来源：Application of the modular strategy to the production of ergothioneine by engineered Saccharomyces cerevisiae（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
麦角硫因（EGT）是一种具有多种生物活性的含硫氨基酸衍生物，在医药、食品、营养保健品和化妆品领域应用前景广阔。然而，传统发酵生产往往依赖外源添加组氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸等前体，导致工业化成本高企。本研究通过模块化代谢工程策略，将酿酒酵母内源前体代谢路径划分为三个模块，结合多拷贝整合与基因敲除/回补策略，最终在5升生物反应器中实现3053.3 mg/L的EGT产量——这是迄今报道的酿酒酵母EGT生产的最高水平。
研究背景
麦角硫因是一种具有抗氧化、抗炎、抗辐射和心血管保护活性的含硫氨基酸衍生物。动物细胞缺乏内源EGT合成能力，需依靠特异性转运体从外界摄取。EGT在生理条件下以稳定的硫酮形式存在，通过中和自由基、缓解氧化应激展现强抗氧化能力。作为公认安全（GRAS）物质，EGT已被批准用作食品和化妆品添加剂。传统生产方法（化学合成、天然产物提取）受限于高成本和低产量。相较之下，基于代谢工程微生物底盘的生物合成路线更为可持续。本研究旨在无需外源前体添加的条件下，实现酿酒酵母中EGT的高效生产。
研究方法
3.1 菌株与培养条件
本研究以酿酒酵母BY4741菌株为亲本底盘。构建了两个衍生菌株：菌株Ma（BY4741的ΔUra3衍生物）和菌株Ma-1（BY4741的ΔUra3和ΔLeu2衍生物）。质粒构建使用购自TransGen Biotech Co., Ltd.的大肠杆菌Trans10。研究使用的工程菌株详见Supporting Information中的表S1。大肠杆菌Trans10在添加100 μg/mL氨苄青霉素的Lysogeny broth（LB）培养基或平板中培养。酿酒酵母在酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基或平板中培养，YPD含20 g/L蛋白胨/胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物和20 g/L葡萄糖。使用缺乏尿嘧啶（Ura）或亮氨酸（Leu）的合成 dropout（SD）培养基或平板筛选目标菌株。培养基成分为1.7 g/L酵母氮碱（YNB）、5 g/L (NH4)2SO4和1.655 g/L氨基酸混合物（不含Ura、His、Leu），His浓度为0.086 g/L，Leu浓度为0.173 g/L。菌株培养和发酵使用矿物培养基（MM），含7.5 g/L (NH4)2SO4、14.4 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O，以及维生素溶液和微量元素混合溶液。三种关键前体氨基酸（组氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸）储备溶液的配制见Supporting Information表S3、S4。发酵罐培养基组成如下：20 g/L葡萄糖、16 g/L (NH4)2SO4、1.5 g/L MgSO4·7H2O、14.4 g/L KH2PO4、40 mg/L盐酸吡哆醇、10 mg/L D-泛酸钙、4 mL/L微量元素溶液和2 mL/L维生素溶液。补料分批发酵的补料培养基含：450 g/L葡萄糖、80 g/L (NH4)2SO4、14.4 g/L KH2PO4、12.5 g/L MgSO4·7H2O、0.5 g/L盐酸吡哆醇、0.1 g/L D-泛酸钙、20 mL/L微量元素溶液和10 mL/L维生素溶液。维生素溶液（1000×）和微量元素溶液（1000×）的配制详见Supporting Information中的Text S1。
【数据】菌株：S. cerevisiae BY4741及其衍生物Ma（ΔUra3）、Ma-1（ΔUra3 ΔLeu2）；大肠杆菌Trans10；培养基：LB（100 μg/mL氨苄青霉素）、YPD（20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖）、SD（1.7 g/L YNB、5 g/L (NH4)2SO4、1.655 g/L氨基酸混合物）、MM（7.5 g/L (NH4)2SO4、14.4 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O）；发酵罐初始培养基：20 g/L葡萄糖、16 g/L (NH4)2SO4、1.5 g/L MgSO4·7H2O、14.4 g/L KH2PO4、40 mg/L盐酸吡哆醇、10 mg/L D-泛酸钙、4 mL/L微量元素溶液、2 mL/L维生素溶液；补料培养基：450 g/L葡萄糖、80 g/L (NH4)2SO4、14.4 g/L KH2PO4、12.5 g/L MgSO4·7H2O、0.5 g/L盐酸吡哆醇、0.1 g/L D-泛酸钙、20 mL/L微量元素溶液、10 mL/L维生素溶液
3.2 质粒构建
本研究中构建的pSP-GM1、pRS425和pCas9质粒详见Supporting Information中的表S2。敲除质粒的构建通过替换pCas9质粒中的20 bp引导序列实现。随后，通过PCR扩增整合供体（Donor）序列并纯化。将纯化的Donor序列与pCas9质粒混合，通过醋酸锂转化法转入酵母。在SD-Ura平板上筛选阳性克隆，并通过PCR验证确认敲除或整合成功。将修饰成功的菌株划线接种到含5-氟乳清酸（5-FOA）的SC平板上以去除pCas9质粒。Ty整合是自发发生的，仅需通过醋酸锂法转化携带筛选标记的ty Donor序列，然后涂布到相应的SD平板上进行筛选。PCR酶购自Takara的Primer START MAX，Gibson组装无缝克隆酶购自TransGen Biotech Co., Ltd.。NEB公司提供限制性核酸内切酶，Omega提供质粒小提试剂盒和凝胶提取试剂盒。华大基因有限公司对构建的质粒进行测序验证。
【数据】pCas9质粒20 bp引导序列替换；醋酸锂转化法；SD-Ura平板筛选；5-FOA去除pCas9质粒；Ty自发整合；PCR酶：Takara Primer START MAX；Gibson组装酶：TransGen；限制酶：NEB；质粒小提/凝胶提取试剂盒：Omega；测序验证：华大基因
3.3 分析方法
#### 3.3.1 发酵液样品制备
在无菌层流柜中，吸取1 mL发酵混合物至1.5 mL Eppendorf管中。随后离心收集上清液，用滤膜过滤。将滤液转移至洁净的HPLC进样瓶中，拧紧瓶盖，样品即可用于HPLC分析。或者，样品可在−20 °C冰箱中避光保存。胞内产物的提取和样品制备：吸去离心管中残留的发酵液，加入1 mL去离子水重悬洗涤细胞。混合物在13,200 g离心2 min，小心倒掉上清液。将管底收集的细胞沉淀在金属浴中98 °C热灭活10 min。随后，细胞重悬于1 mL去离子水中，调整终体积至1 mL。向离心管中加入3-5颗直径3 mm的钢珠，在细胞破碎仪中振荡裂解20 min。裂解后，13,200 g离心5 min，收集上清液。上清液经滤膜过滤制备无菌样品。过滤后的样品立即进行HPLC分析，或在−20 °C保存待后续分析。
【数据】样品量：1 mL发酵液；离心：13,200 g、2 min（胞外）/5 min（胞内）；热灭活：98 °C、10 min；钢珠：3-5颗、直径3 mm；细胞破碎：20 min；储存：−20 °C避光
#### 3.3.2 HPLC检测方法
实验采用A、B两种流动相。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为纯乙腈。进样量10 μL，流速0.4 mL/min。0-2.5 min用100%流动相A洗柱，2.5-5 min用70%流动相A和30%流动相B的混合液洗脱，5-16 min回到100%流动相A。柱温30 °C，紫外吸收波长254 nm。使用的色谱柱为Kromasil 100-5-C18(w)，4.6 × 250 mm，HPLC系统为Thermo U3000。实验发现不同C18色谱柱需要调整流动相组成和色谱方法。
【数据】进样量：10 μL；流速：0.4 mL/min；柱温：30 °C；检测波长：254 nm；色谱柱：Kromasil 100-5-C18(w)，4.6 × 250 mm；HPLC系统：Thermo U3000；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：纯乙腈
3.4 酵母菌株摇瓶培养
挑取SD-Ura或SD-Leu平板上生长的酿酒酵母单菌落，接种至试管中，30 °C、200 rpm过夜培养。随后，将培养物以初始OD600为0.1接种至含30 mL MM培养基的100 mL摇瓶中，在30 °C、200 rpm的摇床中进行发酵培养。
【数据】初始OD600：0.1；培养温度：30 °C；转速：200 rpm；培养基：MM 30 mL/100 mL摇瓶
3.5 5 L发酵罐补料分批培养及副产物乙醇检测
5 L玻璃生物反应器购自上海保兴生物设备工程有限公司。5 L发酵罐的初始培养基和补料培养基组分见3.1节。一级种子培养：从琼脂平板上挑取单菌落，接种到含5 mL最低盐培养基的50 mL离心管中，30 °C、200 rpm振荡培养16-24 h，直至OD600值达到2-5。二级种子培养：取300 μL一级种子培养液转移至5个含30 mL最低盐培养基的摇瓶中。30 °C、200 rpm培养24 h后，3000 rpm离心3 min。弃去上清液，将所有细胞重悬并收集于100 mL无菌水中。将全部细胞悬液接种至2 L分批发酵培养基中。发酵程序：发酵温度维持在30 °C，用50%磷酸溶液和5 M KOH溶液控制pH为5.0。初始通气量为2 L/min，搅拌转速为300 rpm。发酵过程中，通过提高搅拌转速和通气量将溶氧水平维持在20-30%。当发酵液中葡萄糖检测不到且乙醇浓度低于0.5 g/L时开始补料，初始补料速率为5 mL/h。每8 h测定发酵液中葡萄糖和乙醇浓度，确保无葡萄糖积累且乙醇浓度低于0.5 g/L。补料速率随细胞OD600升高而逐渐增加。发酵过程中定期取样，监测葡萄糖、乙醇及其他产物的浓度。
【数据】发酵罐：5 L玻璃生物反应器（上海保兴）；一级种子：5 mL最低盐培养基、30 °C、200 rpm、16-24 h、OD600 2-5；二级种子：300 μL接种至5×30 mL、30 °C、200 rpm、24 h、3000 rpm离心3 min；接种量：全部细胞重悬于100 mL无菌水接入2 L培养基；温度：30 °C；pH：5.0（50%磷酸/5 M KOH）；通气量：初始2 L/min；转速：初始300 rpm；溶氧：20-30%；补料触发条件：葡萄糖未检出且乙醇<0.5 g/L；初始补料速率：5 mL/h；监测频率：每8 h
研究结果
2.1 酿酒酵母外源EGT生物合成途径的构建
本研究从粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、灰树花（Grifola frondosa）和紫孢虫草（Cordyceps purpurea）中分别选取EGT合成相关基因NcEgt1、NcEgt2、GfEgt1、GfEgt2和CpEgt2（排除了催化活性较低的CpEgt1）。理论上，仅引入Egt1基因即可满足EGT生产需求，因为酿酒酵母本身具有半胱氨酸脱硫酶。但考虑到内源半胱氨酸脱硫酶是否能满足高效EGT生产的要求，仍筛选了其他异源半胱氨酸脱硫酶。将不同来源的Egt1和Egt2基因进行全组合配对。以pSP-GM1（含2μ序列）质粒为载体，构建了9种不同基因组合的质粒，包括空白对照和内源半胱氨酸脱硫酶。这些质粒用于在酿酒酵母Ma（BY4741的ΔUra3衍生物）中建立异源EGT生物合成途径，获得9个酵母转化子，命名为Ma00-Ma08（图2A）。通过比较EGT滴度，筛选出最适合酿酒酵母EGT生产的Egt1-Egt2组合，成功获得高产EGT菌株Ma03（图2C）。该菌株通过外源基因GfEgt1和NcEgt2的组合实现了高效EGT合成。在发酵192 h时，Ma03菌株的EGT产量达到51.76 mg/L，为整个发酵过程中的最高值。相比之下，携带GfEgt1-CpEgt2和GfEgt1-GfEgt2组合的菌株分别产生46.50 mg/L和46.84 mg/L EGT，而NcEgt1-CpEgt2组合的EGT滴度最低，仅为23.22 mg/L。这些发现凸显了选择最佳EGT生物合成酶组合对最大化EGT产量的重要性。
通过比较发酵过程中生物量与EGT产量之间的关系（图2D），发现EGT产量较低的菌株表现出较高的生物量。这表明EGT的还原作用可能增强细胞氧化还原平衡，从而促进细胞生长。相比之下，高滴度菌株中观察到的生物量逐渐下降，是由于异源EGT生物合成酶的高水平表达和过度的途径催化通量破坏了细胞内代谢稳态，抑制了细胞增殖。要完全验证这一机制，需要直接定量胞内ROS水平。由于本研究范围所限，以及胞内代谢物定量需要大量方法学优化，未进行这些测定。从提供的OD600曲线可以看出，细胞生物量在72 h达到峰值，随后在96 h略有下降，之后保持相对稳定。这表明营养耗尽后细胞发生死亡。延长发酵时间以进一步观察EGT在发酵后期的变化。然而，96 h后发酵样品的检测显示EGT持续积累。推测EGT的持续积累是由多种因素造成的，包括死亡细胞中胞内产物的泄漏。因此，通过分析发酵过程中EGT滴度和细胞生物量的时间进程曲线，确定144 h作为后续所有摇瓶发酵实验的统一取样时间点。
【数据】基因来源：N. crassa（NcEgt1、NcEgt2）、G. frondosa（GfEgt1、GfEgt2）、C. purpurea（CpEgt2）；质粒：pSP-GM1（含2μ序列）；菌株：Ma00-Ma08（9个转化子）；Ma03（GfEgt1+NcEgt2）192 h EGT产量：51.76 mg/L；GfEgt1-CpEgt2：46.50 mg/L；GfEgt1-GfEgt2：46.84 mg/L；NcEgt1-CpEgt2：23.22 mg/L；生物量峰值：72 h；统一取样时间：144 h
2.2 关键前体代谢途径的探索
上述研究已成功鉴定出最有效的异源EGT合成基因组合，并利用pSP-GM1质粒构建了EGT生物合成途径。为提高EGT产量，研究聚焦于三种必需前体氨基酸——His、Met和Cys的生物合成。这些氨基酸的胞内水平对EGT产量起决定性作用，亟需深入研究它们与EGT合成的关系，以指导细胞代谢途径的优化。如图1B所示，这些氨基酸的合成涉及磷酸戊糖（PP）途径、SAM循环和硫同化途径。由于这些途径的复杂性及涉及众多关键步骤，研究策略是对这些途径中的关键基因进行实验研究，以揭示它们对EGT生产的影响。
#### 2.2.1 三种关键前体氨基酸添加的验证
在以往的研究中，许多研究者尝试在发酵过程中添加前体氨基酸以提高产物发酵滴度，但每种氨基酸对发酵过程的具体影响尚未被充分报道。因此，本研究对三种氨基酸的添加效应进行了全面考察。通过这项研究，可以确定三种前体氨基酸在EGT生物合成中的优先顺序，从而指导对三个代谢模块的改造。
通过实验设计（Supporting Information表S3、S4），研究了不同浓度的His、Met和Cys对EGT生产的影响。以Ma03菌株为发酵菌株，每24 h取样测定OD600和EGT滴度（图3），直至168 h取样结束。结果表明，外源His补充促进了酿酒酵母的EGT生产。在His浓度为200 mg/L时，最大EGT滴度达到66.8 mg/L，较对照菌株的49.02 mg/L提高了36.3%。此外，比较流加补充400 mg/L His与一次性添加400 mg/L His的EGT积累情况，流加策略的最大EGT滴度达到78.5 mg/L，较一次性添加组的59.81 mg/L提高了31.25%（图3A-B）。这些发现表明His在酿酒酵母EGT生产中起关键作用。需要平衡其积累速率，增强其流向EGT生物合成的通量，同时防止His积累引起的生长抑制。
有趣的是，虽然低浓度Met补充促进了生物量增长，但EGT积累较对照组有所减少，如图3C-D所示。这表明在低Met积累条件下，Met优先被导向生物量合成而非EGT生产。因此，后续工程改造需要调控Met通量，使其尽可能有利于EGT生物合成。在Met浓度为1200 mg/L时，EGT滴度从49.02 mg/L增加到63.10 mg/L。Cys的存在促进了菌株的生长。令人惊讶的是，Cys的引入并未刺激EGT的产生，反而相比对照阻碍了EGT的生产（图3E-F）。进一步分析（Supporting Information图S2）表明，His的加入显著提高了EGT产量，Met的添加在提高EGT产量的同时在高浓度下阻碍生长，而Cys的补充增加了生物量但不直接促进EGT生产。在发酵过程中，His是EGT合成的主要前体，其次是Met，而Cys在测试浓度范围内未显著增强EGT合成。
针对升高的半胱氨酸池未能显著促进EGT积累这一现象，提出两种可能的解释：外源补充的Cys可能被氧化而失去生物可利用性；或者，当前菌株中Cys的供应已足以维持EGT生物合成。为区分这两种情况，需要进一步研究。
【数据】His 200 mg/L：EGT 66.8 mg/L，较对照49.02 mg/L提高36.3%；流加400 mg/L His：EGT 78.5 mg/L，较一次性添加59.81 mg/L提高31.25%；Met 1200 mg/L：EGT 63.10 mg/L（对照49.02 mg/L）；Cys：未促进EGT生产；取样间隔：24 h；总发酵时间：168 h
2.3 模块化代谢工程改造
（注：原文结果部分后续内容在提供的节选中未完整呈现，以下根据已有信息进行编译）
基于上述前体添加实验结果，研究将酿酒酵母内源前体代谢途径划分为三个代谢模块：组氨酸代谢途径、SAM循环和硫同化途径。通过筛选和组合优化不同模块中的基因靶点，结合多拷贝整合策略以及组氨酸代谢基因的敲除与回补，同时过表达和强化了异源EGT生物合成途径和内源前体代谢途径。
2.4 摇瓶发酵与5 L发酵罐放大生产
最终整合菌株在摇瓶发酵中实现了161.98 mg/L的EGT产量。在5 L补料分批发酵中，不添加任何前体氨基酸，发酵240 h时EGT总滴度峰值达到3053.3 mg/L，对应生产率为12.72 mg/L/h。
【数据】摇瓶发酵EGT产量：161.98 mg/L；5 L补料分批发酵：240 h、EGT峰值3053.3 mg/L、生产率12.72 mg/L/h；前体氨基酸添加：无
讨论与解读
本研究通过模块化代谢工程策略，系统性地解决了酿酒酵母中EGT合成的前体供应瓶颈。将复杂的前体代谢网络划分为组氨酸代谢、SAM循环和硫同化三个模块，结合多拷贝整合与敲除/回补策略，实现了异源合成途径与内源前体供应途径的协同强化。最终在5 L发酵罐中达到3053.3 mg/L的EGT产量，为迄今酿酒酵母EGT生产的最高报道水平。该策略避免了外源前体添加，显著降低了工业化生产成本。前体添加实验揭示的His>Met>Cys的优先级排序，为代谢通量分配提供了重要参考。
编译者解读：这项工作的核心价值在于"模块化"思维——将复杂的前体供应问题拆解为可独立优化的三个模块，大幅降低了代谢工程的试错成本。值得注意的是，研究者没有一味追求最高生物量，而是接受了高EGT产量伴随生物量下降的权衡，这种取舍在工业菌株开发中很常见。5 L发酵罐数据（12.72 mg/L/h的生产率）已具备一定的产业化参考价值。不过，胞内ROS水平未直接测定、Cys作用机制未完全阐明，这些留白也为后续研究指明了方向。
参考来源
Ma M. Application of the modular strategy to the production of ergothioneine by engineered Saccharomyces cerevisiae. Food Bioscience, 2026. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109498
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109498