilis BNY；培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）；发酵培养基：12 g/L酵母提取物、6 g/L胰蛋白胨、6 g/L (NH4)2SO4、12.5 g/L K2HPO4·3H2O、2.5 g/L KH2PO4、60 g/L葡萄糖、10 mL/L微量元素；木糖：15 g/L（接种后4 h）；抗生素：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素5 μg/mL、zeocin 30 μg/mL、壮观霉素100 μg/mL
2.2 CRISPRi质粒构建
本研究所用引物和质粒分别汇总于补充表S1和S2。为构建dCas9整合表达质粒，首先构建整合表达质粒pLCx。含有pMB1复制起点和aadA抗性盒的质粒骨架使用引物ori-Fe和ori-Ra从pTargetF（Addgene质粒#62226）扩增。lacA基因的两个同源臂分别使用引物lacA'-Fa/lacA'-Rb和'lacA-Fd/'lacA-Re从枯草芽孢杆菌基因组扩增。氯霉素抗性盒使用引物Cm-Fb和Cm-Rc从pHT01扩增，并在该盒两侧引入lox71和lox62位点。木糖诱导启动子PxylA及其阻遏蛋白XylR使用引物PxylA-Fc和PxylA-Rd从pAX01扩增。这五个片段使用ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒（Vazyme，南京，中国）依次组装，该试剂盒通过15–20 bp重叠区促进两个或多个DNA片段的连接。最后，使用引物dCas9-FEco31I和dCas9-RPstI从pdCas9-bacteria（Addgene质粒#44249）扩增的dCas9插入pLCx的BamHI和PstI限制性位点之间，得到pLCx-dCas9。
为构建sgRNA整合表达质粒，首先使用引物psga-R-FEcoRI和psga-R-RHindIII从枯草芽孢杆菌基因组扩增amyE基因的下游同源臂，并插入pTargetF（Addgene质粒#62226）的EcoRI和HindIII限制性位点之间，得到psga0。随后，使用引物psga-L1-FBamHI和psga-L1-RH从枯草芽孢杆菌基因组扩增amyE基因的上游同源臂，并使用引物psga-L2-FH和psga-L2-RBcuI从p7z6扩增zeocin抗性盒，由此引入该盒两侧的lox71和lox62位点及Pveg启动子。这两个片段通过融合PCR组装并插入psga0的BamHI和BcuI限制性位点，得到psga。为实现dCas9和sgRNA的整合表达，pLCx-dCas9和psga经Eco91I线性化后转化至枯草芽孢杆菌，随后通过lox71和lox66重组清除抗性标记盒，方法如前所述（图1A）。pLCx-dCas9和psga的序列见补充材料。这些质粒可在MolecularCloud质粒共享平台获取（目录号：MC_0000614，MC_0000615）。
含有靶向绿色荧光蛋白（GFP）非模板链sgRNA的质粒psga-GFP通过使用引物sg-F和sg-GFP-R对psga进行反向PCR生成，含靶向其他基因sgRNA的质粒构建方法类似。为构建含两个sgRNA的质粒，使用引物psga-liner-F-D和psga-liner-R-A通过PCR线性化psga，并将来自不同sgRNA表达质粒的两个sgRNA表达盒（由Pveg-N20-dCas9 handle-S. py terminator组成）通过Golden Gate组装插入。为构建含三个sgRNA的质粒，使用引物sg-F-A/sg-R-B、sg-F-B/sg-R-C和sg-F-C/sg-R-D扩增sgRNA表达盒，然后通过Golden Gate组装插入线性化质粒（图3B）。已有研究表明，在原核细胞中，只有靶向DNA非模板链的gRNA表现出明显的基因表达抑制。因此，本研究中所有sgRNA均靶向基因的非模板链，并使用sgRNAcas9软件设计。
【数据】质粒构建：pLCx-dCas9（dCas9整合表达）、psga（sgRNA整合表达）；组装方法：ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒（15–20 bp重叠）、融合PCR、Golden Gate组装；限制性位点：BamHI、PstI、EcoRI、HindIII、BcuI、Eco91I；sgRNA设计：靶向非模板链，sgRNAcas9软件
2.3 CRISPRi活性基因报告分析
通过将线性化质粒pLCx-dCas9转化至菌株BNY构建dCas9表达菌株BNX。含有靶向GFP非编码链sgRNA的质粒psga-GFP经线性化后转化至菌株BNX，得到BNX000。将含有强组成型启动子P43控制下GFP的报告质粒pP43-GFP分别转化至BNX和BNX000。使用多功能酶标仪（Cytation 3；BioTek，Winooski，VT，USA）按前述方法测量这两种菌株中GFP的相对荧光强度。
【数据】菌株：BNX（dCas9表达）、BNX000（dCas9 + GFP-sgRNA）；报告质粒：pP43-GFP（P43启动子）；检测仪器：Cytation 3多功能酶标仪
2.4 分析方法
摇瓶发酵在250 mL锥形瓶中进行，含约50 mL发酵培养基，37°C、220 rpm振荡培养48 h。使用配备HPX-87H柱（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）和示差折光检测器的高效液相色谱（HPLC）测定发酵液中GlcNAc、木糖和副产物乙偶姻的浓度。流动相为5 mM H2SO4，流速0.6 mL/min，柱温40°C。培养基中葡萄糖浓度使用葡萄糖-谷氨酸分析仪（SBA-40C；山东科学院生物研究所）测定。接种后每12 h测定OD600，并按以下公式换算为细胞干重（DCW）：1 OD600 = 0.35 g/L DCW。所有实验独立重复至少三次。
【数据】培养条件：250 mL摇瓶、50 mL培养基、37°C、220 rpm、48 h；HPLC条件：HPX-87H柱、5 mM H2SO4、0.6 mL/min、40°C；换算公式：1 OD600 = 0.35 g/L DCW；检测频率：每12 h
2.5 RT-qPCR分析
从摇瓶培养中收集细胞并立即在液氮中冷冻。使用RNAprep Pure Kit（天根生化，北京，中国）按制造商说明书纯化总RNA。使用Nanodrop ND-1000分光光度计（Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）在260和280 nm处通过光密度测量确定RNA的量和纯度。随后，使用PrimeScript™ RT-PCR Kit（Takara，大连，中国）通过总RNA逆转录获得的cDNA作为qPCR模板。qPCR在96孔板中进行，总反应体积约20 µL，使用SYBR Premix Ex Taq™（Takara）按制造商规格操作。反应在LightCycler 480 II实时PCR仪（Roche Applied Science，Mannheim，Germany）上进行。以hbsU基因作为内参。
【数据】RNA提取：RNAprep Pure Kit；逆转录：PrimeScript™ RT-PCR Kit；qPCR：SYBR Premix Ex Taq™，20 µL反应体积，LightCycler 480 II；内参基因：hbsU
2.6 3-L生物反应器补料分批培养
BNX122的GlcNAc补料分批培养在初始葡萄糖浓度为5 g/L的条件下进行。为排除氮源补充限制GlcNAc合成的可能性，测试了不同的氮源组合（表S3）。补料分批培养所用发酵培养基含20 g/L酵母提取物、20 g/L胰蛋白胨、10 g/L尿素、12.5 g/L K2HPO4·3H2O……
【数据】初始葡萄糖：5 g/L；培养基：20 g/L酵母提取物、20 g/L胰蛋白胨、10 g/L尿素、12.5 g/L K2HPO4·3H2O
研究结果
3.1 枯草芽孢杆菌中CRISPRi介导的基因敲低
CRISPRi系统如图1A所示构建，具体方法见材料与方法。简言之，构建质粒pLCx-dCas9和psga，分别将强诱导型启动子PxylA控制的dCas9和强组成型启动子Pveg控制的sgRNA整合到枯草芽孢杆菌基因组的lacA和amyE位点。使用木糖诱导型启动子有两个主要原因：其一，可以减少组成型表达cas9的代谢负担；其二，诱导物木糖在抑制GlcNAc竞争反应后还可作为生物量生产的补充碳源。
为检验所构建CRISPRi系统在枯草芽孢杆菌中的转录抑制能力，将pLCx-dCas9转化至GlcNAc生产菌株BNY，得到BNX，然后将含GFP靶向sgRNA的psga-GFP转化至BNX，得到BNX000。将基于荧光的报告质粒pP43-GFP转化至BNX和BNX000，在不同浓度诱导物木糖条件下测定相对荧光强度。如图1B所示，抑制效果随木糖浓度增加而增强。使用5 g/L木糖时观察到33.1倍抑制，木糖浓度增至20 g/L时达到70.1倍抑制。有趣的是，使用15 g/L木糖时达到65.8倍抑制，表明该浓度足以完全诱导dCas9表达。这些结果表明本研究构建的CRISPRi系统运行良好，可用于后续研究。
【数据】抑制倍数：5 g/L木糖时33.1倍、15 g/L时65.8倍、20 g/L时70.1倍；菌株：BNY→BNX（dCas9）→BNX000（+GFP-sgRNA）
3.2 同时弱化GlcNAc竞争途径与葡萄糖/木糖共利用的工程改造
CRISPRi在枯草芽孢杆菌中高效工作后，我们设计了一个动态时序调控系统，在添加木糖后解除葡萄糖和木糖消耗途径之间的交叉调控。该系统同时实现：1）消除CCR，促进葡萄糖和木糖的共消耗；2）通过抑制竞争反应将葡萄糖通量直接导向GlcNAc（图2A）。如图2A所示，存在三条主要竞争途径，即HMP、EMP和PSP，它们将葡萄糖和木糖代谢的碳通量从GlcNAc生产中分流。由于这三条途径对正常细胞生长均为必需，故采用动态调控策略，利用诱导型CRISPRi系统平衡细胞生长与GlcNAc合成之间的碳通量。
选择控制HMP、EMP和PSP主要限速步骤的zwf基因（编码葡萄糖6-磷酸脱氢酶）、pfkA基因（编码磷酸果糖激酶）和glmM基因（编码磷酸葡糖胺变位酶）作为调控靶点（图2A）。由于pfkA和编码丙酮酸激酶的pyk在枯草芽孢杆菌基因组中位于同一操纵子内，选择已敲除pyk的菌株BNY作为初始宿主，以排除sgRNA靶向pfkA时对这两个基因的共抑制效应。
已有报道称，靶向编码区起始处和启动子上RNAP初始复合物内部区域的sgRNA均能有效沉默基因表达。然而，这些基因的具体启动子区域未知，因此构建了含单个或多个sgRNA的质粒psga-zwf1、psga-pfkA1、psga-glmM1、psga-zwf1-pfkA1和psga-zwf1-pfkA1-glmM1（分别靶向各基因编码区起始处），并整合至BNX基因组，得到BNX100、BNX010、BNX001、BNX110和BNX111，通过RT-qPCR验证这些基因的抑制效果（图2B）。
与不含CRISPRi系统的菌株BNY及表达dCas9和靶向GFP的引导RNA的菌株BNX000相比，GlcNAc滴度相近（15.0 ± 0.54 g/L至15.2 ± 0.38 g/L），但葡萄糖和木糖的GlcNAc产率略有下降（0.27 ± 0.005 g/g至0.22 ± 0.002 g/g），表明CRISPRi系统消耗了细胞的部分资源（图2C）。因此，使用菌株BNX000作为评估对照。
在前期研究中，Chen等人发现野生枯草芽孢杆菌在培养基中存在葡萄糖时不能代谢木糖。然而，如图2C所示，当添加60 g/L葡萄糖和15 g/L木糖时，对照菌株BNX000能够消耗约5 g/L木糖，这可能是由于GlcNAc合成途径的引入所致。该途径消耗了部分胞内果糖-6-磷酸，而果糖-6-磷酸是枯草芽孢杆菌中主要CCR调控因子1,6-二磷酸果糖（FBP）合成的直接前体。这进一步支持了我们的假设：抑制zwf、pfkA和glmM这三个基因中的每一个都能减少葡萄糖分解代谢并促进木糖利用。
抑制zwf的重组菌株BNX100与菌株BNX000相比，葡萄糖消耗降低27.0%，木糖消耗提高50.9%，表明如果葡萄糖流入HMP的主要途径被抑制，木糖可作为补充碳源。与BNX000相比，该菌株的最大DCW降低35.1%，而GlcNAc滴度无明显变化（15.2 ± 0.38 g/L至14.2 ± 1.46 g/L），GlcNAc产率提高43.4%至2.13 ± 0.001 g/g细胞干重。此外，这两种菌株的副产物乙偶姻产率无明显差异（1.06 ± 0.065 g/g细胞干重至1.01 ± 0.061 g/g细胞干重）。
抑制pfkA表达的重组菌株BNX010与BNX000相比，葡萄糖消耗降低76.2%，木糖消耗提高2.0倍，而该菌株的最大DCW降低34.3%至6.7 ± 0.17 g/L。由于初始宿主菌株BNY中已敲除编码葡萄糖激酶的glcK基因，本研究所用菌株只能通过PEP依赖的PTS利用葡萄糖。因此，该菌株葡萄糖利用的显著减弱可能是由于抑制EMP后PEP水平降低所致。尽管GlcNAc滴度降低26.9%至11.1 ± 0.74 g/L，但葡萄糖和木糖的GlcNAc产率提高91.3%至0.44 ± 0.023 g/g，表明产生的果糖-6-磷酸主要导向GlcNAc合成途径。该菌株发酵液中未检测到副产物乙偶姻，表明抑制pfkA缓解了碳溢流。
抑制glmM的重组菌株BNX001葡萄糖消耗降低9.9%，木糖消耗提高64.9%。尽管指数生长期延迟约12 h（数据未显示），但该菌株的最大DCW与对照菌株相似。此外，该菌株的GlcNAc滴度（14.1 ± 2.06 g/L）与对照菌株相似。与对照菌株相比，该菌株产生的副产物乙偶姻增加14.6%，表明PSP被抑制时更多碳通量被导向EMP。另外，未观察到异常细胞裂解，尽管枯草芽孢杆菌在特定条件下以细胞裂解著称。
由于EMP和HMP通过中间代谢物果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸相互连接，研究了同时抑制zwf和pfkA的效果。如图2C所示，菌株BNX110的葡萄糖消耗比BNX000降低39.5%，高于BNX100但低于BNX010。此外，菌株BNX110的木糖消耗比BNX000提高50.7%，也高于BNX100……
【数据】菌株：BNX100（zwf抑制）、BNX010（pfkA抑制）、BNX001（glmM抑制）、BNX110（zwf+pfkA抑制）、BNX111（三基因共抑制）；对照：BNY（无CRISPRi）、BNX000（dCas9+GFP-sgRNA）；GlcNAc滴度：BNY 15.0 ± 0.54 g/L、BNX000 15.2 ± 0.38 g/L、BNX100 14.2 ± 1.46 g/L、BNX010 11.1 ± 0.74 g/L、BNX001 14.1 ± 2.06 g/L；产率：BNY 0.27 ± 0.005 g/g、BNX000 0.22 ± 0.002 g/g、BNX010 0.44 ± 0.023 g/g、BNX100 2.13 ± 0.001 g/g细胞干重；葡萄糖消耗变化：BNX100 -27.0%、BNX010 -76.2%、BNX001 -9.9%、BNX110 -39.5%；木糖消耗变化：BNX100 +50.9%、BNX010 +2.0倍、BNX001 +64.9%、BNX110 +50.7%；DCW变化：BNX100 -35.1%、BNX010 -34.3%（6.7 ± 0.17 g/L）；乙偶姻：BNX010未检出、BNX001 +14.6%
3.3 sgRNA的组合与优化
（此部分原文节选未完整提供，基于已有内容翻译）
【数据】原文未详述
3.4 葡萄糖和木糖代谢的动态协调
（此部分原文节选未完整提供，基于已有内容翻译）
【数据】原文未详述
3.5 3-L发酵罐中BNX122的GlcNAc生产
（此部分原文节选未完整提供，基于已有内容翻译）
【数据】原文未详述
讨论与解读
野生菌株如枯草芽孢杆菌由于CCR不能同时利用葡萄糖和木糖，已有大量工作致力于解决这一问题。本研究发现，通过CRISPRi抑制枯草芽孢杆菌中的EMP、HMP或PSP可促进葡萄糖和木糖的协同利用，显著提高目标产物GlcNAc的滴度和产率。这一结果与此前报道一致，即消除部分中心碳代谢途径可促进大肠杆菌中第二种碳源的协同利用。此外，木糖代谢相关基因araE、xylAB和tkt的转录变化也证明CRISPRi调控菌株中葡萄糖的CCR被解除。这是首次报道利用葡萄糖和木糖混合物（木质纤维素的两大主要组分）生产GlcNAc。
在重组菌株BNY中，EMP、HMP和PSP与GlcNAc合成竞争相同的前体，如葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸和葡糖胺-6-磷酸，这严重限制了GlcNAc的滴度和产率。由于EMP、HMP和PSP对正常细胞生长均不可或缺，不能直接敲除，本课题组前期研究曾使用合成sRNA工程策略和起始密码子优化策略来弱化这些竞争途径……
编译者解读
本研究展示了CRISPRi作为一种可诱导、可逆的基因表达抑制工具在代谢工程中的独特优势——既能弱化必需基因又不致细胞死亡，还能通过诱导物添加时机实现"先长菌、后生产"的动态调控。将木糖同时作为诱导物和补充碳源的设计尤为巧妙，一石二鸟。但需注意，CRISPRi的抑制效率受sgRNA靶点位置影响较大，且系统本身会消耗细胞资源（对照菌株产率下降约18%），在工业放大中需权衡诱导剂成本与产量收益。该方法为多碳源协同利用提供了可推广的范式。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2018
DOI: 10.1016/j.ymben.2018.08.012
DOI: 10.1016/j.ymben.2018.08.012