来源：Adaptive evolution and mechanism elucidation for ethanol tolerant Saccharomyces cerevisiae used in starch based biorefinery（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
高浓度乙醇发酵是淀粉基生物炼制中的关键环节，而酿酒酵母的乙醇耐受性直接决定发酵效率。本研究以递增的初始乙醇浓度为选择压力，对酿酒酵母CRD5HS进行适应性进化，成功筛选出性能优异的乙醇耐受菌株60-11。该菌株在300 g/L初始葡萄糖、高固形物玉米（30-40 wt%）和木薯（30-33 wt%）发酵中均表现出显著优于原始菌株的葡萄糖消耗和乙醇生产能力。全基因组重测序鉴定出205个基因中的504个有义突变，并实验验证PAM1基因与乙醇耐受性提升相关。
研究背景
作为化石燃料的替代品，来自可再生资源的生物燃料因可再生性和低碳排放而备受关注。在众多生物燃料中，生物乙醇凭借其优良性能、成熟的生产技术和广泛的原料来源，已成为目前唯一被广泛采用的化石燃料替代品，既可作为汽油添加剂，也可独立作为燃料使用。此外，生物乙醇还可通过脱水反应转化为生物乙烯，为传统石油基乙烯生产提供更可持续的替代方案。美国玉米乙醇技术温室气体生命周期分析表明，玉米乙醇的温室气体排放比汽油低39-43%。
根据原料类型，生物乙醇生产通常分为以糖质或淀粉质为原料的第一代乙醇和以木质纤维素生物质为原料的第二代乙醇。尽管第一代乙醇生产技术相对成熟，但仍有改进空间。在淀粉基生物炼制中，特别是高重力发酵条件下，获得乙醇耐受性强的酿酒酵母是实现高效乙醇生产的关键。然而，微生物对环境胁迫的耐受性通常涉及多条代谢途径和复杂的调控系统，通过理性的代谢工程改造来提升菌株鲁棒性往往较为困难。
研究方法
2.1 菌株、质粒、引物、试剂与培养基
酿酒酵母CRD5HS（由S. cerevisiae ATCC26603经遗传修饰获得）作为适应性进化的原始菌株。大肠杆菌DH5用于质粒构建。本研究所用质粒和引物列于补充表S1和S2。LB培养基（酵母提取物10 g/L、蛋白胨5 g/L、NaCl 10 g/L）用于大肠杆菌常规培养。YPD20培养基（酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L）用于酿酒酵母常规培养。YPD50培养基（酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖50 g/L）中添加递增剂量乙醇用于酿酒酵母适应性进化。酵母提取物和蛋白胨购自Oxoid公司。基因组DNA提取、质粒DNA提取和DNA纯化等分子生物学试剂盒购自Axygen Scientific, Inc.。PCR用KOD DNA聚合酶和核苷酸片段组装用ClonExpress® II One试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific。本研究所用玉米籽粒和木薯块茎分别于2023年10月采自中国安徽省和广西壮族自治区的农场。玉米籽粒直接研磨至100目粒径用于乙醇发酵。新鲜木薯经清洗、去皮、60°C干燥至恒重后，研磨至100目粒径用于乙醇发酵。
【数据】培养基配方：LB（酵母提取物10 g/L、蛋白胨5 g/L、NaCl 10 g/L）；YPD20（酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L）；YPD50（酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖50 g/L）；原料粒径：100目；干燥温度：60°C
2.2 不同初始乙醇浓度下酿酒酵母发酵能力测试
为考察乙醇对酿酒酵母发酵性能的不利影响，将酿酒酵母CRD5HS培养在补充了20、40、50、60或80 g/L初始乙醇的YPD50培养基中。具体操作：将制备好的酿酒酵母CRD5HS种子液以初始OD600为1.0接种至上述含乙醇培养基中，于30°C、150 rpm条件下培养24 h。发酵在含30 g培养基的50 mL摇瓶中进行。为维持乙醇生产的厌氧环境，摇瓶用橡胶塞密封。用注射器针头刺穿橡胶塞以释放发酵过程中产生的CO₂。每3 h取样一次，测定OD600值、残余葡萄糖和产生的乙醇。
【数据】初始乙醇浓度：20、40、50、60、80 g/L；初始OD600：1.0；温度：30°C；转速：150 rpm；时间：24 h；培养基量：30 g/50 mL摇瓶；取样间隔：3 h
2.3 递增初始乙醇浓度下酿酒酵母的适应性进化
适应性进化通过将原始酿酒酵母CRD5HS培养在补充了递增乙醇含量（从40 g/L到60 g/L）的YPD50培养基中进行。具体操作：将新鲜酿酒酵母CRD5HS细胞以初始OD600为1.0接种至YPD50E40液体培养基（即YPD50培养基中添加40 g/L乙醇）。随后，接种后的培养液在30°C、150 rpm条件下厌氧培养，每12 h间隔测定OD600值。当OD600值达到约10-12时，培养液在4°C、4000 rpm条件下离心。收集的细胞用无菌生理盐水（含9 g/L氯化钠）洗涤后，以初始OD600为1.0接种至不含乙醇的YPD50液体培养基中进行培养。此步骤用于缓解高乙醇含量连续培养带来的累积胁迫。在不含乙醇的YPD50培养基中培养的酿酒酵母细胞随后重新接种至YPD50E40培养基中进行培养。当酵母在YPD50E40培养基中的生长速率不再增加时，40 g/L初始乙醇的适应性进化即告终止。此后，将获得的细胞转移至YPD50E42培养基中，启动新一轮适应性进化。在适应性进化过程中，每轮培养均测定OD600值、残余葡萄糖、产生的乙醇和产生的甘油。当某一阶段的进化终止时，获得的细胞在-80°C下保存以备后续进化。
【数据】初始乙醇浓度范围：40-60 g/L；初始OD600：1.0；温度：30°C；转速：150 rpm；OD600检测间隔：12 h；离心条件：4°C、4000 rpm；生理盐水：9 g/L NaCl；保藏温度：-80°C
2.4 适应性进化过程中获得的细胞的发酵测试
为评估所设计的适应性进化策略的有效性并获取高乙醇耐受性酵母细胞，从YPD50E50和YPD50E60培养基中进化后获得的细胞中选取30个大型菌落，测试其在YPD300培养基中的乙醇生产能力。具体操作：将-80°C保藏的细胞在YPD20液体培养基中于30°C、150 rpm条件下复苏12 h，然后将复苏的细胞稀释并涂布于YPD20固体培养基上。静置培养2天后，选取30个大型菌落制备种子液用于后续发酵测试。发酵测试在30°C、150 rpm条件下进行，初始OD600值为1.0。分别在72 h、96 h和120 h时各取1 mL培养液，测定OD600值、残余葡萄糖、产生的乙醇和产生的甘油。
【数据】菌落筛选数量：30个；复苏条件：YPD20液体培养基、30°C、150 rpm、12 h；固体培养：2天；发酵条件：30°C、150 rpm、初始OD600 1.0；取样时间点：72、96、120 h；取样量：1 mL
2.5 不同固形物含量的玉米和木薯乙醇发酵
为评估所获得的乙醇耐受酵母在实际乙醇工业中的应用潜力，分别以玉米和木薯为原料，在高于30 wt%的固形物含量下测试原始菌株和进化菌株60-11的发酵能力。添加的玉米粉和水分别按以下公式计算：添加玉米粉 =（总重量 × 玉米粉固形物含量）/（100% – 玉米粉含水量）；添加水 = 总重量 – 添加玉米粉。液化在85°C、150 rpm条件下进行4 h，α-淀粉酶剂量为添加玉米粉干重的0.016 wt%。液化过程中，系统pH维持在约5.7。液化后，对玉米粉进行同步糖化发酵。具体操作：将糖化酶按添加玉米粉干重的0.08 wt%的剂量加入液化体系中，尿素按发酵系统重量的1.2 g/kg的剂量加入液化体系中。随后，将发酵系统调节至pH约4.7，以初始OD600为1.0接种酵母细胞启动发酵。整个发酵过程在30°C、150 rpm条件下维持120 h，期间在0 h、4 h、16 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h取样，测定残余葡萄糖、产生的乙醇和产生的甘油。以木薯为原料的乙醇发酵在30 wt%和35 wt%两个固形物含量下进行，操作程序与上述玉米乙醇工艺相同。上述玉米和木薯乙醇发酵过程设三个重复，相关数据以三个生物学重复的平均值±SD表示。
【数据】固形物含量：玉米30、33、35、40 wt%；木薯30、35 wt%；液化条件：85°C、150 rpm、4 h、pH 5.7；α-淀粉酶剂量：0.016 wt%（基于玉米粉干重）；糖化酶剂量：0.08 wt%（基于玉米粉干重）；尿素剂量：1.2 g/kg（基于发酵系统重量）；发酵pH：4.7；初始OD600：1.0；发酵条件：30°C、150 rpm、120 h；取样时间点：0、4、16、24、48、72、96、120 h；重复数：3
2.6 全基因组重测序
为揭示进化菌株乙醇耐受性增强的潜在机制，对其基因组进行重测序，并与原始菌株的基因组进行比较。全基因组重测序由上海生工生物技术有限公司完成，主要流程如下：取1 μg经提取和质量验证的基因组DNA用于构建双端文库，然后使用Illumina Hiseq平台进行测序。获得的测序数据首先进行质量处理，合格数据随后使用Wheeler Alignment tool（BWA）与参考基因组进行比对。初始比对输出转换为配套二进制形式（BAM）格式，并使用Sequence Alignment/Map（SAM）工具过滤未比对上的reads。使用Genome Analysis Toolkit（GATK）软件检测变异（SNP，单核苷酸多态性和InDels，插入缺失），使用SnpEff软件对基因组变异进行注释和分类。进化菌株的原始基因组重测序数据已在……
【数据】测序平台：Illumina Hiseq；基因组DNA用量：1 μg；分析工具：BWA、SAM tools、GATK、SnpEff
研究结果
3.1 乙醇耐受酿酒酵母的适应性进化设计
适应性进化是一种可行且有效的获得目标表型的方法，无需繁琐的人工遗传改造，前提是采用适当的胁迫和筛选方法。初始阶段，研究尝试将酵母细胞转接至补充了70 g/L初始乙醇的YPD100培养基中（预期获得约120 g/L最终乙醇滴度以满足工业生产要求），然后逐步增加补充乙醇的含量。然而，酵母细胞在3轮转接后几乎失去活力，这可能归因于乙醇诱导的累积胁迫。前期研究表明，乙醇处理提高了活性氧的生成速率，产生的氧化胁迫对细胞造成累积损伤。类似事件也可能发生在酿酒酵母——这一最广泛使用的乙醇生产菌株中。尽管原始酿酒酵母菌株在第一轮培养中存活良好，96 h发酵后获得约120 g/L乙醇（70 g/L初始乙醇和50 g/L产生的乙醇），但在第二轮培养中获得的乙醇滴度降至约105 g/L，第三轮培养中急剧下降至80 g/L。换言之，扣除初始添加的70 g/L，第三轮培养中仅产生约10 g/L乙醇。这意味着累积胁迫几乎抑制了所用酿酒酵母的全部代谢活动。因此，通过在70 g/L乙醇中连续转接进行酿酒酵母适应性进化是不可行的。
为设计合适的适应性进化方法，系统考察了0、20、40、50、60、80 g/L初始乙醇对酿酒酵母的影响。如图1a所示，添加20 g/L乙醇足以显著延长延迟期。当初始添加乙醇增加时，所测酿酒酵母的葡萄糖消耗速率和乙醇产率除延迟期延长外均显著降低（图1b）。推测乙醇产率受损主要是因为酵母细胞需要消耗大量葡萄糖来抵抗乙醇引起的毒性。这有点出乎意料——该菌株可以产生>120 g/L乙醇，而初始仅补充20 g/L乙醇就导致发酵能力下降。研究认为，高乙醇滴度的产生主要归因于细胞逐渐适应了升高的乙醇浓度。据报道，微生物对环境胁迫的耐受性通常涉及多条代谢途径和复杂的调控系统，因此通过理性代谢工程提高微生物的鲁棒性通常较为困难。
【数据】初始乙醇浓度：0、20、40、50、60、80 g/L；第一轮发酵乙醇：约120 g/L（70 g/L初始+50 g/L产生）；第二轮乙醇滴度：约105 g/L；第三轮乙醇滴度：约80 g/L（仅约10 g/L为产生）
3.2 乙醇耐受酿酒酵母的适应性进化实施
为避免高浓度乙醇引起的累积效应，研究修改了适应性进化程序，具体如下：1. 初始补充乙醇降至40 g/L；2. 为避免连续乙醇胁迫造成的累积损伤，对酵母细胞采用间歇式进化策略。具体而言，酵母细胞首先在补充乙醇的YPD50培养基中培养，当细胞达到设定的OD600值后，将其转移至不含任何补充乙醇的新鲜YPD50培养基中恢复活性（图1c）。如图2所示，新设计的适应性进化策略按计划实施，初始乙醇浓度从40 g/L逐步提高至60 g/L。
为进一步验证所设计适应性进化策略的有效性，选取三个阶段的酵母细胞评估进化效果：初始阶段的酵母细胞、40-50 g/L乙醇进化后的酵母细胞和40-60 g/L乙醇进化后的酵母细胞。将这三个阶段取出的培养液稀释并涂布于YPD固体培养基上获得单菌落。然后，每个阶段随机选取30个大型菌落，接种至含300 g/L葡萄糖的YPD液体培养基中培养。如图3所示，初始阶段细胞和40-50 g/L乙醇进化后的细胞在72 h、96 h和120 h的细胞生长、消耗葡萄糖、产生的乙醇和产生的甘油方面均未观察到显著变化。这表明40-50 g/L乙醇未提供足够的压力使有义突变从细胞群体中脱颖而出。然而，细胞在50-60 g/L初始乙醇中进一步进化后发生了显著变化。具体而言，这些细胞在72 h、96 h和120 h的细胞生长、葡萄糖消耗和乙醇产量均显著增加。在从50-60 g/L乙醇中进化出的三十个菌落中，命名为60-11的分离菌株表现出最佳的乙醇生产性能。在300 g/L初始葡萄糖条件下，菌株60-11达到最大OD600值13.4，并表现出高效的葡萄糖利用能力，残余葡萄糖浓度为23.88 g/L。120 h发酵后，菌株60-11产生135.96 g/L的最终乙醇浓度，是所有分离菌株中最高的。因此，选择菌株60-11进行后续测试。
为评估菌株60-11的稳定性，将该菌株在不添加乙醇的YPD培养基中培养并转接10次。然后，将培养液稀释并涂布于YPD固体培养基上获得单菌落。选取3个菌落评估其在含300 g/L葡萄糖的YPD液体培养基中的发酵性能。结果显示，细胞生长和葡萄糖消耗速率与适应性进化阶段测得的结果相似。这三个菌落的乙醇产量保持在135-138 g/L之间。这些结果表明，菌株60-11进化获得的乙醇耐受性在遗传上是稳定的。
【数据】进化阶段：初始、40-50 g/L、40-60 g/L乙醇；每阶段筛选菌落数：30个；初始葡萄糖：300 g/L；菌株60-11最大OD600：13.4；残余葡萄糖：23.88 g/L；最终乙醇浓度：135.96 g/L（120 h）；稳定性测试转接次数：10次；稳定性测试乙醇产量：135-138 g/L
3.3 原始菌株与进化菌株在高初始葡萄糖条件下的比较
原始CRD5HS菌株和进化菌株60-11首先在含高初始葡萄糖的YPD培养基中培养。如图4所示，虽然在200-260 g/L初始葡萄糖条件下发酵时最终产生的乙醇没有显著变化，但进化菌株60-11的葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率均高于原始菌株（图4a-4d）。当初始葡萄糖浓度提高至280 g/L时，进化菌株60-11在48 h内消耗完所有280 g/L葡萄糖，而原始菌株未能消耗完280 g/L葡萄糖，48 h时培养液中有23.11 g/L残余葡萄糖。未发酵的葡萄糖是原始酿酒酵母能力不足的结果。当初始葡萄糖浓度进一步增加至300 g/L时，两种菌株的葡萄糖消耗差异更加明显。具体而言，72 h时原始菌株培养液中有41.51 g/L残余葡萄糖，而进化菌株仅为8.81 g/L（图4f）。可以得出结论，300 g/L初始葡萄糖确实对原始菌株和进化菌株都产生了极端胁迫。在这种条件下，酿酒酵母细胞面临两种主要胁迫：培养早期高含量葡萄糖带来的高渗透压和整个培养过程中产生的乙醇的毒性压力。当初始葡萄糖浓度在200-260 g/L之间时，原始菌株和进化菌株的最终乙醇滴度没有显著差异，尽管它们的葡萄糖消耗……
【数据】初始葡萄糖浓度：200-280 g/L；280 g/L条件下48 h残余葡萄糖（原始菌株）：23.11 g/L；300 g/L条件下72 h残余葡萄糖（原始菌株）：41.51 g/L；（进化菌株）：8.81 g/L
讨论与解读
本研究通过适应性实验室进化成功获得了乙醇耐受性显著提升的酿酒酵母菌株60-11。在高重力发酵条件下，该菌株展现出优于原始菌株的葡萄糖消耗速率和乙醇生产效率。全基因组重测序鉴定出205个基因中的504个有义突变，其中PAM1基因经实验验证与乙醇耐受性相关。该研究为获得高乙醇耐受性菌株提供了实用方法，并加深了对乙醇耐受机制的理解。
编译者解读
本研究亮点在于采用"间歇式"适应性进化策略——在含乙醇培养基与无乙醇培养基之间交替培养，有效避免了高浓度乙醇连续胁迫导致的累积损伤，这是进化方案设计的关键创新。相比直接转接于高浓度乙醇的失败尝试，该策略更贴近工业发酵中细胞实际经历的"胁迫-恢复"循环。PAM1基因的鉴定为理性代谢工程改造提供了明确靶点。值得关注的是，进化菌株在300 g/L初始葡萄糖下的残余葡萄糖从41.51 g/L降至8.81 g/L，这一改善幅度在实际工业高浓度发酵中具有切实的经济价值。然而，研究未详细探讨PAM1基因调控乙醇耐受性的具体分子机制，后续工作可围绕该基因的上下游调控网络展开。
参考来源
Xu Z. Adaptive evolution and mechanism elucidation for ethanol tolerant Saccharomyces cerevisiae used in starch based biorefinery. International Journal of Biological Macromolecules, 2025. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.138155
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.138155