来源：Directed evolution of the transcription factor Gal4 for development of an improved transcriptional regulation system in Saccharomyces cerevisiae（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
酿酒酵母的GAL调控系统是合成生物学中最常用的诱导表达工具之一，但天然Gal4蛋白活性有限，在多基因通路表达时往往出现诱导不足的问题。本研究通过类胡萝卜素指示的高通量筛选方法，对Gal4进行定向进化，获得活性显著提升的突变体Gal4T406A/V413A，使番茄红素产量较野生型提高48%。该工作不仅提供了更高效的转录调控元件，还揭示了Gal4中段同源区（MHR）对转录激活功能的重要贡献。
研究背景
酿酒酵母作为模式真核生物，已被广泛用于构建生产药物、燃料和大宗化学品的细胞工厂。合成复杂产物通常需要引入多个异源基因，如何增强多基因通路的代谢流成为高效生物合成的关键。常用的策略包括调整基因拷贝数和调控启动子强度。组成型表达虽能提供充足酶量，但持续积累异源蛋白会给微生物生长带来代谢负担，诱导型启动子因此更具优势。
酿酒酵母中已鉴定出多种天然诱导型启动子，其中半乳糖依赖的GAL调控系统研究最为深入、调控最为严密。该系统由转录激活因子Gal4和抑制因子Gal80共同调控GAL1/2/7/10启动子。然而，当多个基因同时受GAL启动子控制时，天然Gal4的表达水平和活性不足以实现强诱导，限制了该系统的应用。本研究旨在通过定向进化改造Gal4，获得活性增强的突变体，从而提升多基因通路的表达效率。
研究方法
2.1 菌株、培养基与化学试剂
所有重组质粒在大肠杆菌DH5α中扩增。含质粒的大肠杆菌菌株在含100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中于37°C过夜培养。以酿酒酵母BY4741为出发菌株构建的Ylyc-TS0作为Gal4突变体文库构建和突变体验证的宿主菌。YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2% D-葡萄糖）用于酵母常规培养。含200 μg/mL遗传霉素（G418）的YPD培养基用于筛选含KanMX标记的酿酒酵母转化子。缺尿嘧啶的合成 dropout 培养基（SD-URA-）用于筛选和培养携带URA3营养缺陷标记质粒的转化子。酵母提取物粉末和蛋白胨购自安琪酵母（宜昌，中国）。抗生素、酵母基因组DNA提取试剂盒和酵母质粒提取试剂盒购自生工生物（上海，中国）。限制性内切酶、T4 DNA连接酶和PrimeSTAR HS DNA聚合酶购自Takara（大连，中国）。质粒小提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen Biosciences（美国加州Union City）。其他化学试剂均购自阿拉丁（上海，中国）。本研究所用菌株列于表1。
【数据】培养基：LB（氨苄青霉素100 μg/mL或卡那霉素50 μg/mL）、YPD（1%酵母提取物/2%蛋白胨/2%葡萄糖）、YPD+G418（200 μg/mL）、SD-URA-；温度：37°C（大肠杆菌）、30°C（酵母）；试剂来源：安琪酵母、生工生物、Takara、Axygen、阿拉丁
2.2 Gal4的定向进化
GAL4结构基因（2646 bp）分为两个片段：N端半段（1–1321 bp）和C端半段（1200–2646 bp）。通过分别或同时对这两个片段进行易错PCR，构建了三个GAL4随机突变文库。
第一个突变文库以P416XWP-PCYC1-GAL4质粒为模板，用引物PCYC1F2和Gal4-DR1对N端GAL4（1–1321 bp）进行易错PCR，PCR产物与Not I/Sal I消化的P416XWP-PCYC1-GAL4共转化至Ylyc-TS0宿主菌。第二个突变文库以P416XWP-PCYC1-GAL4质粒为模板，用引物Gal4-DF2和TPGK1R2对C端GAL4（1200–2646 bp）进行易错PCR，PCR产物与Sal I/Sac I消化的P416XWP-PCYC1-GAL4共转化至Ylyc-TS0。第三个突变文库通过将N端和C端易错PCR产物与Not I/Sac I消化的P416XWP-PCYC1-GAL4共同转化至Ylyc-TS0构建。
在SD-URA-平板上于30°C培养三天后，挑取颜色加深的菌落，点接到新的SD-URA-平板进行进一步验证。从酿酒酵母中提取含推定的阳性突变体的质粒，在大肠杆菌DH5α中扩增，随后送生工生物（上海，中国）进行DNA测序。
为构建含Gal4突变体的整合质粒，将Not I和Sac I消化的Gal4突变体克隆至PUMRI-PERG9-GAL4，生成PUMRI-PERG9-GAL4（突变体）。这些质粒经Sfi I线性化后，采用LiAc/SS carrier DNA/PEG法[28]整合至酵母基因组。本研究所用质粒和引物（由生工生物合成，上海，中国）列于表1和表S1。
【数据】GAL4基因长度：2646 bp；N端片段：1–1321 bp；C端片段：1200–2646 bp；筛选温度：30°C；培养时间：3天；限制性内切酶：Not I、Sal I、Sac I、Sfi I；整合方法：LiAc/SS carrier DNA/PEG法
2.3 实时荧光定量PCR分析
使用RNAiso Plus Kit（Takara，大连，中国）从酿酒酵母中提取总RNA。使用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，大连，中国）同时进行RNA样品中基因组DNA消除和逆转录。定量PCR（qPCR）采用SYBR® Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）（Takara，大连，中国），在ABI StepOnePlus Real-Time PCR System（Applied Biosystems® Inc.，美国加州Foster City）上进行。以ACT1作为内参基因对不同样品进行归一化。mRNA转录水平采用2−△△CT法[29]计算。qPCR所用引物列于表S1。
【数据】内参基因：ACT1；计算方法：2−△△CT法；仪器：ABI StepOnePlus Real-Time PCR System；试剂：RNAiso Plus Kit、PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR® Premix Ex Taq™ II
2.4 流式细胞分析
为定量分析荧光强度，携带EGFP基因的酵母菌株在YPD培养基中培养24小时。收集1 mL细胞，离心后用磷酸盐缓冲液（PBS，100 mM，pH = 7.4）洗涤两次。随后用PBS将细胞稀释至OD600为0.2。使用FACS Calibur流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）进行荧光测量。每个样品记录20,000个门控细胞。所有数据使用FlowJo软件（FlowJo, LLC）处理和分析。
【数据】培养时间：24h；培养基：YPD；PBS浓度：100 mM，pH=7.4；OD600：0.2；仪器：FACS Calibur流式细胞仪；每样品细胞数：20,000；软件：FlowJo
2.5 Western blot分析
使用酵母蛋白提取试剂（Takara）从酵母细胞中提取总蛋白。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的蛋白条带通过湿转系统转移至0.45 μm Immobilon-P转移膜（Merck Millipore，爱尔兰）。随后，膜在含0.2% Tween-20的PBS缓冲液（PBST）中的5%脱脂奶粉中封闭2小时。然后，膜与1:2000稀释的小鼠抗His-tag单克隆抗体（Proteintech Group，美国芝加哥）或1:3000稀释的兔单克隆抗tubulin抗体（abcam，英国）作为上样对照孵育2小时。膜用PBST洗涤五次后，使用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗。蛋白最终通过增强化学发光法（ECL；Vazyme，南京，中国）在Tanon-5200化学发光检测系统（Tanon Science and Technology，上海，中国）中显影。条带强度使用Gel Image system ver.4.00（GIS 1D）软件（Tanon Science and Technology，上海，中国）分析。
【数据】转移膜：0.45 μm Immobilon-P；封闭：5%脱脂奶粉PBST，2h；一抗：1:2000小鼠抗His-tag、1:3000兔抗tubulin；孵育时间：2h；洗涤：PBST×5次；检测：ECL+Tanon-5200；分析软件：GIS 1D ver.4.00
2.6 类胡萝卜素的提取与分析
类胡萝卜素用丙酮从HCl-热处理的细胞中提取，方法如前所述[18]。总类胡萝卜素用分光光度计在450 nm处测定，使用消光系数2500（A1% = 2500）[30]计算。
【数据】提取溶剂：丙酮；预处理：HCl-热处理；检测波长：450 nm；消光系数：A1% = 2500
研究结果
3.1 Gal4高转录激活能力突变体的创建与筛选
删除GAL80基因后，PGAL控制基因的转录完全由Gal4调控。基于此，我们开发了番茄红素指示的高通量筛选方法，用于定向进化Gal4以获得更高的转录激活能力。为避免Gal4过表达引起的细胞负担和颜色饱和，选择弱启动子PCYC1驱动GAL4基因表达（图2A）。先前报道的温度敏感型Gal4突变体工程靶标仅覆盖GAL4前半段序列（1321 bp），包括DNA结合域、第一个转录激活区和部分未预测区域[27]。对阳性突变位点的分析表明，未预测区域也可能在决定Gal4活性中发挥作用。因此，我们将全长GAL4作为定向进化的工程靶标以增强活性（图2B）。
三个文库共筛选了30,000个转化子。大多数菌落颜色未改变或变浅，有些甚至呈白色，特别是在靶向全长GAL4基因构建的文库中。相比之下，将GAL4基因分为两个片段分别进行定向进化时，产生了更多阳性突变体。三种靶向策略在初步筛选中各选出5个推定突变体，共15个突变体，其中仅5个在复筛中被确认为阳性突变体（MA-1、MA-2和MA-5来自文库I，MB-2来自文库II，MC-3来自文库II）（图3A和B）。这些Gal4突变体随后在较强的ERG9启动子控制下分别整合至Ylyc-TS0基因组中，番茄红素产量呈现不同程度的提高。最佳突变体MA-2和MA-5的类胡萝卜素产量分别比野生型Gal4高25.5%和23%（图3C）。
【数据】筛选转化子总数：30,000；初筛阳性突变体：15个；复筛确认阳性：5个（MA-1、MA-2、MA-5、MB-2、MC-3）；MA-2产量提升：25.5%；MA-5产量提升：23%；启动子：PCYC1（表达）、PERG9（整合）
3.2 单点突变对Gal4活性的影响
对从Gal4文库中筛选出的5个突变体进行测序，发现每个突变体含有1–3个突变位点。为评估每个突变对Gal4性能的影响，进行了单点定向突变。在总共9个突变位点中，6个有助于提高番茄红素产量，包括S6P、T406A、I407V、V413A、K459R和V586A（图4）。特别是T406A和I407V单点突变分别使类胡萝卜素产量提高23.7%和23.0%，优于其他突变位点。结果表明，406和407位点对Gal4活性的重要性高于其他突变位点。
有趣的是，6个阳性突变位点中有5个（T406A、I407V、V413A、K459R、V586A）位于两个激活域之间的中段同源区（MHR），该区域迄今尚未被赋予特定功能。序列比对表明，MHR是真菌锌簇转录因子中的常见基序，这些转录因子含有N端Gal4样C6锌双核簇DNA结合域[31]。因此，MHR的功能之一可能是协助C6锌簇识别靶序列[31]。先前关于Gal4功能的研究发现，改变MHR序列或删除Gal4中的MHR可降低Gal1-lacZ融合蛋白的表达[32,33]，并提示该区域内存在多个抑制域，可能影响Gal4对葡萄糖抑制的响应[33]。与这些研究一致，我们的结果进一步支持了MHR在Gal4活性中的重要性。此外，对MHR突变位点效应的定量比较将为今后Gal4结构-功能关系研究提供线索。
【数据】总突变位点：9个；阳性突变位点：6个（S6P、T406A、I407V、V413A、K459R、V586A）；T406A产量提升：23.7%；I407V产量提升：23.0%；MHR区域阳性突变：5/6个
3.3 组合突变提升Gal4活性
为获得活性最大化的Gal4突变体，基于定向进化筛选出的阳性突变位点（S6P、T406A、I407V、V413A、K459R、V586A）进行组合突变，生成15个双位点突变体（S6P/T406A、S6P/I407V、S6P/V413A、S6P/K459R、S6P/V586A、T406A/I407V、T406A/V413A、T406A/K459R、T406A/V586A、I407V/V413A、I407V/K459R、I407V/V586A、V413A/K459R、V413A/V586A、K459R/V586A）。其中，T406A/V413A突变体的番茄红素产量最高，比表达野生型Gal4的菌株高约48%（图5）。
尽管T406A和I407V在单点突变体中表现最佳，但双位点突变体T406A/I407V在激活番茄红素合成通路基因方面不如T406A/V413A突变体高效。携带T406A/K459R、I407V/K459R、I407V/V586A突变的Gal4变体的调控活性均低于T406A或I407V单点突变体。为减少组合数量，采用迭代组合突变策略[34]，将阳性单突变引入亲本酶以创建多位点突变体，以性能最佳的突变体作为下一轮突变的亲本。此处，以表现优异的Gal4T406A/V413A变体作为下一轮迭代组合突变的亲本，创建了4个含三个突变位点的变体（S6P/T406A/V413A、T406A/I407V/V413A、T406A/V413A/K459R和T406A/V413A/V586A）。这些突变体均未显示调控能力的进一步提升（图5B）。因此，选择Gal4T406A/V413A用于后续研究。
【数据】双位点突变体数量：15个；最佳双突变体：T406A/V413A（产量提升约48%）；三位点突变体：4个；T406A/I407V产量低于T406A/V413A；T406A/K459R、I407V/K459R、I407V/V586A活性低于相应单点突变体
3.4 Gal4T406A/V413A突变体的评估与表征
为进一步评估最佳Gal4变体（Gal4T406A/V413A）的效率，构建了将EGFP基因置于GAL启动子控制下的报告系统。流式细胞分析发现，YEGFP-Gal4T406A/V413A（在Gal4T406A/V413A控制下表达EGFP）中的细胞荧光比YEGFP-Gal4（在野生型Gal4控制下表达EGFP）高约33.4%（图S1）。最佳Gal4变体对多基因番茄红素合成通路的效应（提高48%）大于对单基因EGFP的效应，这可能归因于多个通路基因表达增强对产物积累的累积影响。
为验证Gal4突变体调控能力的提高确实源于活性变化而非表达水平变化，分别将GAL4和GAL4T406A/V413A整合至Ylyc-TS0菌株基因组中构建Ylyc-01和Ylyc-02菌株，并在摇瓶发酵过程中比较这两个菌株中GAL4基因的转录和翻译水平。携带野生型Gal4的细胞在12小时进入初始对数生长期，设为实时定量PCR（qPCR）的对照。GAL4T406A/V413A和GAL4的转录水平呈现相似趋势（图6A）。对融合his-tag的Gal4和Gal4T406A/V413A进行Western blot分析，经tubulin归一化后，Gal4和Gal4T406A/V413A的表达水平无显著差异（图6F）。如先前报道，两种情况下均检测到两条蛋白条带[20,35–37]，分别代表从第一个AUG上游和下游起始的GAL4 mRNA[35,36]。Gal4T406A/V413A与野生型Gal4相比转录和翻译水平均未改变，明确证实转录激活能力的提高应归因于Gal4活性的增强。
为评估Gal4T406A/V413A介导的调控系统在控制多基因通路基因表达中的效率，监测了分别由GAL10、GAL1、GAL2和GAL7启动子驱动的番茄红素通路基因crtE03M、crtI、crtYB11M和tHMG1在Ylyc-01和Ylyc-02菌株中的转录水平。
【数据】EGFP荧光提升：33.4%；番茄红素产量提升：48%；qPCR对照时间点：12h（初始对数生长期）；Western blot：两条蛋白条带，表达水平无显著差异；通路基因：crtE03M（GAL10启动子）、crtI（GAL1启动子）、crtYB11M（GAL2启动子）、tHMG1（GAL7启动子）
讨论与解读
尽管GAL调控系统在酿酒酵母基因表达中应用广泛，但其控制多基因生物合成通路的效率常受限于Gal4的低含量或低活性。本研究基于类胡萝卜素指示的高通量筛选方法，通过定向进化成功提高了Gal4活性。在通过定向进化、后续定点突变和组合突变创建的共29个Gal4突变体中，Gal4T406A/V413A在提高番茄红素产量方面表现最佳，较野生型Gal4提高约48%。PGAL驱动的番茄红素通路基因转录上调进一步验证了该蛋白开关Gal4T406A/V413A的活性提升。本工作证明了通过工程化Gal4活性来上调多基因表达是可行的。本研究鉴定的阳性突变位点可为Gal4的进一步工程化提供线索，所开发的Gal4突变体也可用于调控其他有价值产物的生物合成。
编译者解读：本研究的方法学亮点在于将代谢产物颜色与转录因子活性直接偶联，构建了"读得出"的高通量筛选体系——番茄红素的红色深浅直观反映Gal4激活能力，大幅降低了筛选成本。从应用角度看，Gal4T406A/V413A作为即插即用的转录强化元件，可直接替换现有GAL系统中的天然Gal4，有望提升类异戊二烯、脂肪酸等多种PGAL驱动产物的产量。值得注意的是，MHR区域5个阳性突变位点的发现为理解Gal4的结构-功能关系提供了新线索，也为后续基于理性的进一步改造指明了方向。不过，该突变体在其他菌株背景和发酵条件下的表现仍有待验证。
参考来源
Zhou P. Directed evolution of the transcription factor Gal4 for development of an improved transcriptional regulation system in Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology, 2020. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2020.109675
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2020.109675