来源：Biosynthesis of adipic acid via microaerobic hydrogenation of cis,cis-muconic acid by oxygen-sensitive enoate reductase（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
己二酸是尼龙-6,6和聚氨酯塑料的关键前体，传统化学合成路线存在环境污染等问题。本研究设计了一条全新的人工生物合成途径——通过延伸顺,顺-粘康酸生物合成路径，利用来自丙酮丁醇梭菌的烯酸还原酶（CaER）在微氧条件下催化碳碳双键加氢生成己二酸。研究者构建了单培养与共培养两种体系，通过启动子工程和透明颤菌血红蛋白（VHb）的引入，最终将己二酸产量提升至27.6 mg/L。
研究背景
随着化石燃料日益枯竭，合成生物学已成为化学品生物制造的重要工具。乳酸、3-羟基丙酸、琥珀酸和戊烯二酸等大宗化学品已通过代谢工程微生物实现生产。己二酸是尼龙-6,6和聚氨酯的直接前体，鉴于化学路线的诸多缺陷，其生物合成受到越来越多的关注。近期，研究者从Thermobifida fusca B6菌株中发现了天然的己二酸生物合成途径，但该菌株的细胞无细胞体系需补充关键酶5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶才能检测到己二酸。Kallscheuer等人通过引入二羧酸逆转β-氧化途径，在大肠杆菌中实现了从葡萄糖直接合成己二酸，通过筛选异源酶并过表达途径酶，30小时内积累36 mg/L己二酸。本研究在此基础上，设计了一条经由顺,顺-粘康酸加氢的新途径。
研究方法
2.1 培养基、菌株与质粒
大肠杆菌XL1-Blue用于质粒繁殖与保存；大肠杆菌BW25113用于体内酶活测定与生物转化研究；大肠杆菌QH4为苯丙氨酸过量生产菌株E. coli ATCC31884的衍生菌株；大肠杆菌BL21 (DE3)用于生物转化研究与己二酸生物合成（表1）。
LB培养基含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl，用于接种物制备和细胞繁殖。改良M9（M9Y）培养基含2.5 g/L葡萄糖、10 g/L甘油、6 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、246.5 mg/L MgSO₄·7H₂O、14.7 mg/L CaCl₂·2H₂O、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl、1或5 g/L酵母提取物和2.0 mg/L维生素B₁。M9培养基用于生物转化实验和己二酸生物合成。需要时，氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素分别以100 μg/mL、50 μg/mL和34 μg/mL的终浓度添加到培养基中。途径酶表达使用高拷贝质粒pZE12-luc和pETDuet-1、中拷贝质粒pCS27和低拷贝质粒pSA74。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；M9Y（2.5 g/L葡萄糖、10 g/L甘油、6 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、246.5 mg/L MgSO₄·7H₂O、14.7 mg/L CaCl₂·2H₂O、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl、1或5 g/L酵母提取物、2.0 mg/L维生素B₁）；抗生素浓度：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素34 μg/mL
2.2 DNA操作
质粒pZE-EP、pSA-NC、pZE-CaER和pET-CaER构建于前期研究（Lin et al., 2014; Sun et al., 2016）。为在大肠杆菌中优化表达，来自透明颤菌的vgb基因（编码透明颤菌血红蛋白）和来自凝结芽孢杆菌的bcer基因（编码烯酸还原酶）经密码子优化后合成。vgb基因克隆至pCS27的Acc65I和BamHI位点之间，获得pCS-VHb。为构建pET-BcER，bcer基因经BamHI和SalI位点克隆至pETDuet-1。表达盒PLlacO1-CaER从pZE-CaER扩增后插入pZE-EP的SacI和SpeI位点之间，获得pZE-EP-CaER（双操纵子）。
【数据】限制性内切酶：Acc65I、BamHI、SalI、SacI、SpeI；质粒：pCS27、pETDuet-1、pZE-EP、pZE-CaER
2.3 饲喂实验
饲喂实验用于检测顺,顺-粘康酸或水杨酸转化为己二酸的生物转化效率。将两类菌株的转化子——携带pZE-CaER的大肠杆菌BW25113和同时携带pZE-CaER与pSA-NC的BW25113——分别接种于4 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37°C培养。过夜培养物接种至50 mL含相应抗生素的新鲜M9Y培养基中，分别在37°C有氧/微氧条件下培养。当OD₆₀₀达到0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM。菌株继续在30°C下培养。额外培养3小时后，向培养物中加入顺,顺-粘康酸或水杨酸盐至终浓度400 mg/L。每隔24小时采集样品，通过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）分析。
【数据】接种体积：4 mL LB；培养体积：50 mL M9Y；温度：37°C（培养）/30°C（诱导后）；IPTG浓度：0.5 mM；底物浓度：400 mg/L；取样间隔：24 h；OD₆₀₀：0.4-0.6
2.4 单培养体系合成己二酸
大肠杆菌QH4转化质粒pZE-EP-CaER和pSA-NC用于实验。转化子接种于4 mL含相应抗生素的LB培养基中，37°C培养。过夜培养物（1 mL）接种至50 mL含适当抗生素的M9Y培养基中。M9Y中酵母提取物浓度为1 g/L或5 g/L。培养开始时加入IPTG至终浓度0.25 mM。培养物在微氧条件下于37°C、200 rpm摇瓶培养。每24小时取样。测定OD₆₀₀值，产物和中间代谢物通过HPLC分析。
【数据】接种量：1 mL过夜培养物/50 mL M9Y；酵母提取物浓度：1 g/L或5 g/L；IPTG浓度：0.25 mM；温度：37°C；转速：200 rpm；取样间隔：24 h
2.5 共培养体系合成己二酸
菌株单菌落接种于4 mL LB培养基中，37°C培养。共培养时，接种比例分别为4:1、1:1或0.25:1，总接种体积为1 mL。过夜培养物接种至50 mL含适当抗生素的M9Y培养基中，酵母提取物浓度为5 g/L。培养开始时加入IPTG至终浓度0.25 mM。在微氧条件下，菌株于37°C、200 rpm摇瓶培养。每24小时取样，测定OD₆₀₀值，产物和中间代谢物通过HPLC分析。
【数据】接种比例：4:1、1:1、0.25:1；总接种体积：1 mL；酵母提取物浓度：5 g/L；IPTG浓度：0.25 mM；温度：37°C；转速：200 rpm；取样间隔：24 h
2.6 HPLC分析
为分析和定量水杨酸、儿茶酚和顺,顺-粘康酸，使用配备反相Diamonsil C18色谱柱和UV-VIS检测器的HPLC（SHIMADZU）。溶剂A为甲醇，溶剂B为含0.1%甲酸的水。柱温设为30°C，流速为1 mL/min。梯度程序为：5-100%溶剂A洗脱30 min，100-5%溶剂A洗脱3 min，5%溶剂A继续洗脱5 min。检测波长：水杨酸329 nm，儿茶酚274 nm，顺,顺-粘康酸260 nm。水杨酸（Sigma Aldrich）、儿茶酚（Alfa Aesar）、顺,顺-粘康酸（Sigma Aldrich）和己二酸（Sigma Aldrich）用作标准品。己二酸定量时，样品经冷冻干燥后复溶浓缩十倍。标准品和样品通过配备HPX-87H离子排阻色谱柱（Bio-Rad）和RID检测器的HPLC（Hitachi Chromaster）分析。流动相为4 mN H₂SO₄，柱温60°C，流速0.6 mL/min。
【数据】色谱柱：Diamonsil C18（反相）、HPX-87H（离子排阻）；柱温：30°C（C18）/60°C（HPX-87H）；流速：1 mL/min（C18）/0.6 mL/min（HPX-87H）；检测波长：329 nm（水杨酸）、274 nm（儿茶酚）、260 nm（顺,顺-粘康酸）；流动相：甲醇/0.1%甲酸水（C18）、4 mN H₂SO₄（HPX-87H）；浓缩倍数：10倍
研究结果
3.1 CaER对顺,顺-粘康酸的体内酶活
烯酸还原酶催化α,β-不饱和化合物中碳碳双键的还原。前期工作中已证明CaER在有氧和厌氧条件下均能催化肉桂酸和对香豆酸的加氢反应（Sun et al., 2016）。基于此，研究者假设CaER能够将不饱和的顺,顺-粘康酸转化为己二酸。饲喂实验用于验证该假设。将质粒pZE-CaER转化至大肠杆菌BW25113，获得菌株SJ1。在摇瓶中间SJ1饲喂400 mg/L顺,顺-粘康酸。然而，有氧条件下培养24小时后，培养液中未检测到己二酸。考虑到儿茶酚合成顺,顺-粘康酸需要氧气，将条件从有氧改为微氧而非严格厌氧。采用该策略后，菌株SJ1产生74.2 ± 7.7 mg/L己二酸，消耗124.8 ± 8.1 mg/L顺,顺-粘康酸（表2）。CaER催化顺,顺-粘康酸转化为己二酸的转化率为57.8%（mol/mol）。中间产物2-己烯二酸的滴度因缺乏商业标准品而无法测定，相应峰的分子量通过质谱分析验证（图S1）。该结果表明CaER能够将顺,顺-粘康酸加氢生成己二酸，但有氧条件下无法检测到产物。该结果与此前研究中CaER体内酶活受培养氧条件影响的结论一致（Sun et al., 2016）。因此，后续研究采用微氧条件而非有氧条件。
【数据】菌株：SJ1（BW25113/pZE-CaER）；底物：顺,顺-粘康酸400 mg/L；己二酸产量：74.2 ± 7.7 mg/L；底物消耗：124.8 ± 8.1 mg/L；转化率：57.8%（mol/mol）；培养时间：24 h；条件：微氧
3.2 水杨酸生物转化为己二酸
前期研究中已构建了多条顺,顺-粘康酸生物合成途径（Curran et al., 2013; Lin et al., 2014; Sun et al., 2014; Xie et al., 2014）。其中一条途径是水杨酸生物合成与其部分降解途径的组合（Lin et al., 2014）。在构建完整的己二酸生物合成途径之前，先进行生物转化研究以测试从水杨酸生产己二酸的能力（图1）。为此，将表达恶臭假单胞菌KT2440的nahG（编码水杨酸1-单加氧酶）和catA（编码儿茶酚1,2-双加氧酶）的质粒pSA-NC与质粒pZE-CaER共转化至菌株BW25113，获得菌株SJ2。培养24小时后，培养物中仅残留痕量水杨酸和儿茶酚，顺,顺-粘康酸积累量达363.9 ± 15.4 mg/L，表明NahG和CatA具有高效率。同时，菌株SJ2在24小时产生23.1 ± 1.2 mg/L己二酸，OD₆₀₀值为3.2 ± 0.3。己二酸滴度在48小时增至28.7 ± 1.5 mg/L（顺,顺-粘康酸积累量为352.0 ± 10.4 mg/L），随后24小时内略有下降（图2）。样品最高OD₆₀₀值在48小时达到3.9 ± 0.3。
【数据】菌株：SJ2（BW25113/pZE-CaER+pSA-NC）；24 h己二酸产量：23.1 ± 1.2 mg/L；48 h己二酸产量：28.7 ± 1.5 mg/L；24 h顺,顺-粘康酸积累：363.9 ± 15.4 mg/L；48 h顺,顺-粘康酸积累：352.0 ± 10.4 mg/L；OD₆₀₀：3.2 ± 0.3（24 h）、3.9 ± 0.3（48 h）
3.3 从简单碳源生物合成己二酸
前期研究中，工程菌株（含pZE-EP和pSA-NC的大肠杆菌QH4）可产生1.2 g/L顺,顺-粘康酸（Lin et al., 2014）。为实现己二酸生产，将pZE-EP-CaER和pSA-NC转化至QH4，获得菌株SJ3。如图3所示，菌株SJ3在72小时内产生5.8 ± 0.9 mg/L己二酸，OD₆₀₀值仅达2.5 ± 0.1。前期研究表明，涉及CaER的生物合成途径中，高浓度产物伴随着高OD₆₀₀值（Sun et al., 2016）。QH4是不能产生苯丙氨酸和酪氨酸的缺陷型大肠杆菌菌株，表明培养基中补充酵母提取物可能有助于QH4的细胞生长。因此，将酵母提取物浓度从1 g/L提高至5 g/L以获得更高的QH4 OD₆₀₀值。经此调整，培养72小时后，菌株SJ3产生12.4 ± 1.7 mg/L己二酸，顺,顺-粘康酸积累量为759.0 ± 53.4 mg/L。使用5 g/L酵母提取物还带来了更好的细胞生长（72小时OD₆₀₀=3.5 ± 0.2）。因此，后续实验使用含5 g/L酵母提取物的M9培养基。结果表明，较高的OD₆₀₀伴随着较高的己二酸产量。至此，研究者实现了通过顺,顺-粘康酸还原从简单碳源生产己二酸。
【数据】菌株：SJ3（QH4/pZE-EP-CaER+pSA-NC）；酵母提取物1 g/L时己二酸产量：5.8 ± 0.9 mg/L（72 h）；酵母提取物5 g/L时己二酸产量：12.4 ± 1.7 mg/L（72 h）；顺,顺-粘康酸积累：759.0 ± 53.4 mg/L；OD₆₀₀：2.5 ± 0.1（1 g/L YE）、3.5 ± 0.2（5 g/L YE）
3.4 开发共培养体系提高己二酸产量
顺,顺-粘康酸的生物合成依赖有氧条件——该途径中的CatA需要氧气将儿茶酚转化为顺,顺-粘康酸。但已确认CaER对氧气敏感。因此，研究者尝试通过引入共培养系统将顺,顺-粘康酸的生物合成与还原分开，以减少相互作用。大肠杆菌QH4转化质粒pZE-EP和pSA-NC，获得作为上游菌株的SJ4。SJ1用作下游菌株。共培养系统采用1:1的接种比例。培养72小时后，己二酸产量为13.5 ± 0.1 mg/L（顺,顺-粘康酸积累量为407.4 ± 6.9 mg/L），OD₆₀₀为4.1 ± 0.1（图4A）。与单培养系统相比，己二酸产量和OD₆₀₀均有所提高。
由于CaER是途径中的限速酶，研究者假设提高限速酶CaER的表达水平可能带来更高的己二酸浓度。在构建共培养系统之前，通过饲喂实验测试更强的启动子是否能带来更高产量。因此，将CaER克隆至带有强T7启动子的质粒pETDuet-1中。由于BW25113不能表达T7启动子，使用用于蛋白表达的大肠杆菌BL21 (DE3)表达质粒pET-CaER，获得菌株SJ5。同时，将pZE-CaER引入大肠杆菌BL21 (DE3)，获得菌株SJ6。顺,顺-粘康酸饲喂实验结果显示，培养24小时后，SJ5的己二酸积累量为104.3 ± 3.8 mg/L（消耗162.1 ± 3.5 mg/L顺,顺-粘康酸）。同时，SJ6产生77.8 ± 1.6 mg/L己二酸，消耗129.7 ± 2.7 mg/L顺,顺-粘康酸（表3）。该结果表明，在顺,顺-粘康酸向己二酸的生物转化中，T7启动子优于lac启动子。后续研究选用pET-CaER而非pZE-CaER。
将pET-CaER和pSA74转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，获得下游菌株SJ7。由此构建了由顺,顺-粘康酸生产菌株SJ4和表达CaER的菌株SJ7组成的共培养系统。研究者调整接种比例以调节两种菌株的比例，使用三种接种比例：4:1、1:1和0.25:1。接种比例为1:1时，72小时己二酸滴度为18.3 ± 0.6 mg/L，顺,顺-粘康酸积累量为395.5 ± 35.6 mg/L（OD₆₀₀=4.4 ± 0.3）（图4B）。接种比例为4:1时，己二酸产量为10.5 ± 0.3 mg/L，顺,顺-粘康酸积累量为435.3 ± 10.5 mg/L（OD₆₀₀=3.9 ± 0.1）；接种比例为0.25:1时，己二酸滴度为14.1 ± 0.8 mg/L，顺,顺-粘康酸积累量为263.8 ± 6.0 mg/L（OD₆₀₀=4.5 ± 0.5）。与其他比例相比，接种比例为1:1时共培养系统表现出最高的己二酸滴度和良好的OD₆₀₀（仅略低于0.25:1接种比例）。这一结果可能的原因是1:1的接种比例更有利于平衡共培养系统中两种菌株的细胞生长和前体积累。共培养系统的最佳己二酸产量高于上述单培养系统。
随后，为减少下游菌株表达CaER所需的氧气供应，研究者利用透明颤菌血红蛋白（VHb）具有获取氧气的能力，将其引入上游菌株。在此策略下，共培养系统中己二酸产量进一步提升，在微氧条件下积累27.6 ± 1.3 mg/L己二酸（图5）。VHb的表达不仅提高了己二酸产量，还促进了顺,顺-粘康酸的积累。
【数据】共培养系统（SJ4+SJ1，1:1）：己二酸13.5 ± 0.1 mg/L，顺,顺-粘康酸407.4 ± 6.9 mg/L，OD₆₀₀=4.1 ± 0.1；SJ5（T7启动子）：己二酸104.3 ± 3.8 mg/L，底物消耗162.1 ± 3.5 mg/L；SJ6（lac启动子）：己二酸77.8 ± 1.6 mg/L，底物消耗129.7 ± 2.7 mg/L；共培养（SJ4+SJ7）1:1：己二酸18.3 ± 0.6 mg/L，顺,顺-粘康酸395.5 ± 35.6 mg/L，OD₆₀₀=4.4 ± 0.3；4:1：己二酸10.5 ± 0.3 mg/L；0.25:1：己二酸14.1 ± 0.8 mg/L；表达VHb后：己二酸27.6 ± 1.3 mg/L
讨论与解读
本研究通过饲喂实验证实了新型己二酸生物合成途径的可行性。实现己二酸生物合成后，采用强T7启动子表达CaER，并将单培养系统改为共培养系统以提高己二酸滴度。增强CaER表达水平的策略被证明能比单培养系统更有效地提高己二酸产量。此外，由于CaER对氧气敏感，培养液中溶解氧是影响CaER活性的因素。在该共培养系统中，下游菌株负责顺,顺-粘康酸还原（表达CaER）。上游菌株表达VHb后，不仅己二酸产量提高，顺,顺-粘康酸积累量也增加。这表明VHb有助于降低培养液中的氧浓度，平衡两种菌株不同的氧需求。总之，研究者构建了一条通过顺,顺-粘康酸加氢合成己二酸的新型生物合成途径，并利用工程大肠杆菌实现了从简单碳源生产己二酸。
【编译者解读】该研究展示了一个典型的合成生物学"设计-构建-测试-学习"循环：从酶功能验证到途径组装，再到共培养系统优化。亮点在于巧妙利用微氧条件平衡了顺,顺-粘康酸合成的好氧需求与CaER的厌氧偏好，并通过VHb实现氧调控，体现了对多菌株体系中"氧矛盾"的精细处理。不足之处在于产量仍处于毫克级水平，距离工业化尚有较大差距；此外，中间产物2-己烯二酸因缺乏标准品而未能定量，限制了代谢通量的精确分析。该工作为氧敏感酶参与的途径设计提供了可借鉴的共培养范式。
参考来源
Sun J. Biosynthesis of adipic acid via microaerobic hydrogenation of cis,cis-muconic acid by oxygen-sensitive enoate reductase. Journal of Biotechnology, 2018. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2018.06.304
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2018.06.304