来源：A novel directed evolution approach for co-evolution of β-glucosidase activity and organic acid tolerance（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
传统定向进化方法（易错PCR和DNA改组）在改造大基因时频繁遭遇负突变与回复突变，导致筛选效率低下。本研究提出两种创新技术——分段易错PCR（SEP）和定向DNA改组（DDS），利用酿酒酵母体内同源重组特性，将大基因分段突变后重新组装，实现了β-葡萄糖苷酶（16BGL）催化活性与有机酸耐受性的同步提升。研究获得的双重优化变体V123和V123–676Q在甲酸存在下仍保持高催化效率，为工业生物转化提供了有潜力的候选酶。
研究背景
化学合成工艺虽产品范围广泛，但常需苛刻反应条件、昂贵金属及危险试剂，与可持续发展理念相悖。相比之下，酶法合成更环保、更经济。自然界中经过长期进化的酶对天然底物催化效率高，但面对人工合成底物和严苛应用条件时往往力不从心。尽管深度学习等方法可设计自然界不存在的新型酶，但大规模应用尚属罕见；而针对活性位点附近氨基酸残基的理性设计虽取得巨大成功，仍存在局限。本研究针对大基因定向进化中负突变和回复突变频率高的痛点，开发了SEP与DDS组合策略，以β-葡萄糖苷酶为模型，探索酶活性与有机酸耐受性的协同进化。
研究方法
2.1 质粒pYAT22
pYAT22用于实现16BGL的组成型分泌表达。该质粒包含一个表达盒，由酿酒酵母TEF1启动子、酿酒酵母α因子信号肽、16bgl基因（GenBank登录号：MT741857）、组氨酸标签及ADH终止子组成。此外，pYAT22还含有2μ复制子和酿酒酵母ura3筛选标记，以及大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性基因。
【数据】质粒：pYAT22；启动子：TEF1；信号肽：α因子；基因：16bgl（MT741857）；标签：组氨酸；筛选标记：ura3（酿酒酵母）/氨苄青霉素（大肠杆菌）
2.2 引物与SEP
16bgl或其变体被平均分为三个部分：C1（或V1）、C2（或V2）和C3（或V3）。C代表16bgl片段，V代表16bgl变体的突变片段。所用引物用于扩增相应序列，详见表1。KOD-Plus-Neo（购自日本Toyobo公司）为高保真DNA聚合酶，用于DNA扩增。rTaq DNA聚合酶（购自日本Takara Bio公司）用于SEP。
SEP反应混合液组成如下：1 µL 10×PCR缓冲液、0.5 µL dNTP混合液、dCTP和dTTP各2 mM、每种引物0.3 µM、0.25 U rTaq DNA聚合酶、1–10 ng pYAT22（模板）、3.5 mM Mg²⁺、0.7 mM Mn²⁺。用ddH₂O补足至总体积10 µL。
PCR循环条件：94°C初始预变性2分钟；随后30个循环，每个循环包括94°C变性30秒、72°C退火（1 kb/min）、72°C终延伸10分钟。
【数据】SEP体系：10×PCR缓冲液1µL；dNTP混合液0.5µL；dCTP/dTTP各2mM；引物各0.3µM；rTaq DNA聚合酶0.25U；模板pYAT22 1–10ng；Mg²⁺ 3.5mM；Mn²⁺ 0.7mM；总体积10µL；PCR条件：94°C 2min预变性；30循环（94°C 30s，72°C 1kb/min，72°C 10min）
2.3 DDS与高通量筛选
16bgl被平均分为三个片段：靠近5'端的C1片段、中间位置的C2片段和邻近3'端的C3片段。使用KOD-Plus-Neo分别扩增C1、C3、C1-C2、C2-C3以及不含16bgl的pYAT22载体。V1、V2和V3通过SEP用rTaq DNA聚合酶扩增。PCR产物经Dpn I处理后，将60–120 ng纯化PCR产物通过醋酸锂-PEG法共转化至酿酒酵母BY4741中，涂布于不含尿嘧啶和葡萄糖、含15 mg/mL甲酸钠和0.5%水杨苷的SD平板上。平板在30°C培养48–60小时。
分别挑取V1-C2-C3、C1-V2-C3和C1-C2-V3的大阳性菌落，接种至含200 µL不含尿嘧啶的SD培养基的96孔板中。培养物在30°C培养60小时，10,000 rpm离心5分钟，上清液储存于4°C。取50 µL稀释上清液与100 mg/mL甲酸混合（最终甲酸浓度为10、15或20 mg/mL），37°C孵育1小时，随后加入2 mol/L NaOH调节pH，再加入溶于50 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 5）的0.1%水杨苷。混合物在96孔板中于50°C反应30分钟。随后加入100 µL DNS终止反应。反应混合物煮沸10分钟，冷却至室温。用酶标仪在540 nm处测定OD值。从第二轮筛选中选取OD值高的阳性变体，接种至25 mL不含尿嘧啶的SD培养基中，30°C培养48小时，10,000 g离心15分钟获取上清液。根据DNS法筛选具有高活性和高甲酸耐受性的变体。采用相同的克隆、表达和高通量筛选方法组装阳性变体的V1、V2和V3区域，构建并筛选V1-V2-V3阳性变体。
【数据】筛选平板：SD（缺尿嘧啶/葡萄糖）+15 mg/mL甲酸钠+0.5%水杨苷；培养：30°C 48–60h；96孔板培养：30°C 60h；离心：10,000rpm 5min；甲酸处理：10/15/20mg/mL，37°C 1h；酶反应：0.1%水杨苷，50°C 30min；DNS终止：煮沸10min；OD测定：540nm；二次培养：25mL SD，30°C 48h；离心：10,000g 15min
2.4 酶纯化
采用镍离子螯合磁珠（中国GenScript Biotech Corporation）纯化带有组氨酸标签的16BGL及其变体。粗酶液首先在含50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、pH 7.4的缓冲液中于4°C透析过夜。随后将磁珠分15等份加入透析后的粗酶液中，共计30 mL，于4°C、130 rpm摇动孵育1.5小时。为去除非特异性结合蛋白，用含40 mM咪唑、50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、pH 7.4的缓冲液洗涤磁珠。目标蛋白随后用含70 mM咪唑、50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、pH 7.4的缓冲液洗脱。最后，纯化蛋白通过50 mM磷酸盐缓冲液（pH 5.0）去除残留咪唑。
【数据】透析缓冲液：50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 7.4，4°C过夜；磁珠孵育：15等份共30mL，4°C，130rpm，1.5h；洗涤缓冲液：40mM咪唑，50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 7.4；洗脱缓冲液：70mM咪唑，50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 7.4；最终缓冲液：50mM磷酸盐，pH 5.0
2.5 酶活性测定、蛋白定量、最适温度与pH
酶活性测定：取50 µL稀释纯化酶加入450 µL含0.1%水杨苷或0.5%纤维二糖的50 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 5.0）中，50°C孵育30分钟。反应结束后立即加入500 µL DNS试剂终止反应。反应混合物在沸水中煮沸10分钟确保反应完全终止。在540 nm处测定吸光度（OD），重复三次。一个BGL活性单位定义为每分钟释放1 μmol相当于葡萄糖的还原糖所需的酶量。蛋白浓度采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白为标准。
最适温度测定：50 µL稀释纯化酶与50 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 5.0）中的0.1%水杨苷混合，在35至80°C的不同温度下孵育30分钟，采用DNS法测定各温度下的酶活性。
最适pH测定：50 µL稀释纯化酶与不同pH值（3−9）缓冲液中的0.1%水杨苷混合，在50°C孵育30分钟，采用DNS法测定各pH下的酶活性。
【数据】酶活测定：0.1%水杨苷/0.5%纤维二ose，50mM柠檬酸盐缓冲液（pH 5.0），50°C，30min；DNS终止：500µL，煮沸10min；OD：540nm，三次重复；蛋白定量：Bradford法，BSA标准；最适温度范围：35–80°C；最适pH范围：3–9
2.6 甲酸抑制动力学参数计算
纯化酶与10%甲酸在37°C孵育1小时。随后加入10 μL 2 mol/L NaOH调节pH至5.0。在不同水杨苷浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.5 mg/mL）和50°C条件下精确测定酶活性。采用Lineweaver-Burk双倒数作图，利用Michaelis-Menten方程（1）和非竞争性抑制方程（2）确定V_max、K_m和K_I。
方程（1）：1/V = 1/V_max + K_m/V_max × 1/S
方程（2）：1/V = 1/V_max(1 + [I]/K_I) + K_m/V_max(1 + [I]/K_I) × 1/S
【数据】甲酸处理：10%甲酸，37°C，1h；NaOH中和：10µL 2mol/L；底物浓度：0.2–1.5mg/mL水杨苷；反应温度：50°C；拟合模型：Michaelis-Menten方程+非竞争性抑制方程
2.7 三维结构模拟、分子对接与等电点计算
V123、V123–676Q和16BGL的三维结构通过AlphaFold2构建，它们与曲霉属BGL（PDB ID：5FJJ）的氨基酸序列一致性最高（70.3%）。这些结构有助于深入理解蛋白质的折叠和相互作用方式。随后，使用CB-DOCK2将蛋白质与底物水杨苷进行对接。PyMOL软件呈现的对接结果揭示了蛋白质与底物之间的相互作用模式，包括潜在结合位点和结合能。蛋白质等电点通过ProtParam在线平台计算。
【数据】模板：Aspergillus sp. BGL（PDB ID：5FJJ）；序列一致性：70.3%；建模工具：AlphaFold2；对接工具：CB-DOCK2；可视化：PyMOL；等电点计算：ProtParam
2.8 均方根波动计算
均方根波动（RMSF）通过CABS-flex 2.0进行近天然构象动力学模拟确定。PDB文件直接上传至CABS-flex 2.0服务器，使用默认设置。在线计算在……（原文截断）
【数据】模拟工具：CABS-flex 2.0；参数：默认设置
研究结果
3.1 理性设计与传统定向进化的失败
在进行SEP和DDS之前，研究团队通过将距离活性位点20 Å以上的非保守、非酸性表面氨基酸残基替换为Glu或Asp，构建了16BGL的多种变体（N386D、N394E、G467E、S541D、G652E、N655D、S680D、H718E和Q842E），以增加负表面电荷。此外，还鉴定了催化残基D261和E492附近形成氢键的氨基酸，并选择环上非对接位点且不带正电荷的氨基酸突变为正电荷氨基酸。根据PROPKA 3.1降低D261和E492 pKa的原理，在24个结合位点中确定了V55K、D73K、L122R、H171R、M226R、Y229K、W262R、G430H和S431K等位点并进行定点突变。
然而，这些理性设计均未能产生协同增强活性和有机酸耐受性的阳性变体，表明两种耐酸工程理论并非普遍适用。此外，团队花费一年时间对16BGL全区域进行易错PCR，仅获得变体L2–1-C12（K343E/D347E/I440N），其酶活性提高0.9倍，但在15或20 mg/mL甲酸条件下几乎完全失活。因此，团队开发了SEP与DDS相结合的杂交策略，利用酿酒酵母在35–50 bp同源片段内的天然同源重组克隆特性。
【数据】理性设计位点：N386D、N394E、G467E、S541D、G652E、N655D、S680D、H718E、Q842E；正电荷突变位点：V55K、D73K、L122R、H171R、M226R、Y229K、W262R、G430H、S431K；传统易错PCR结果：仅获L2–1-C12（K343E/D347E/I440N），活性提高0.9倍，15/20mg/mL甲酸下几乎失活
3.2 SEP和DDS的流程
SEP与DDS的定向进化旨在减轻负突变和回复突变的影响，同时促进有益突变的鉴定与整合。如图2所示，SEP包含两个关键步骤：将大基因平均分割为小片段；每个片段通过易错PCR独立突变；突变片段与未突变片段及线性化载体pYAT22共转化至酿酒酵母，在体内组装形成完整基因。
相比之下，DDS（图2）包含三个互补步骤：通过高通量筛选鉴定SEP产生的有益变体；特异性扩增携带有利突变的片段；将携带有益突变的扩增片段与线性化载体pYAT22共转化至酿酒酵母，在体内组装生成含正突变的全长基因。
SEP可能降低了负突变影响整个基因的概率，与传统易错PCR相比确实具有更大的筛选覆盖范围；而DDS可能促进了有益突变高效整合至最终组装基因中，无需DNase I消化和无引物PCR，简化了流程。传统易错PCR方法常受高频率负突变阻碍，尤其在大基因中更为突出。本研究整合SEP和DDS的新策略，通过聚焦较小基因片段并选择性组装正突变来解决这一问题。与传统定向进化方法相比，该方法不仅可能减少有害突变和回复突变的发生，还简化了筛选和表达流程，可能提高了定向进化的整体效率和成功率。
为验证该组合策略的优越性，研究以16BGL酶活性和有机酸耐受性的协同进化为案例进行了验证。
3.3 V1-C2-C3仅获得同义突变
研究将酿酒酵母的生长与16BGL的酶活性偶联。16BGL水解水杨苷产生葡萄糖，作为酿酒酵母在水杨苷平板上生长的唯一碳源。只有含有16BGL或阳性变体的酿酒酵母才能在水杨苷平板上良好生长。酿酒酵母菌落越大，变体活性越高。
表2的测序结果表明，SEP的16BGL突变率为2.44至7.32‰。在V1-C2-C3变体文库中，从培养平板精心挑选约1000个大菌落，转移至96孔板和摇瓶进行进一步鉴定。通过基于DNS试剂显色反应的严格筛选，阴性变体被有效排除，33个变体表现出与16BGL相当的活性。随后，随机选取V1–3-C9、V1–6-C12、V1–1-E1、V1–35-F7和V1–31-E12，均呈现同义突变（表2）。此外，随机选取的3个小菌落V1–7-B6、V1–4-G5和V1–2-D7，根据酶学性质分析显示有机酸耐受性和活性降低（表2）。这些测序结果消除了对变体文库容量低或检测灵敏度不足的担忧。
基于16BGL与底物水杨苷的分子对接建模，在V1片段活性位点口袋中鉴定出17个结合位点：W49、E50、V55、G56、D73、R79、L122、R137、K170、H171、R181、Q182、E185、M226、Y229、D261和W262（图1A），证实了存在大量保守位点。保守位点附近的突变可能破坏三维结构稳定性。实验结果证实了大量保守位点的存在，与在V1片段中无法获得阳性变体而仅获得同义突变的结果一致。
【数据】SEP突变率：2.44–7.32‰；V1-C2-C3文库：约1000个大菌落筛选；33个变体活性与16BGL相当；V1片段结合位点：17个（W49、E50、V55、G56、D73、R79、L122、R137、K170、H171、R181、Q182、E185、M226、Y229、D261、W262）
3.4 C1-V2-C3的阳性变体
C1-V2-C3文库产生了6个有前景的阳性变体：V2–3-H5、V2–4-F1、V2–2-A10、V2–1-H2、V2–21-H12和V2–1-H12。如表3所示，这些变体共同特征为K343位谷氨酸突变。这些酶学性质强调了K343E突变位点在增强催化活性中的关键作用，而其他位点的突变会削弱这一功能（表3）。
如图3所示，纯化的16BGL比活性为44.97 IU/mg，通过DNS和Bradford方法测定。然而，经10 mg/mL甲酸处理后，其活性显著下降至18.67 IU/mg，仅为全活性的41.5%。纯化的V2–3-H5比活性达到97.25 IU/mg，是16BGL的2.16倍；甲酸处理后降至50.47 IU/mg，保持全活性的51.9%。因此，研究将来自V2片段的V2–3-H5作为进一步优化的首选模板，以期获得更高水平的催化活性和甲酸耐受性。
【数据】16BGL比活性：44.97 IU/mg；10mg/mL甲酸处理后：18.67 IU/mg（41.5%剩余活性）；V2–3-H5比活性：97.25 IU/mg（16BGL的2.16倍）；甲酸处理后：50.47 IU/mg（51.9%剩余活性）；关键突变：K343E
3.5 C1-C2-V3的阳性变体
C1-C2-V3变体文库筛选出5个不同变体：V3–1-G7、V3–1-G12、V3–1-H8、V3–2-G6和V3–4-H6。除V3–4-H6外的4个变体活性略有增加，但有机酸耐受性显著下降（表4）。
如图3所示，纯化的V3–4-H6比活性为29.45 IU/mg，甲酸处理后活性为20.42 IU/mg，保持全活性的69.34%。虽然V3–4-H6的催化活性仅为16BGL的0.43倍，但其甲酸耐受性显著更高……（原文截断）
【数据】V3–4-H6比活性：29.45 IU/mg；甲酸处理后：20.42 IU/mg（69.34%剩余活性）；催化活性：16BGL的0.43倍
讨论与解读
SEP与DDS的定向进化方法为传统定向进化技术面临的问题提供了有前景的解决方案——通过减少负突变、降低回复突变和促进正突变整合，保证突变位点在整个基因序列中均匀分布，生成具有增强多重功能的稳健变体。该策略在引导大基因进化方面尤为有效，适用于高分子量蛋白质的精准修饰。案例研究证明了该方法的有效性，为提升多种酶学性质提供了新途径。
变体V123和V123–676Q表现出增强的催化活性和显著改善的有机酸耐受性，有望应用于有机酸性环境中从生物质（如生产乙醇）工业制备葡萄糖，以及在化学工业、果汁制备、酿酒工艺和饲料添加剂等领域发挥作用。该案例研究还揭示了BGL活性与有机酸耐受性协同进化的可能机制。
编译者解读
本研究最值得称道之处在于方法论上的务实转向——当理性设计和全基因易错PCR接连失败后，团队没有在原有路径上继续加码，而是重新设计了"分段突变+体内重组"的进化路线。SEP将突变压力分散到小片段上，DDS则像"正突变拼图"一样把有益突变逐块整合，这种化整为零、择优组合的策略对大基因的定向进化具有通用价值。K343E作为关键突变位点的发现也提示，远离活性中心的表面电荷修饰可能通过影响底物通道或构象动态来调节酶功能。不过，研究目前仍以模式底物水杨苷为筛选压力，向真实生物质水解体系的转化效果尚待验证。
参考来源
Ouyang B. A novel directed evolution approach for co-evolution of β-glucosidase activity and organic acid tolerance. Journal of Biotechnology, 2025. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2025.02.009
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2025.02.009