代谢工程新策略：CRISPRi与基因敲除提升大肠杆菌尸胺产量

📅 2026-08-30 📰 Journal of Bioscience and Bioengineering 2020-12-31 📂 研究进展 👁 16

来源：Metabolic manipulation through CRISPRi and gene deletion to enhance cadaverine production in Escherichia coli（Journal of Bioscience and Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：代谢通路设计

导读

尸胺（1,5-二氨基戊烷，DAP）是合成生物基聚合物的重要平台化合物。本研究在大肠杆菌中系统比较了CRISPRi基因敲低与Lambda-Red基因敲除两种代谢工程策略，通过调控尸胺降解途径的四个下游基因（speE、puuA、speG、ygjG），成功将尸胺产量提升至38 g/L，产率达2.67 g/L/h。研究还揭示了PLP辅因子浓度对赖氨酸消耗和尸胺积累的关键调控作用。

研究背景

面对化石资源日益枯竭与全球气候变化的双重压力，环境友好的生物基化学品开发已成为当务之急。尸胺作为1,5-二氨基戊烷，是合成生物聚合物的关键平台化合物，可由大肠杆菌中的赖氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.18）催化赖氨酸脱羧生成。然而，产物尸胺会被细胞内speE、puuA、speG和ygjG四个下游基因编码的酶进一步代谢为副产物，显著降低目标产物积累量。本研究探索了两种代谢调控策略——Lambda-Red基因敲除系统和CRISPRi基因敲低系统，在26株工程菌中系统调控代谢流，以期提高尸胺产量。

研究方法

菌株与培养基

大肠杆菌DH5α用于质粒扩增，BL21(DE3)和W3110::L5作为尸胺生产菌株。所有工程菌株列于原文表1。LB培养基（含10 g/L氯化钠、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物）作为培养液。为维持相应菌株中的质粒，添加氨苄青霉素（Ap，100 μg/mL）、卡那霉素（Km，50 μg/mL）和氯霉素（Cm，25 μg/mL）。

CadA表达质粒的构建

构建pSU-J23105-CadA时，以MG1655基因组为模板，使用引物HindIII-CadA-F和BglII-CadA-R扩增cadA基因片段，经HindIII和BglII双酶切后克隆至pSU-J23105骨架。pSUA-J23105-CadA的构建：用XbaI和BglII从pSU-J23105-CadA切取J23105-CadA片段，克隆至pSUA骨架，抗性由Cm更换为Km。构建pSIT-T7-CadA时，以引物BamHI-CadA-F和HindIII-CadA-R从MG1655基因组扩增cadA片段，插入pSIT-Duet载体。

sgRNA表达质粒的构建

sgRNA设计为与靶位点互补，引导dCas9蛋白结合至靶基因前端。单基因抑制：合成20 bp双链sgRNA，经引物退火后克隆至预先用BsaI消化的pSM-dCas9骨架，获得pSM-dCas9-sg::speE、pSM-dCas9-sg::puuA、pSM-dCas9-sg::speG和pSM-dCas9-sg::ygjG。多基因抑制：sgRNA由IDT合成，多基因抑制用sgRNA从合成片段扩增获得，引物带有BsaI粘性末端，克隆至pSM-dCas9骨架，构建pSM-dCas9-sg::GY、pSM-dCas9-sg::PGY和pSM-dCas9-sg::EPGY。所有引物和质粒分别列于原文表S1和表S2。

蛋白表达分析

重组蛋白表达通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。培养12小时后，离心收集细胞（12,000 ×g，3 min），调整细胞浓度至OD 4，重悬于dH2O中。使用OneShot仪器（Constant Systems）破碎全细胞后，离心分离上清与细胞碎片。蛋白分离按标准SDS-PAGE程序进行（80 V，30 min；120 V，70 min）。凝胶经考马斯亮蓝G-250染色可视化，并用Image Lab软件（Bio-Rad Laboratories）定量。

培养条件

尸胺生产实验中，赖氨酸作为底物添加至0.35 M（50 g/L），PLP作为辅因子添加至10 μM。常规条件下，底物、辅因子和诱导剂异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）在OD600达到0.5–0.8时（即3 h）添加，随后在37°C、200 rpm振荡条件下继续培养24 h。PLP效应实验采用2.5–20 μM浓度梯度；提高尸胺产量实验使用50、75和90 g/L赖氨酸。延迟底物添加实验中，IPTG在3 h先加入，赖氨酸和PLP在培养12 h后补加。底物添加后每6 h取样分析。所有实验设三次重复。

衍生化与高效液相色谱分析

二胺衍生物的制备：将340 μL 50 mM硼酸盐缓冲液（pH 9）、240 μL 100%甲醇、12 μL 200 mM二乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯（DEEMM）和6 μL样品（<0.1 M）混合，无需预处理。混合物在70°C水浴加热2 h，使过量DEEMM完全降解并完成衍生化。衍生化后，采用配备二元泵、在线脱气机、自动进样器和柱温箱的高效液相色谱（HPLC）系统分析。色谱分离采用反相C18柱（YMC-C18柱，4.6 × 250 mm，5 μm粒径），柱温35°C。流动相A为25 mM醋酸钠，流动相B为100%乙腈。流速0.8 mL/min，梯度程序：0–2 min，80–75% A；2–30 min，75–40% A；30–35 min，40–80% A。紫外检测波长为284 nm。

(A) Schematic diagram of DAP metabolic pathway in E. coli. The lysine was used as precursor and catalyzed by CadA enzyme and PLP co-factor. The produced DAP will be consumed by genes speE, puuA, speG and ygjG. Enzymes encoded by gene shown are as follows: cadA, lysine decarboxylase; speE, putrescine — ▲ (A) Schematic diagram of DAP metabolic pathway in E. coli. The lysine was used as precursor and catalyzed by CadA enzyme and PLP co-factor. The produced DAP will be consumed by genes speE, puuA, speG and ygjG. Enzymes encoded by gene shown are as follows: cadA, lysine decarboxylase; speE, putrescine

【数据】菌株：E. coli DH5α、BL21(DE3)、W3110::L5；培养基：LB（10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物）；抗生素：Ap 100 μg/mL、Km 50 μg/mL、Cm 25 μg/mL；离心：12,000 ×g，3 min；SDS-PAGE：80 V 30 min + 120 V 70 min；培养：37°C、200 rpm；赖氨酸：0.35 M（50 g/L）；PLP：10 μM；IPTG：OD600 0.5–0.8时添加；PLP梯度：2.5–20 μM；赖氨酸梯度：50、75、90 g/L；衍生化：70°C水浴2 h；HPLC：C18柱（4.6 × 250 mm，5 μm），35°C，流速0.8 mL/min，检测波长284 nm

研究结果

在大肠杆菌中建立CRISPRi调控系统用于尸胺生产

天然尸胺生产与CadA催化赖氨酸的代谢途径相关。然而，尸胺会通过4个基因（speE、puuA、speG和ygjG）进一步代谢为副产物，降低尸胺积累（图1A）。因此，本研究应用CRISPRi系统调节尸胺代谢流。每个sgRNA设计为靶向四个副产物基因非模板链的特异性序列。dCas9、sgRNA和tracrRNA克隆于p15A载体（图1B）。研究使用4个独立sgRNA进行单基因抑制，3个复合sgRNA进行多基因抑制。sgRNA序列经DNA测序确认构建正确。传统的Lambda-Red重组系统已广泛应用于大肠杆菌染色体基因失活。借助细菌噬菌体重组酶exo、beta和gam，可在染色体靶位点进行基因插入、替换或删除，并通过选择标记筛选。FLP重组酶靶标（FRT）序列侧翼的抗性标记可被FLP重组酶进一步去除，获得无标记菌株（图1C）。与Lambda-Red重组相比，CRISPRi技术更简单灵活——构建质粒一天内即可完成一个或多个sgRNA的组装，而Lambda-Red系统通常至少需要4天完成一个基因的敲除。

CRISPRi介导的基因敲低增强尸胺生产

首先构建了两个不同启动子控制的CadA表达质粒：组成型J23105启动子的pSUA-J23105-CadA和诱导型T7启动子的pSIT-T7-CadA。据报道，T7系统是强大的蛋白表达系统，已成功应用于尸胺生产的全细胞生物催化。T7启动子驱动的高水平CadA将加速赖氨酸向尸胺的转化，从而最小化下游代谢的影响。因此，选择强度较弱的组成型J23105启动子（Anderson启动子之一）来减缓CadA通量，延缓尸胺生产。所有携带单个CRISPRi质粒的菌株生长速率均慢于野生型。这种延缓效应主要来自dCas9蛋白的毒性，基因抑制仅产生次要影响（图S2）。

pSUA-J23105-CadA与CRISPRi系统的生物量、蛋白表达、赖氨酸消耗和尸胺滴度如图2所示。共表达CadA和靶向不同基因的CRISPRi时，所有菌株的细胞密度均低于仅含CadA的菌株。其中，ygjG基因抑制的BJAiY菌株生长延迟效应最明显（图2A）。无基因抑制的J-CadA蛋白表达量略低于携带不同sgRNA的菌株（图2B）。推测下游基因抑制会诱导CadA表达，Image Lab软件评估的相对蛋白量较BJA菌株最高达2.8至6倍（原文表2）。

共转化pSUA-J23105-CadA与不同基因抑制质粒于BL21(DE3)中的体内DAP产生。(A) 8株工程菌株在27 h培养期间的生物量。在3 h时添加50 g/L赖氨酸和10 μM PLP（以红色箭头指示）。(B) 全细胞CadA蛋白表达 — ▲ 共转化pSUA-J23105-CadA与不同基因抑制质粒于BL21(DE3)中的体内DAP产生。(A) 8株工程菌株在27 h培养期间的生物量。在3 h时添加50 g/L赖氨酸和10 μM PLP（以红色箭头指示）。(B) 全细胞CadA蛋白表达

重组蛋白表达是耗能过程，解除尸胺降解基因的调控后代谢流可能被重新导向。例如，puuA反应消耗ATP，ygjG反应消耗PLP，因此调控这些基因可节省能量用于重组蛋白表达。大多数CRISPRi介导的菌株平均赖氨酸消耗率为40%至50%，27 h时尸胺浓度约为20 g/L（图2C）。值得注意的是，BJAiY在15 h时消耗赖氨酸较少但尸胺浓度更高。结果表明speE、puuA和speG的抑制效率较低，这些基因已被报道为尸胺的间接代谢途径。然而，ygjG抑制对尸胺产量提升最为显著——BJAiY在27 h产尸胺22.5 g/L，BJAiGY产21.5 g/L，BJAiEPGY产20.7 g/L（图2C）。

通过共转化pSIT-T7-CadA和不同基因抑制质粒在BL21(DE3)中的体内DAP产量。在3小时时添加50 g/L赖氨酸、10 μM PLP和0.1 mM IPTG。在12小时时分析全细胞蛋白。(A) 8株工程菌在27小时培养时间内的生物量。(B) 全 — ▲ 通过共转化pSIT-T7-CadA和不同基因抑制质粒在BL21(DE3)中的体内DAP产量。在3小时时添加50 g/L赖氨酸、10 μM PLP和0.1 mM IPTG。在12小时时分析全细胞蛋白。(A) 8株工程菌在27小时培养时间内的生物量。(B) 全

另一方面，T7启动子驱动的CadA在CRISPRi菌株中的生物量（图3A）和蛋白表达（图3B）与J23105启动子不同。单基因抑制菌株生长较慢但CadA表达量高于多基因抑制菌株（如BT7AiEPGY）（图3B）。多基因抑制菌株（BT7AiGY、BT7AiPGY和BT7AiEPGY）在dCas9多靶点结合染色体的压力下表现出更多复杂蛋白表达，推测消耗更多能量，对尸胺生产产生负面影响。结果显示，所有单基因抑制菌株的赖氨酸消耗率在15 h时升至70%（图3C）。BT7AiG和BT7AiY菌株的尸胺产量最高，27 h时较BT7A（虚线标示）分别增加3和4 g/L，达到37–38 g/L（图3C）。

据报道，0.2 M尸胺（即29 g/L）会影响细胞生长。双质粒生产菌株的生长速率中观察到了这一现象。3 h添加底物和诱导剂后，尸胺开始产生，9 h后细胞密度下降。这表明细胞生长不仅受dCas9蛋白影响，还受尸胺产物毒性影响。诱导型T7系统中，高蛋白量加速了赖氨酸向尸胺的转化，在27 h达到饱和。尸胺积累促进其分泌至胞外，削弱了基因敲低效应。与T7系统相反，弱启动子系统减缓了转化速率，能够更清晰地追踪抑制效应。由于ygjG在大肠杆菌K12中过表达时能以较高程度转氨化尸胺，本研究证明靶向ygjG的CRISPRi菌株能有效减缓尸胺的直接降解。

The PLP effect in different gene repression by CRISPRi plasmids for in vivo lysine consumption and DAP production in BL21(DE3) and W3110::L5. Three different PLP concentrations were tested including 2.5, 10 and 20 μM. The 50 g/L lysine and 0.1 mM IPTG were added at 3 h. (A, B) Lysine consumption and — ▲ The PLP effect in different gene repression by CRISPRi plasmids for in vivo lysine consumption and DAP production in BL21(DE3) and W3110::L5. Three different PLP concentrations were tested including 2.5, 10 and 20 μM. The 50 g/L lysine and 0.1 mM IPTG were added at 3 h. (A, B) Lysine consumption and

【数据】赖氨酸消耗率（单基因抑制，15 h）：70%；DAP产量（BT7AiG/BT7AiY，27 h）：37–38 g/L；较BT7A增量：3–4 g/L；BJAiY（27 h）：22.5 g/L；BJAiGY：21.5 g/L；BJAiEPGY：20.7 g/L；相对蛋白量：2.8–6倍；细胞生长抑制阈值：0.2 M（29 g/L）DAP

CRISPRi调控菌株中PLP浓度的优化

磷酸吡哆醛（PLP）是脱羧、转氨、消旋等反应的关键辅因子。在赖氨酸脱羧反应中，PLP是维持CadA活性的关键辅因子。据报道，大肠杆菌W3110对尸胺、腐胺等不同化学物质具有更高耐受性。然而，所有大肠杆菌菌株的天然PLP含量极低，因此需要额外添加PLP。由于ygjG抑制菌株效果最佳，研究比较了BL21(DE3)和W3110::L5中ygjG敲低菌株在不同PLP浓度下的表现。B和W菌株在PLP效应下赖氨酸消耗和尸胺生产的差异总结于图4。热图展示了所有菌株在时间进程中的赖氨酸消耗和尸胺浓度变化。所有反应在6至12 h间变化迅速，24 h达到饱和。

菌株BT7A和BT7AiY在2.5 μM PLP条件下，24 h赖氨酸消耗率分别达到79%和83%；10 μM PLP时消耗率加速至94%和96%。赖氨酸消耗随PLP浓度升高而增强；仅BT7AiY菌株在PLP浓度提高至20 μM时，12 h即可达到96%消耗率（图4A）。多基因抑制菌株（BT7AiGY、BT7AiPGY和BT7AiEPGY）在10 μM PLP条件下24 h的赖氨酸消耗率相似但低于单基因抑制菌株（图4A）。为解决这一问题，将PLP提高至20 μM，菌株BT7AiGY、BT7AiPGY和BT7AiEPGY在24 h的赖氨酸消耗率分别达到91%、85%和90%。简言之，多基因抑制菌株需要更多PLP和更长时间才能达到相同的赖氨酸消耗水平。最终，菌株BT7AiY的赖氨酸消耗率高于其他菌株，在10 μM PLP条件下24 h尸胺浓度达到40 g/L（图4C）。

The effect of lysine concentration and supplying time in the in vivo DAP production by strain BT7AiY. (A) The lysine, PLP and IPTG were added simultaneously at 3 h and further cultured to 27 h. (B) The IPTG was added at 3 h while lysine and PLP were supplied by extending 12 h after IPTG (i.e., 15 h — ▲ The effect of lysine concentration and supplying time in the in vivo DAP production by strain BT7AiY. (A) The lysine, PLP and IPTG were added simultaneously at 3 h and further cultured to 27 h. (B) The IPTG was added at 3 h while lysine and PLP were supplied by extending 12 h after IPTG (i.e., 15 h

【数据】BT7A赖氨酸消耗率（2.5 μM PLP，24 h）：79%；BT7AiY：83%；10 μM PLP时：94%和96%；BT7AiY（20 μM PLP，12 h）：96%；BT7AiGY/BT7AiPGY/BT7AiEPGY（20 μM PLP，24 h）：91%/85%/90%；BT7AiY最高DAP浓度：40 g/L（10 μM PLP，24 h）

基因敲除菌株的尸胺生产

携带pSIT-T7-CadA质粒的不同基因缺失BL21(DE3)菌株体内的DAP产量。在3 h时添加50 g/L赖氨酸、10 μM PLP和0.1 mM IPTG。图中显示了细胞干重（DCW，圆圈）、赖氨酸消耗量（空心柱）和DAP产量（实心柱）的结果。 — ▲ 携带pSIT-T7-CadA质粒的不同基因缺失BL21(DE3)菌株体内的DAP产量。在3 h时添加50 g/L赖氨酸、10 μM PLP和0.1 mM IPTG。图中显示了细胞干重（DCW，圆圈）、赖氨酸消耗量（空心柱）和DAP产量（实心柱）的结果。

【数据】原文未详述该图对应的具体数值

讨论与解读

本研究证实了CRISPRi介导的代谢流调控在大肠杆菌尸胺生产中的可行性，并与传统基因敲除进行了系统比较。单基因和多基因sgRNA对尸胺旁路途径基因的调控效果显示，ygjG基因的解除抑制对尸胺生产最为有利。然而，较高的尸胺产量会影响细胞生长，因此采用两阶段底物添加策略以维持较高的生物量来增强对尸胺的耐受性。CRISPRi对各基因的旁路抑制效率与4基因敲除一致，能有效阻断代谢流并精准提高尸胺积累。

编译者解读

本研究最值得关注的是CRISPRi与基因敲除在代谢工程中的效果一致性——这为快速筛选关键靶基因提供了低成本工具。ygjG作为直接转氨化尸胺的基因，其抑制效果显著优于其他三个间接代谢基因，提示代谢工程应优先靶向直接消耗途径。但CRISPRi菌株中dCas9蛋白毒性带来的生长负担不容忽视，多基因抑制时尤为明显。PLP作为CadA辅因子的浓度优化策略表明，辅因子供给往往是全细胞催化体系的隐性瓶颈。未来若能将CRISPRi与动态调控元件结合，有望在生长与生产之间找到更优平衡。

参考来源

期刊：Journal of Bioscience and Bioengineering, 2020

DOI: 10.1016/j.jbiosc.2020.07.013

DOI: 10.1016/j.jbiosc.2020.07.013

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