来源：Improvement of Saccharomyces cerevisiae strain tolerance to vanillin through heavy ion radiation combined with adaptive laboratory evolution（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
香草醛是木质纤维素水解液中的主要酚类抑制物，严重制约酿酒酵母在燃料乙醇生产中的应用。本研究采用重离子辐射（HIR）联合适应性实验室进化（ALE）策略，成功选育出4株高耐受香草醛的突变株H6、H7、X3和X8。在1.6 g/L香草醛浓度下，突变株平均OD600达0.95，约为野生型的3.4倍；2.0 g/L浓度下96小时内葡萄糖利用率达86.3%，远超野生型的70.0%。全转录组与全基因组重测序揭示了FLO9、GRC3、PSP2、SWF1等关键基因在细胞絮凝、rDNA转录调控、DNA聚合酶突变抑制及蛋白棕榈酰化中的重要作用。
研究背景
木质纤维素是地球上储量丰富、分布广泛且成本低廉的资源。以木质纤维素为底物生产燃料乙醇，既能满足当前能源需求，又能有效减少环境污染。然而，木质纤维素水解液中存在大量有毒物质，这是制约发酵产业发展的主要因素。香草醛作为水解液中的主要酚类物质之一，可从多方面限制酿酒酵母的生长与代谢，在低浓度下即表现出强烈抑制作用。
已有研究表明，香草醛的毒性严重影响细胞膜完整性，抑制细胞跨膜转运功能，同时造成线粒体和核糖体损伤，降低细胞氧化应激能力并抑制翻译过程。这些损伤严重阻碍酵母细胞正常功能，降低发酵效率。因此，开发新策略以获得耐受香草醛毒性的突变菌株，对高效利用木质纤维素至关重要。
研究方法
2.1 菌株培养与实验仪器
选用遗传稳定性良好的酿酒酵母S288C作为细胞模型。YPD培养基中葡萄糖、蛋白胨和酵母提取物含量分别为2%、2%和1%，固体培养基额外添加2%琼脂。香草醛培养基中葡萄糖、蛋白胨和酵母提取物浓度分别为10%、2%和2%，香草醛含量按实验具体浓度添加。细胞OD600值使用美国BioTek Instruments公司的Epoch微型板分光光度计测定。
【数据】YPD培养基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母提取物1%；固体培养基琼脂2%；香草醛培养基：葡萄糖10%、蛋白胨2%、酵母提取物2%
2.2 重离子辐射选育耐受菌株
配制香草醛浓度分别为1.6 g/L和2.0 g/L的YPD液体培养基和YPD固体培养基，于115°C灭菌20分钟。将对数期酵母液以4%接种量转移至不同香草醛浓度的培养基中，在30°C、200 r/min摇床中培养至对数期。将对数期酵母液分为6份，其中3份用高浓度香草醛胁迫处理2小时，另3份静置。上述酿酒酵母S288C菌液经中国科学院近代物理研究所兰州重离子加速器（HIRFL）提供的80 MeV/u碳离子束分别以0和150 Gy剂量照射。辐照后，酵母培养物再生0–6小时，然后稀释涂布于固体培养基。30°C培养48小时后，计算不同修复时间后菌株的存活率，选择存活率最高的组进行突变体筛选。存活率计算公式为：存活率（%）= m/n × 100%，其中m代表150 Gy组单菌落数，n代表0 Gy组单菌落数。
【数据】香草醛浓度：1.6 g/L、2.0 g/L；灭菌条件：115°C、20 min；接种量：4%；培养条件：30°C、200 r/min；胁迫处理：2 h；辐射剂量：0和150 Gy；碳离子束能量：80 MeV/u；培养时间：48 h；存活率公式：m/n × 100%
2.3 适应性实验室进化选育耐受菌株
选取HIR后再生6小时的酵母液作为初筛菌液，以4%剂量转接至香草醛浓度为1.6 g/L的YPD培养基中。在此浓度下培养至对数期，OD600对齐至1.6，然后逐步提高浓度梯度。依次在1.8 g/L、2.0 g/L和2.2 g/L香草醛浓度下培养48小时后，以4%浓度转接至下一梯度培养基，重复此过程直至某一菌株OD600降至0.2以下。初筛结束后，将本阶段末的菌液稀释涂布于YPD固体培养基进行复筛。30°C培养48小时后，挑取单菌落转接至1.8 g/L香草醛培养基中。培养48小时后，选取OD600超过0.2的菌株，分别以4%浓度转接至含2.0 g/L和2.2 g/L香草醛的培养基中。OD600低于0.2的菌落弃去，重复此过程直至菌株生长速率明显降低。所得单菌落以1:1体积比与30%甘油混合，于−80°C冰箱保存。
【数据】初筛香草醛浓度：1.6 g/L；OD600对齐值：1.6；梯度浓度：1.8、2.0、2.2 g/L；每梯度培养时间：48 h；转接浓度：4%；筛选阈值：OD600 > 0.2；甘油保存：30%甘油、1:1体积比、−80°C
2.4 突变株耐受性测试
配制香草醛浓度分别为2.0 g/L和2.2 g/L的YPD液体和固体培养基，115°C灭菌20分钟。各组菌株培养一定时间后检测OD600。以各菌株在不同香草醛浓度培养基中的OD600与各菌株在YPD培养基中OD600的比值判定菌株耐受性。各菌株单菌落于YPD培养基中培养至对数期，OD600对齐后以4%接种量接种于香草醛浓度为2.2 g/L的YPD培养基中，30°C、200 r/min培养，每12小时检测一次OD600，共检测156小时，绘制菌株生长曲线。发酵性能测试中，挑取单菌落培养至对数期，OD600对齐后以10%接种量接种于香草醛浓度为2.0 g/L的发酵培养基中，30°C发酵，每12小时检测CO2释放量、pH和残留葡萄糖。遗传稳定性测试中，将对数期菌液适当稀释后涂布于YPD培养基，30°C培养48小时后挑取单菌落于YPD液体培养基中，培养至对数期并OD600对齐后，以4%接种量转接至2.2 g/L香草醛培养基，培养一定时间后检测OD600。控制相同操作和培养时间，重复此过程五个循环。
【数据】耐受性测试香草醛浓度：2.0、2.2 g/L；生长曲线浓度：2.2 g/L；检测间隔：12 h；总时长：156 h；发酵接种量：10%；发酵香草醛浓度：2.0 g/L；发酵温度：30°C；遗传稳定性：5个循环、2.2 g/L香草醛
2.5 线粒体膜电位与活性氧测定
配制YPD培养基及香草醛浓度分别为1.0 g/L和2.0 g/L的YPD培养基，115°C灭菌20分钟。各菌株单菌落于YPD培养基中培养至对数期，OD600对齐后以4%接种量接种至香草醛浓度为2.0 g/L的YPD培养基中。收集1 × 10⁶/mL细胞，离心后用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。加入Rh123染色液至终浓度5 μg/mL，室温孵育20分钟，离心弃上清，PBS洗涤两次。使用流式细胞仪检测线粒体膜电位。随后将菌落以4%接种量接种至香草醛浓度分别为1.0 g/L和2.0 g/L的YPD培养基中。收集1 × 10⁶/mL细胞，用PBS以1:1000稀释DCFH-DA，收集的细胞离心后用稀释的DCFH-DA重悬，于30°C培养箱孵育30分钟，离心弃上清，PBS洗涤两次。活性氧和线粒体膜电位均使用美国Luminex公司的Amnis FlowSight定量成像流式细胞仪测定，数据由IDEAS Application v6.0软件收集分析。
【数据】Rh123终浓度：5 μg/mL；孵育条件：室温20 min；DCFH-DA稀释比：1:1000；孵育条件：30°C、30 min；细胞量：1 × 10⁶/mL；香草醛浓度：1.0、2.0 g/L
2.6 转录组测序
将酿酒酵母S288C培养至对数期，分别取10 mL菌液于50 mL离心管中。离心后弃上清，加入YPD培养基和浓度为7 g/L（半致死浓度）的香草醛培养基。于30°C、200 r/min孵育2小时后收集样品。取样后用PBS缓冲液洗涤两次，液氮速冻后转移至超低温冰箱保存。每组取3个样品进行RNA提取。总RNA提取按照总RNA纯化试剂盒说明书步骤进行。使用NanoDrop 2000测定RNA浓度和纯度，使用Agilent Bioanalyzer 2100系统的RNA Nano 6000检测试剂盒评估RNA完整性。对每个样品，计算香草醛组与对照组相比基因表达的倍数变化（FC）及相应的p值，每个基因获得三个每千个碱基转录每百万片段映射的片段数（FPKM）值。
【数据】香草醛浓度：7 g/L（半致死浓度）；处理时间：2 h；温度：30°C；转速：200 r/min；样品数：每组3个；测序平台：NanoDrop 2000、Agilent Bioanalyzer 2100
研究结果
3.1 香草醛耐受性酿酒酵母的筛选
起始菌株酿酒酵母S288C（WT）首先经高浓度香草醛胁迫，再进行重离子辐射获得诱变组菌株。随着香草醛浓度的增加，诱变组的OD600始终高于WT（图1A）。复筛阶段，各组挑取单菌落置于香草醛浓度为1.8 g/L的培养基中。在相同时间点，诱变组单菌落生长水平显著优于WT组（图1B）。随后逐步提高香草醛浓度，成功筛选出20株香草醛耐受酵母突变株，随机选取其中4株进行香草醛耐受性验证及后续表型研究。
【数据】初筛：OD600趋势随香草醛浓度升高；复筛香草醛浓度：1.8 g/L；筛选获得突变株数：20株；选取验证株数：4株
3.2 香草醛环境中各菌株的耐受性与发酵性能
通过菌株在胁迫与正常生长条件下OD600的比值，比较香草醛对各菌株的抑制程度，从而判断菌株耐受性。在香草醛浓度分别为1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L和2.2 g/L的培养基中，突变株与原始菌株的耐受性存在显著差异（图2A）。在1.6 g/L香草醛浓度下，4株突变株的平均相对OD600为0.95，而原始菌株WT在同浓度下的平均相对OD600仅为0.28。随着香草醛浓度升高，所有菌株的耐受性均下降。但突变株H6、H7、X3和X8的共同特征是：在任何培养基中，其对香草醛的耐受性均显著优于原始菌株WT。
测定了各菌株在2.2 g/L香草醛浓度下的生长曲线（图2B）。在香草醛胁迫下，所有菌株的生长速率均显著降低，但延长培养时间后，4株突变株的平均OD600为1.67，而原始菌株WT在156小时后仅为0.50。在此环境中，突变株H6、H7、X3和X8仍具有完整的细胞周期，而原始菌株WT表现出缓慢的生长速率且无对数期。
比较了各菌株在香草醛浓度为2.0 g/L的发酵培养基中的CO2释放量（图2C）、葡萄糖残留量（图2D）和pH（图2E）。发现所有菌株均能在2.0 g/L香草醛环境中发酵，且突变株H6、H7、X3和X8的发酵能力优于原始菌株WT。进一步比较CO2释放和葡萄糖残留发现，突变株H6、H7、X3和X8发酵更彻底。发酵96小时后，突变株的残留葡萄糖仅为5 g/L，而原始菌株WT的残留葡萄糖为20 g/L。突变株在96小时内的葡萄糖利用率为86.3%，而原始菌株仅为70.0%。这些结果表明，在香草醛环境中，突变株比原始菌株具有更快的发酵速度和更好的发酵性能。
【数据】1.6 g/L香草醛：突变株平均相对OD600为0.95，WT为0.28；2.2 g/L香草醛培养156 h：突变株平均OD600为1.67，WT为0.50；2.0 g/L发酵96 h：突变株残留葡萄糖5 g/L，WT为20 g/L；突变株葡萄糖利用率86.3%，WT为70.0%
3.3 香草醛环境中各菌株的遗传稳定性
评估了突变株的遗传稳定性（图3）。每个菌株在每个循环结束时的OD600无显著差异，表明各菌株相对稳定。WT菌株在每个循环结束时的OD600仅为0.25左右。这表明突变株在香草醛环境中的生长能力显著优于WT菌株。稳定性研究结果显示，HIR联合ALE能够培育出在香草醛胁迫下生长一致的微生物菌株。
【数据】WT菌株每循环末OD600：约0.25；遗传稳定性评估：5次传代循环
3.4 香草醛环境中线粒体膜电位与活性氧的变化
原始菌株WT和突变株H6、H7、X3、X8在2.0 g/L香草醛胁迫24小时后，线粒体膜电位均显著下降，表明香草醛处理后线粒体活性显著降低（图4A）。在2.0 g/L香草醛胁迫48小时后，所有突变株的线粒体膜电位均恢复至高于0小时的水平。而WT的膜电位未恢复至0小时水平。结果表明，所有菌株在处理48小时后开始适应香草醛胁迫，但突变株适应香草醛胁迫的速度快于原始菌株。
在2.0 g/L香草醛环境中，突变株的ROS含量在24小时和48小时胁迫下增加，而WT的ROS含量在3个时间点无显著变化（图4B）。然而，当香草醛胁迫浓度降至1.0 g/L时，WT的ROS含量在胁迫1小时和3小时后逐渐增加（图S1）。在酵母凋亡研究中发现，ROS的产生通常可在其他凋亡表型出现之前被观察到。因此，突变株H6、H7、X3和X8在24小时和48小时的长期胁迫下产生ROS，而原始菌株可能已发生凋亡。上述结果间接表明突变株对香草醛的耐受性优于原始菌株WT。
【数据】香草醛浓度：2.0 g/L；膜电位检测时间点：0、24、48 h；ROS检测时间点：24、48 h；低浓度验证：1.0 g/L、1 h和3 h
3.5 转录组测序
本转录组分析中，设FC ≥ 2和FDR < 0.01为筛选标准，筛选出3013个与香草醛胁迫相关的显著差异表达基因，其中1581个基因上调，1432个基因下调。香草醛胁迫环境中差异表达基因显著富集的GO条目可分为三大类（图5A）。生物学过程方面，差异基因主要富集于细胞过程和代谢过程；细胞组分方面，差异基因显著富集于细胞和细胞部分条目；分子功能方面，差异基因主要富集于结合和催化活性。
根据KEGG注释，上调的差异表达基因主要富集于MAPK信号通路-酵母，而下调的差异表达基因主要富集于核糖体等通路（图5B）。对部分差异表达倍数较大或具有明显突变特征的差异表达基因绘制了特征基因图谱（图5C）。圆圈0显示酿酒酵母S288C的16条染色体。圆圈1和圆圈2分别显示56个差异表达倍数较大或具有明显突变特征的差异表达基因及其对应的GO条目。圆圈3显示圆圈2中30个发生基因突变的差异表达基因。圆圈4显示既往研究中与香草醛耐受性相关的差异表达基因，其中5个与本研究的转录组差异表达基因重合。这些结果表明，香草醛可影响核糖体亚基的合成与组装，从而抑制酵母细胞的核糖体功能和翻译过程。然而，细胞通过调节各种大分子和化合物的代谢、激活刺激相关基因、调控转录过程来应对这种不利环境。
【数据】筛选标准：FC ≥ 2、FDR < 0.01；差异表达基因总数：3013个；上调基因：1581个；下调基因：1432个；特征基因图：56个DEGs、30个突变DEGs、5个与既往研究重合
3.6 突变株全基因组重测序
对4株突变株进行全基因组重测序，发现所有突变广泛分布于14条染色体上，SNP和Indel密度分布如图所示（图6A）。根据突变位点鉴定策略，在突变株H6、H7、X3和X8中共获得44个突变（图6B），包含36个SNP和8个小Indel（图6C）。与香草醛耐受性相关的大多数突变为SNP，缺失或插入较少，碱基转换数量较多。
【数据】突变总数：44个；SNP：36个；Indel：8个；突变分布染色体数：14条
3.7 关键突变基因的突变细节与表达通路
图7展示了响应香草醛胁迫的关键突变基因的突变细节及抗香草醛胁迫的表达通路。5个上调的差异表达基因的突变位点和类型如图7A所示。图7B展示了关键基因抵抗香草醛胁迫的表达通路。
【数据】上调DEGs：5个；突变类型：SNP为主，少量Indel
讨论与解读
根据前期研究，菌株在150 Gy剂量下正突变率最高，因此本实验选择150 Gy重离子辐射选育香草醛耐受正突变株。突变株在任何浓度香草醛培养基中的耐受性均优于原始菌株，且与原始菌株差异显著。香草醛胁迫显著延长了酿酒酵母完成整个细胞周期所需的时间，这可能归因于香草醛影响酵母细胞周期中的多个检查点，如起始点、S期检查点、G2期检查点、纺锤体组装检查点以及有丝分裂相关基因的表达，最终导致细胞周期延长。这表明HIR联合ALE的方法显著提高了酿酒酵母突变株的香草醛耐受性。突变株能够耐受木质纤维素水解液中的有毒有害物质，避免因香草醛毒性抑制而导致酿酒酵母木质纤维素转化效率降低。与单一诱变或驯化相比，本实验方法保持了突变株完整的细胞周期，从而能够更有效地筛选。
编译者解读
本研究将重离子辐射与适应性实验室进化相结合，发挥了两种策略的协同优势——辐射引入广泛的基因组变异，ALE则定向筛选有利突变，这种"先诱变后驯化"的组合思路在工业菌株选育中具有较高的实用价值。方法上，以OD600比值评估耐受性、以CO2释放和葡萄糖消耗双重指标验证发酵性能，表型评估体系较为完整。多组学联用（转录组+全基因组重测序）从分子层面揭示了香草醛耐受的遗传基础，为后续理性改造提供了靶点。局限在于：突变株的耐受机制涉及多基因协同，具体调控网络仍需进一步验证；从实验室到工业规模发酵的放大效果也有待考察。
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.08.014