来源：Application of the CRISPRi system to repress sepF expression in Mycobacterium smegmatis（Infection, Genetics and Evolution）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
结核病仍是全球最严重的细菌感染性疾病之一，而分枝杆菌必需基因的直接失活一直缺乏高效工具。本研究基于核酸酶缺陷型Cas9（dCas9）与特异性小向导RNA（sgRNA），在耻垢分枝杆菌中建立了CRISPR干扰（CRISPRi）技术体系，成功将sepF基因表达抑制达98%，并证实sepF为分枝杆菌必需基因。研究还系统评估了脱靶效应，为分枝杆菌基因功能研究与药物靶点鉴定提供了可操作的技术方案。
研究背景
结核病影响全球约20亿人，其中5%–10%的感染者会发展为活动性肺结核并具有传染性，多数人则形成潜伏感染。耐药结核病的蔓延使新型药物靶点和疫苗候选分子的需求更为迫切。然而，分枝杆菌中必需基因的直接失活一直面临技术瓶颈——无论是传统的同源重组还是锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶等新型修饰内切酶系统，都无法高效构建必需基因的框内缺失突变体。
CRISPRi技术利用失去核酸酶活性的dCas9与sgRNA形成的复合物，通过空间位阻效应阻断RNA聚合酶的转录延伸或起始，从而实现对目标基因表达的可逆抑制。这一技术为功能未知的必需基因研究提供了新可能，有望加速结核分枝杆菌药物靶点和疫苗候选分子的鉴定进程。
研究方法
2.1 菌株、培养基、质粒与生长曲线
本研究中，大肠杆菌DH5α购自TIANGEN公司，耻垢分枝杆菌mc2-155为本实验室保存。大肠杆菌DH5α用于质粒构建，培养于Luria–Bertani（LB）培养基（Oxoid）。耻垢分枝杆菌培养于液体Middlebrook 7H9和固体Middlebrook 7H10培养基（BD），并添加0.2%甘油和0.05%吐温80。筛选抗生素用量如下：大肠杆菌使用卡那霉素（50 μg/mL）和潮霉素（200 μg/mL）；耻垢分枝杆菌使用卡那霉素（30 μg/mL）和潮霉素（50 μg/mL）。菌株在37°C条件下培养，液体培养摇床转速为120 rpm，固体培养不摇动。
pRH2502和pRH2521载体（Addgene质粒# 84379和# 84380）由Robert Husson博士（哈佛医学院）惠赠，二者分别由TetR调控启动子表达dCas9和sgRNA。仅含pRH2502的耻垢分枝杆菌菌株在卡那霉素存在下培养，共转化pRH2502和pRH2521的菌株则在卡那霉素和潮霉素双抗条件下培养。
为抑制目标基因，将耻垢分枝杆菌培养至对数期（OD600介于0.6–0.8），在7H9培养基中稀释至理论OD600为0.001，均分后添加或不添加脱水四环素（aTc；200 ng/mL），继续培养12小时。从0至12小时每3小时测定一次OD600，绘制生长曲线。
【数据】培养基：LB/7H9/7H10；抗生素：卡那霉素（大肠杆菌50 μg/mL，分枝杆菌30 μg/mL）、潮霉素（大肠杆菌200 μg/mL，分枝杆菌50 μg/mL）；温度：37°C；转速：120 rpm；aTc浓度：200 ng/mL；OD600范围：0.6–0.8；培养时间：12h
2.2 CRISPRi靶位点选择与sgRNA设计
设计靶向启动子区域的sgRNA时，需通过5′-cDNA末端快速扩增（5′-RACE）确定目标基因的转录起始位点。为简便灵活起见，本研究仅设计靶向Msm_sepF编码区的sgRNA，用于阻断转录延伸。为提高抑制效率，sgRNA应设计为结合编码区的有义链；结合反义链的sgRNA通常无法有效沉默基因表达。
sgRNA设计流程如下：（i）在基因编码区靠近5′端处寻找有义链上的CCN序列（即反义链上的NGG原型间隔区相邻基序（PAM）序列），靠近5′端可获得更高的抑制效率。（ii）针对CCN序列后的20 nt序列设计寡核苷酸，形式为：5′-GGGA+（反义链序列）-3′和5′-AAAC+（有义链序列）-3′。（iii）筛选与耻垢分枝杆菌基因组中其他序列差异较大（≥4个错配）的序列，以避免脱靶效应。（iv）确认所选序列不含限制性酶切位点或转录终止子序列。
此外，一段101 bp的马铃薯核酸序列（AACTTGGCTTTAATGGACCTCCAATTTTGAGTGTGCACAAGCTATGGAACACCACGTAAGACATAAAACGGCCACATATGGTGCCATGTAAGGATGAATGT），经确认与任何已知人类序列无同源性，用于预测与分枝杆菌序列的同源性并设计对照sgRNA。用于生成Msm_sepF sgRNA构建体的全部寡核苷酸列于表1。
【数据】sgRNA长度：20 nt；PAM序列：CCN（有义链）/NGG（反义链）；错配筛选阈值：≥4个错配；对照序列：101 bp马铃薯核酸序列
2.3 基因组特异性与脱靶位点分析
使用CAS OT搜索工具（http://casot.cbi.pku.edu.cn/example.php）检查sgRNA在耻垢分枝杆菌基因组中的结合特异性。对每个设计的sgRNA碱基配对区（即23 nt特异性序列，5′-（反义链序列）-NGG-3′）在耻垢分枝杆菌全基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/CP000480.1）中进行搜索，预测潜在的脱靶DNA结合位点。CAS OT工具对正义链和反义链均进行搜索。
选择与耻垢分枝杆菌基因组中其他序列有4个或5个以上错配的sgRNA，丢弃错配≤3个的sgRNA，特别是那些远离PAM序列的错配。预测与多个基因组位点相似的sgRNA一律弃用。
【数据】搜索工具：CAS OT；基因组数据库：NC_CP000480.1；特异性序列长度：23 nt；错配筛选阈值：≥4或5个错配，≤3个错配丢弃
2.4 质粒构建与转化
pRH2521载体在BbsI位点切开，37°C磷酸酶处理3小时。线性化并去磷酸化的pRH2521载体使用凝胶提取试剂盒（TIANgel Maxi Purification Kit）纯化。合成两条24 nt DNA寡核苷酸，用T4 PNK（NEB）进行退火和磷酸化。将含有基因特异性sgRNA序列的磷酸化双链DNA插入片段与线性化去磷酸化的pRH2521载体在25°C下用T4 DNA连接酶（NEB）连接10分钟。连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过测序确认重组子。随后将含有基因特异性sgRNA序列的pRH2521质粒转化至已含pRH2502的耻垢分枝杆菌中。
电转感受态耻垢分枝杆菌细胞的制备方法为：将100 mL细菌培养物培养至对数期（OD600介于0.6–0.8），收集细胞并用预冷10%甘油洗涤四次，最终将菌体沉淀悬浮于2.0 mL预冷10%甘油中。使用Gemini Twin Waveform电穿孔系统（BTX）进行电转化，参数设置为2.5 kV、1000 Ω和25 μF。将约400 ng DNA加入200 μL等分的耻垢分枝杆菌细胞中，置于2 mm预冷电转杯中。电击后立即用总共5 mL 7H9肉汤稀释细胞，37°C、200 rpm振荡培养15小时。最后将细胞涂布于含卡那霉素或卡那霉素与潮霉素双抗的7H10琼脂平板，37°C培养3–4天。
【数据】限制酶：BbsI；磷酸酶处理：37°C、3h；T4 PNK磷酸化；连接：25°C、10min；电转参数：2.5 kV、1000 Ω、25 μF；DNA用量：约400 ng；细胞体积：200 μL；复苏培养：37°C、200 rpm、15h；平板培养：3–4天
2.5 RNA分离及质量评估
RNA分离参照Singh等人（2016）的方法并作部分修改。使用含20 mg/mL溶菌酶（Sigma-Aldrich）和40 μL蛋白酶K（Qiagen）的TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0，无核酸酶）（ThermoFisher Scientific）裂解细胞，涡旋10秒、间隔2分钟、共10分钟。随后加入QIAzol试剂（Qiagen），使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）在机械破碎细胞后纯化RNA。
本研究使用Fastprep-24™样品制备仪（MP Biomedicals）和含0.1 mm硅球的裂解基质B管进行机械破碎，以6 M/S振荡两次、每次30秒、间隔2分钟。纯化的RNA使用Ambion® TURBO DNA-free™ Kit（ThermoFisher Scientific）去除残留DNA，操作按制造商说明进行。通过无逆转录的定量PCR（qPCR）验证无基因组DNA污染。RNA浓度和纯度分别通过OD260值和OD260/280比值测定（Nanodrop 2000仪器，ThermoFisher Scientific）。此外，使用3′:5′完整性分析进行RNA完整性定量评估，详见2.6节。
【数据】溶菌酶浓度：20 mg/mL；蛋白酶K：40 μL；涡旋：10s/次、间隔2min、共10min；机械破碎：6 M/S、30s×2次、间隔2min；硅球直径：0.1 mm；检测仪器：Nanodrop 2000
2.6 RT-qPCR
逆转录反应使用100 ng RNA、终体积20 μL，采用SuperScript III第一链合成系统（ThermoFisher Scientific）和oligo（dT）引物。每孔qPCR反应使用2 μL cDNA。定量PCR使用SYBR Select Master Mix（ThermoFisher Scientific）和Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex仪器，QuantStudio™实时PCR软件v1.1。反应程序为：50°C 2分钟，95°C 2分钟，然后40个循环的95°C 15秒、57°C 15秒和72°C延伸。
【数据】RNA用量：100 ng；反应体积：20 μL；cDNA用量：2 μL/反应；循环数：40；退火温度：57°C；延伸温度：72°C
研究结果
3.1 潜在脱靶效应与sgRNA筛选
为降低潜在脱靶效应，需选择与耻垢分枝杆菌基因组中其他序列不相似的Msm_sepF特异性靶序列。本研究丢弃与脱靶位点错配≤3个的靶序列，选择至少有4或5个错配的序列用于表达基因特异性sgRNA（表2）。所选sgRNA相对于翻译起始密码子的位置分别为−1、+46和+101。
随后测定了四个相应脱靶基因（MSMEG_6529、MSMEG_5505、MSMEG_1378和MSMEG_5373）的表达。根据Msm_sepF靶序列与这四个脱靶序列的比对结果，MSMEG_6529在PAM序列中存在一个非关键错配（CCN中的‘N’），而其他脱靶序列的PAM序列完整（图2）。
【数据】sgRNA位置：−1、+46、+101；脱靶基因数：4个；MSMEG_6529 PAM错配：非关键位点（N）
3.2 表达sgRNA的质粒构建
为构建sepF特异性pRH2521质粒，合成并退火两条互补寡核苷酸（表1），产生两端分别带有GGGA和CAAA悬垂的24 bp DNA片段。退火后的双链DNA按“2.4 质粒构建与转化”所述方法克隆至pRH2521的BbsI位点。含有sepF特异性sgRNA分子的pRH2521在耻垢分枝杆菌中表达，sgRNA结合有义链（图1C）。因此，在同时含有pRH2502和sepF特异性pRH2521的耻垢分枝杆菌中，经aTc处理后Msm_sepF的表达可能受到抑制。
考虑到不同sgRNA的转录抑制水平不同，本研究构建了三个sepF特异性pRH2521载体，即Msm_sepF-1、Msm_sepF+46和Msm_sepF+101（图1D）。
【数据】插入片段长度：24 bp；悬垂序列：GGGA/CAAA；克隆位点：BbsI；构建载体数：3个
3.3 CRISPRi对Msm_sepF的抑制效果
#### 3.3.1 CRISPRi对Msm_sepF的抑制效果
用于设计sgRNA对照载体的20 nt马铃薯序列（5′-CCAATTTTGAGTGTGCACAA-3′）经CAS OT工具验证与任何分枝杆菌序列均无同源性。首先检验了该对照载体的效果。如图3A–B所示，添加aTc后12小时观察到dcas9约189±28倍的诱导表达，而sepF的表达未见下降。
随后评估了表达基因特异性序列sgRNA的载体效果。对于诱导表达dcas9和靶向−1、+46和+101序列sgRNA的耻垢分枝杆菌菌株，分别观察到180±44、262±61和208±36倍的dcas9诱导表达，添加aTc后12小时sepF表达分别降低了98%、95%和97%（图3D、E、G、H、J和K）。这些结果表明，使用设计的sgRNA成功实现了对Msm_sepF的抑制。
【数据】对照dcas9诱导倍数：189±28倍；sepF表达变化：无下降；−1 sgRNA：dcas9诱导180±44倍，sepF抑制98%；+46 sgRNA：dcas9诱导262±61倍，sepF抑制95%；+101 sgRNA：dcas9诱导208±36倍，sepF抑制97%；检测时间点：aTc添加后12h
#### 3.3.2 敲低菌株中耻垢分枝杆菌的生长情况
通过从0至12小时每3小时测定OD600分析各菌株在添加或不添加aTc条件下的生长情况。每个诱导菌株从9小时起观察到生长减缓（图3F、I、L），但含sgRNA对照载体的菌株未出现类似现象（图3C）。通过肉眼观察，Msm_sepF敲低菌株的培养物在诱导后24小时呈现澄清状态，死细菌细胞沉淀于管底（图4A）。因此，sepF缺失对细菌有害，sepF是耻垢分枝杆菌的必需基因。
【数据】生长减缓起始时间：9h；表型观察时间：诱导后24h
#### 3.3.3 敲低菌株中耻垢分枝杆菌的形态
已有研究证明SepF协助关键细胞分裂蛋白FtsZ在分裂位点的定位。本研究因此观察了CRISPRi敲低sepF后耻垢分枝杆菌细胞的形态。aTc诱导12小时后，相当比例的细菌表现出伸长、丝状化和分枝状结构（图4C–F）。细胞长度分布的直接观察显示，大多数细胞至少比未添加aTc培养菌株的平均细胞长度长2.5倍。
【数据】形态变化：伸长、丝状化、分枝状结构；观察时间：诱导后12h；细胞长度：≥平均长度的2.5倍
3.4 CRISPRi对脱靶基因、Msm_ftsZ和Msm_murG的影响
测定了含有4–5个错配的四个脱靶基因的表达，未观察到任何基因的表达显著降低（图5A–D）。此前研究报道Mtb_sepF与Mtb_ftsZ和Mtb_murG存在相互作用，SepF辅助FtsZ定位和murG肽聚糖生物合成于分裂位点。本研究因此也在Msm_sepF敲低菌株中测定了Msm_ftsZ和Msm_murG的表达，发现Msm_sepF的缺失不影响Msm_ftsZ和Msm_murG的水平（图5E–F）。
【数据】脱靶基因错配数：4–5个；脱靶基因表达变化：无显著降低；Msm_ftsZ表达：未受影响；Msm_murG表达：未受影响
讨论与解读
本研究首次利用CRISPRi系统对耻垢分枝杆菌必需基因Msm_sepF进行功能研究。与早期三篇分枝杆菌CRISPRi报道相比——Choudhary和Rock团队均未预测或测定脱靶效应，Singh团队使用的“Tuberculist”工具不适用于其他细菌——本研究提供了更完善的技术流程。三个设计的sgRNA全部有效（100%成功率，基因抑制率超过95%），表明sgRNA结合编码区5′端有义链是良好的CRISPRi靶位点选择策略，无需考虑未知转录起始位点而设计靶向启动子的sgRNA。研究还建议至少设计三个sgRNA以确保抑制效果。
编译者解读： 该研究的技术价值在于系统验证了CRISPRi在分枝杆菌中应用的完整流程——从sgRNA设计原则、脱靶预测到功能验证，为这一难以进行基因操作的病原菌提供了可推广的基因功能研究范式。98%的抑制效率与零脱靶效应证明了方法的可靠性。不过，研究仅考察了单一必需基因，且未深入探讨sepF缺失导致形态异常的下游分子机制。未来将该技术扩展至结核分枝杆菌的药物靶点筛选，将是值得期待的方向。
参考来源
Xiao J. Application of the CRISPRi system to repress sepF expression in Mycobacterium smegmatis. Infection, Genetics and Evolution, 2019.
DOI: 10.1016/j.meegid.2018.06.033
DOI: 10.1016/j.meegid.2018.06.033