来源：Influence of indigenous Saccharomyces cerevisiae strains on the evolution of chemical compounds and quality attributes during the aging of traditional-method sparkling wines（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
传统法起泡酒的二次瓶内发酵依赖酵母菌株的发酵性能与自溶特性，而酵母菌株的选择直接影响终产品的胶体组成、泡沫质量和香气特征。本研究对比了四株本土分离的酿酒酵母与两株商业酵母在传统法起泡酒生产中的表现，系统测定了陈酿3个月和12个月后的蛋白质、多糖、甘露糖蛋白含量，泡沫特性，挥发性化合物组成及感官品质。结果显示本土酵母在泡沫稳定性和大分子释放方面优于商业菌株，且呈现菌株特异性化学感应指纹，为起泡酒差异化生产提供了新工具。
研究背景
高品质起泡酒（如香槟法或传统法产品）通过向基酒中添加含预适应酵母、蔗糖、静态葡萄酒和澄清剂的混合物（liqueur de tirage），进行瓶内二次发酵而制成。这一步骤称为"起泡"（prise de mousse），随后酒液在密封瓶中与酒泥接触陈酿，引发酵母自溶，释放胞内及细胞壁组分——包括碳水化合物、蛋白质、多糖、甘露糖蛋白和挥发性化合物——赋予终产品独特特征。已有大量研究关注多糖、甘露糖蛋白和蛋白质对二氧化碳整合、泡沫稳定性及起泡酒气泡品质的感官贡献。挥发性馏分包含多种有机化合物，如高级醇、酯类等，其组成受酵母菌株代谢特性的显著影响。利用本土葡萄酒酵母生产创新起泡酒正受到广泛关注，因其与生物多样性相关的差异化潜力密切相关。
研究方法
2.1 基酒酿造
Savatiano葡萄采自希腊阿提卡PGI产区——该品种的主要种植区域——于2022年份在适合起泡酒生产的成熟度下手工采收，以生产与产地相关的标准化基酒（Lola et al., 2023a; Miliordos et al., 2022）。采用Lola等人（2023a）先前发表的标准方法，在雅典农业大学进行小规模酿酒。简要流程如下：葡萄经除梗、破碎、轻柔压榨后，立即添加亚硫酸盐（60 mg/L K₂S₂O₅）和果胶酶（30 mg/L，Fermentis，Marquette-Lez-Lille，法国）以促进澄清沉降。在10 ± 1 °C下静置24小时后，将澄清葡萄汁转倒入不锈钢发酵罐，立即以200 mg/L的接种量接种选定酵母（酿酒酵母GVS 107，Fermentis）。酒精发酵完成后，基酒经换桶、加亚硫酸盐（50 mg/L K₂S₂O₅）并冷稳定处理。
【数据】葡萄品种：Savatiano；产区：Attiki PGI（希腊）；采收年份：2022；亚硫酸盐：60 mg/L K₂S₂O₅；果胶酶：30 mg/L；静置温度：10 ± 1 °C；静置时间：24h；接种量：200 mg/L；菌株：酿酒酵母GVS 107；换桶后亚硫酸盐：50 mg/L K₂S₂O₅
2.2 起泡酒生产
稳定的Savatiano基酒（酒精度10.9% v/v，pH 2.95，总酸6.56 g酒石酸/L，挥发酸0.33 g乙酸/L）用于按传统法生产起泡酒。配制六种不同的tirage添加液，包含基酒、蔗糖（22 g/L）、膨润土和海藻酸盐混合物（40 mg/L）作为澄清剂（Adjuvant MO，Station Oenotechnique du Champagne，Epernay，法国），以及预适应（2 × 10⁶ cells/mL）的商业菌株（酿酒酵母bayanus——CS1，酿酒酵母——CS2）和先前分离的本土菌株（酿酒酵母——IS1、IS2、IS3、IS4）酵母培养物。本研究选用的商业菌株因其可靠的发酵行为和在起泡酒生产中的广泛应用而入选。所用本土起始菌株此前已被描述具有良好的发酵性能和使酒香多样化的能力，在保留典型品种特征的同时增加葡萄酒的复杂性（Lola et al., 2023b）。tirage添加后，葡萄酒装瓶并使用自动灌装机进行皇冠盖封口以确保一致性，然后在Rovira i Virgili大学实验酒庄的酒窖中于受控条件（13 ± 1 °C）下储存至吐泥。二次发酵通过非破坏性方法测量瓶内CO₂压力进行监测（L. sensor CO₂-FTSYSTEM）（Just-Borràs et al., 2022）。
【数据】基酒参数：酒精度10.9% v/v，pH 2.95，总酸6.56 g酒石酸/L，挥发酸0.33 g乙酸/L；蔗糖：22 g/L；澄清剂：40 mg/L；酵母接种量：2 × 10⁶ cells/mL；菌株：CS1（酿酒酵母bayanus）、CS2（酿酒酵母）、IS1-IS4（本土酿酒酵母）；储存温度：13 ± 1 °C
2.3 起泡酒吐泥与样品制备
在tirage后3个月和12个月两个时间点，每组取两瓶酒置于吐泥架上，手动进行转瓶（riddling）操作。待酒泥沉降到瓶口颈部后，进行吐泥（disgorgement），立即封塞而不添加任何补液（expedition liqueur），储存备用进行感官分析。同时，每组另取三瓶酒不经转瓶直接吐泥用于化学分析，与基酒样品一起通过离心脱气（10,000 rpm，15 min）（Biofuge Primo，Heraeus，Hanau，德国）。
【数据】取样时间点：3个月、12个月；离心转速：10,000 rpm；离心时间：15 min；仪器：Biofuge Primo（Heraeus）
2.4 标准葡萄酒分析
酒精度、pH、可滴定酸、挥发酸和还原糖按照OIV（2020）推荐的分析方法测定。CIELab色度坐标采用分光光度计（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltman，MA，USA）按Ayala、Echávarri和Negueruela（1997）的方法测定，数据使用MSCV软件处理。总色差（ΔEab）按Martínez、Melgosa、Pérez、Hita和Negueruela（2001）的方法计算。2-S-谷胱甘肽基咖啡酰酒石酸、顺式和反式咖啡酰酒石酸、香豆酰酒石酸和fertaric acid通过HPLC-DAD在320 nm波长下测定（Bustamante et al., 2024）。所有分析均进行三次重复。
【数据】分析项目：酒精度、pH、可滴定酸、挥发酸、还原糖、CIELab色度、总色差ΔEab、羟基肉桂酸类；HPLC-DAD波长：320 nm；重复次数：3次
2.5 泡沫特性测定
泡沫特性使用先前发表的Mosalux程序测定（Maujean, Poinsaut, Dantan, Brissonnet, & Cossiez, 1990）。基酒和起泡酒样品在分析前于18 °C保持24小时。使用Mosalux设备（Station Oenotechnique de Champagne）测定参数HM（泡沫最大高度），代表起泡性，以及HS（泡沫稳定高度），代表泡沫环的稳定性/持久性，单位均为mm。测定程序进行三次重复，完整细节见附录A。
【数据】样品平衡温度：18 °C；平衡时间：24h；测定参数：HM（泡沫最大高度）、HS（泡沫稳定高度）；单位：mm；重复次数：3次
2.6 蛋白质测定（HRSEC-DAD）
采用Canals、Arola和Zamora（1998）报道、Pons-Mercadé等人（2021）详述的改良方法，对各实验组的蛋白质含量进行三次重复测定。操作步骤详见附录A。
【数据】方法：HRSEC-DAD；重复次数：3次
2.7 多糖提取与测定（HRSEC-RID）
葡萄酒样品按Ayestarán、Guadalupe和León（2004）描述的方法进行三次重复处理。多糖经提取后冻干，按附录A中详述的方法和色谱条件进行分析。
【数据】方法：HRSEC-RID；重复次数：3次
2.8 甘露糖定量（HRSEC-RID）
甘露糖蛋白按与多糖相同的方案提取三次，直至冻干步骤。随后在葡萄酒基质中按先前发表的方法进行水解（Quirós, Gonzalez, & Morales, 2012）。酸水解、HPLC分析和甘露糖定量方案见附录A。
【数据】方法：HRSEC-RID；重复次数：3次
2.9 挥发性化合物GC-MS分析
目标挥发性化合物采用Lola等人（2023a）提出的液-液萃取方案进行分离，GC-MS参数和测定方法连同萃取方案一并描述于附录A中。
【数据】方法：液-液萃取 + GC-MS
2.10 感官分析
描述性感官分析在陈酿3个月和12个月后的葡萄酒上进行，每次重复两次。感官评价在Rovira i Virgili大学酿酒学院品酒室进行，由十五名经验丰富的品酒师（年龄范围：25至60岁）参与，参与前均获得知情同意。事先进行了共识培训方法，包括两周内四次培训课程（Lola et al., 2023a）。在此期间，品评人员获得了多种起泡酒以更新其知识，提供了包含评价清单中嗅觉属性的适当标准溶液，以及不同浓度的参考标准以评估强度并接受使用量表的培训。正式评价环节中，品评人员以随机顺序获得葡萄酒（50 mL，6–8 °C）于ISO标准杯中，并被要求对视觉（颜色、气泡大小/持久性）、嗅觉（氧化还原平衡、面包/烤面包、热带水果、白色水果、花香）和口感属性（CO₂刺激感、结构感、酸度、整体质量）进行十分制评分（0 = 未感知，10 = 非常强烈）。对于氧化还原平衡和气泡大小/持久性描述符，量表分别从明显的还原特征（0）到高度氧化特征（10），以及从非常大的短暂气泡（0）到非常小的稳定气泡（10）。每个描述符的值表示为所有品评人员的平均值。
【数据】品评人数：15人；年龄范围：25-60岁；培训次数：4次/2周；样品量：50 mL；服务温度：6-8 °C；评分标度：0-10分；重复次数：2次
2.11 统计分析
所有化学和物理性质表示为三次重复的平均值±标准差。使用XLSTAT软件（版本2018，Addinsoft，New York，USA）进行统计分析。对所有测定参数进行单因素方差分析（One-way ANOVA），随后进行Tukey's HSD事后检验（α = 0.05）和t检验（α = 0.05），分别评估酵母菌株和陈酿时间的影响。主成分分析（PCA）应用于…
【数据】统计方法：单因素方差分析 + Tukey's HSD事后检验（α = 0.05）+ t检验（α = 0.05）；软件：XLSTAT 2018
研究结果
3.1 化学分析与颜色参数
图A.1显示了六株酿酒酵母在二次酒精发酵过程中的动力学曲线，表1列出了本研究生产的起泡酒的主要酿酒学参数。所有酵母菌株均在大约一个月内完全完成二次发酵，达到相似的酒精度、残糖和瓶内CO₂压力。此外，所有酵母产生的挥发酸均低于阈值（0.8 g/L，Garofalo et al., 2018），这对起泡酒品质至关重要。然而，令人意外的是，商业酵母菌株记录了显著更高的乙酸产量，指向乙酸产生与酵母代谢活性之间的关系（Ferreira & Mendes-Faia, 2020）。
表2显示了陈酿3个月和12个月时生产的起泡酒的CIELab色度坐标和总色差（ΔEab）。在两个陈酿时期，所有起泡酒在绿-红色度分量（a）上观察到相似的值，而在L分量（3个月时）和蓝-黄色度分量（b）（3个月和12个月时）上，不同菌株生产的葡萄酒之间存在显著差异。此外，在陈酿过程中，所有菌株的a值显著下降，b值呈上升趋势，结合先前研究结果，表明12个月陈酿后黄色强度更高（Just-Borràs et al., 2024）。值得注意的是，12个月时葡萄酒中总羟基肉桂酸含量下降（图A.2），表明氧化作用发生，证实了颜色参数的观察结果（Mitić, Obradović, Grahovac, & Pavlović, 2010）。然而，不同起泡酒在3个月和12个月时ΔEab值的一对一比较表明，观察到的差异无法被人眼区分，因为ΔEab*低于阈值（3个单位）（Martínez et al., 2001）。将3个月陈酿的起泡酒与其对应的12个月陈酿酒进行一对一比较时，也得到了类似结果。这些发现表明，无论使用何种酵母起始菌株或陈酿时间，本研究生产的起泡酒的颜色均无法被人眼区分。
【数据】二次发酵完成时间：约1个月；挥发酸阈值：0.8 g/L；ΔEab*人眼区分阈值：3个单位；商业菌株乙酸产量：显著高于本土菌株（p < 0.05）
3.2 蛋白质组分
分析了基酒和陈酿3个月及12个月酒泥接触样品的蛋白质含量。结果如图1所示。总体而言，陈酿3个月的起泡酒总蛋白浓度与基酒的相应蛋白质比例相似或略低。这种蛋白质去除归因于与膨润土的结合相互作用，膨润土作为澄清剂添加到起泡酒生产中（Lambert-Royo et al., 2022; Pons-Mercadé et al., 2021; Vanrell et al., 2007）。在3个月时，使用本土酵母（尤其是IS1、IS2和IS4）生产的起泡酒，其蛋白质含量显著高于对照条件（CS1、CS2）下生产的葡萄酒（p < 0.05）。在所有蛋白质分子量组分中也观察到类似趋势：高分子量（HMW）、中分子量（IMW）和低分子量（LMW）。在陈酿过程中，IS2和IS4本土菌株的HMW组分显著下降，IS1和IS3分别的IMW和LMW组分也显著下降。对照条件葡萄酒CS2的LMW蛋白质组分显著增加。这些变化反映在12个月时葡萄酒的蛋白质比例中。然而，与3个月的结果一致，CS1在12个月酒泥接触后蛋白质水平降低，而IS1和IS4尽管浓度略低，仍表现出最高的蛋白质含量。这些变化主要与接种的酵母菌株有关，证实了葡萄酒酵母的菌株依赖性自溶能力（Di Gianvito et al., 2018; Tofalo et al., 2022）。
这些发现与酵母自溶导致蛋白质积累的预期相矛盾（Just-Borràs et al., 2024; Kemp et al., 2019），指向这些化合物的同时合成、细胞壁和膨润土吸附以及降解过程（Pons-Mercadé et al., 2021; Vanrell et al., 2007），这些过程根据主导机制的不同而影响其在起泡酒中的存在。
【数据】3个月时本土菌株（IS1、IS2、IS4）蛋白质含量：显著高于商业菌株（p < 0.05）；12个月时IS1和IS4蛋白质含量最高；HMW组分下降菌株：IS2、IS4；IMW组分下降菌株：IS1；LMW组分下降菌株：IS3；CS2的LMW组分：显著增加
3.3 多糖组分
图2显示了基酒和由本土及商业酵母菌株发酵的起泡酒在酒泥接触3个月和12个月后的多糖组分、总多糖和总低聚糖含量。在3个月样品中，IS1、IS2和IS4本土菌株的HMW和LMW多糖组分获得较高值。IS3菌株和两株商业酵母的这些组分值较低，导致起泡酒之间总多糖含量存在统计学差异。相反，所有发酵方案中IMW组分在最初90天内均下降。对此行为的一个可能解释是某些酵母菌株具有较高的自溶能力（Di Gianvito et al., 2018; Tofalo et al., 2022），这可以抵消因澄清剂吸附造成的多糖消除（Lambert-Royo et al., 2022; Pons-Mercadé et al., 2021）。
在3个月至12个月之间，两株对照菌株和IS3菌株发生了明显的多糖释放。这导致这些葡萄酒在12个月时的HMW、IMW、LMW和多糖小计组分值显著高于3个月时。相反，IS4葡萄酒的HMW和LMW多糖组分随时间趋于下降，也影响了其总多糖含量。在IS1和IS2葡萄酒中，3个月和12个月的总多糖浓度没有发现差异，尽管在陈酿过程中IMW和LMW组分分别显著降低。有趣的是，陈酿过程中发生的转化导致本土发酵葡萄酒的LMW组分含量显著高于商业发酵葡萄酒（p < 0.05），而六种起泡酒之间的总多糖含量、HMW和IMW组分浓度相似。一些研究人员报道了多糖的大量释放（Just-Borràs et al., 2024; Kemp et al., 2019），而其他人发现陈酿期间多糖比例下降（Martínez-Lapuente, Guadalupe, Ayestarán, Ortega-Heras, & Pérez-Magariño, 2013）或无变化（Martínez-Lapuente et al., 2016）。我们的结果证实了先前的研究，表明自溶导致多糖HMW组分富集，而IMW和LMW组分的增加或降解取决于酵母接种物和陈酿时间。因此，起泡酒的多糖含量与其在陈酿过程中释放和酶促水解之间的平衡有关，这似乎是一个复杂的、由酵母驱动的现象。
关于3个月时起泡酒的低聚糖浓度，CS1呈现最高值，其次是IS1、IS2、IS3、CS2和IS4。但需要注意的是，所有起泡酒的低聚糖浓度均低于基酒。12个月陈酿后，除CS1酵母菌株外，所有样品的低聚糖比例均增加，CS1保持相当相似的水平。酵母菌株显著影响低聚糖组成，IS3和IS4菌株的统计含量显著升高。葡萄酒平均低聚糖组分的增加可能归因于自溶过程以及IS1、IS2和IS4菌株获得的葡萄酒中记录的IMW和LMW多糖组分的降解。
【数据】3个月时HMW和LMW多糖高值菌株：IS1、IS2、IS4；3个月时低值菌株：IS3、CS1、CS2；IMW组分3个月内：全部下降；12个月时LMW组分：本土菌株显著高于商业菌株（p < 0.05）；3个月低聚糖排序：CS1 > IS1 > IS2 > IS3 > CS2 > IS4；12个月低聚糖增加菌株：除CS1外全部增加；低聚糖显著升高菌株：IS3、IS4
（图3显示了基酒和陈酿3个月及12个月后起泡酒的泡沫特性。不同拉丁和希腊小写字母表示相同陈酿月份的起泡酒之间存在显著差异（α = 0.05，Tukey's HSD检验）。星号表示不同陈酿时间之间的显著差异。）
（图4显示了12个月陈酿后使用不同酿酒酵母菌株发酵的起泡酒多糖水解后的甘露糖浓度。带有不同小写字母的柱表示起泡酒之间存在显著差异（α = 0.05，Tukey's HSD检验）。）
（图5为PCA分析，涵盖12个月陈酿后不同酿酒酵母菌株生产的起泡酒的泡沫参数以及多糖、低聚糖、蛋白质和甘露糖蛋白。HMW：高分子量组分，IMW：中分子量组分，LMW：低分子量组分。）
（图6为感官数据的分层聚类热图。图上每个彩色单元格对应每个属性的平均值，样品在列，感官属性在行。不同拉丁和希腊小写字母表示相同陈酿月份的起泡酒之间存在显著差异。）
（图7为PLSR相关载荷图，显示12个月陈酿后不同酿酒酵母菌株发酵的起泡酒中挥发性香气化合物为x变量、葡萄酒样品感官属性评分为y变量的关系。）
讨论与解读
本研究通过系统表征二次发酵使用四株本土和两株商业酿酒酵母起始菌株的起泡酒，揭示了菌株选择对终产品化学组成和感官品质的深远影响。多变量分析作为新工具阐明了所选酵母的整体性能和菌株特异性影响。不同菌株生产的葡萄酒在大分子组成和泡沫特性上存在明显差异，本土发酵以最高的起泡性和泡沫稳定性为特征，同时伴随更多的多糖、蛋白质和甘露糖蛋白富集。GC-MS代谢分析鉴定出能够区分本土菌株与商业菌株的特异性挥发性代谢物。三株本土菌株与商业菌株不同，在相应起泡酒中呈现复杂的挥发性特征，包含高级醇和酯类，与花香和烘烤香气相关，达到更高的感官品质。这是首次将本土酵母菌株应用于起泡酒生产并评估其促进物理、化学和感官品质提升的研究。
【编译者解读】该研究将"菌株个性化"理念引入传统法起泡酒生产，用数据证明本土酵母并非只是商业菌株的替代品，而是能赋予产品独特化学感应指纹的差异化工具。方法上，多维度指标（大分子、泡沫、香气、感官）的联合分析值得借鉴——单一指标往往掩盖菌株间真实差异。局限在于样本量较小且仅一个年份，菌株表现的年际稳定性尚待验证。对合成生物学而言，这些本土菌株的基因组与代谢通路差异是挖掘新型自溶调控靶点的宝贵资源。
DOI: 10.1016/j.foodres.2025.116494