来源：Strain-specific metabolic trajectories of indigenous non-Saccharomyces yeasts shape volatile, non-volatile, and sensory profiles of bayberry wine: A time-series multi-omics analysis（LWT）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
杨梅果实采后损失高达30–60%，酿酒是延长其产业链的有效途径。然而传统单一酿酒酵母发酵所得杨梅酒香气单一、缺乏典型性。本研究从浙江余姚杨梅果实表面分离8株非酿酒酵母，与酿酒酵母共发酵酿造杨梅酒，系统追踪发酵结束至4个月陈酿期间挥发性组分、非挥发性代谢物及感官品质的动态变化。结果显示，库德里阿兹威毕赤酵母（Pk2） 与克鲁维毕赤酵母（Pkl8） 表现最为突出——前者赋予酒体优异的色泽稳定性与陈酿潜力，后者则产生强烈花果香但陈酿稳定性差。研究为杨梅酒菌株筛选提供了明确的方向性参考。
研究背景
杨梅（Myrica rubra）是我国南方广泛种植的营养丰富水果，色泽鲜艳、风味独特，富含酚类物质和花青素。但杨梅果实呼吸速率高且缺乏保护性表皮，极易腐烂变质，采后损失高达30–60%。将杨梅加工成酒可有效提升附加值、减少浪费并延长货架期。传统杨梅酒生产依赖酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）纯种发酵，虽保证了工艺可靠性，但所酿之酒香气复杂度不足、感官特征趋同。消费者对高品质果酒的差异化需求推动了替代发酵策略的探索。近年来，非酿酒酵母与酿酒酵母共发酵在改善果酒香气、色泽稳定性及风味复杂性方面展现出巨大潜力。其中，库德里阿兹威毕赤酵母、克卢伊维毕赤酵母、异常威克汉姆酵母等菌株的应用研究尤为活跃。
研究方法
2.1 非酿酒酵母的分离与鉴定
8株非酿酒酵母菌株分离自中国浙江省（具体地点：余姚）采集的'黑炭'杨梅（Myrica rubra）果实表面。简要流程如下：将果实破碎后浸泡于0.9 g/dL无菌NaCl溶液中，进行系列十倍梯度稀释。取稀释液涂布于赖氨酸琼脂平板——一种选择性分离非酿酒酵母的WL培养基。纯化后的分离株通过26S rRNA基因D1/D2结构域测序进行鉴定，方法参照Wang等（2023b）的描述。物种归属通过NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）BLAST搜索完成，这些菌株的DNA序列已提交至GenBank数据库，登录号为PZ459056–PZ459063（补充表1）。8株菌株及其缩写如下：Hanseniaspora uvarum（Hu1）、Pichia kudriavzevii（Pk2、Pk3）、Pichia guilliermondii（Pg6）、Wickerhamomyces anomalus（Wa5、Wa7）、Pichia kluyveri（Pkl8）和Metschnikowia pulcherrima（Mp13）。
【数据】菌株：8株非酿酒酵母（Hu1、Pk2、Pk3、Pg6、Wa5、Wa7、Pkl8、Mp13）；分离源：浙江余姚'黑炭'杨梅果实表面；NaCl浓度：0.9 g/dL；鉴定方法：26S rRNA D1/D2域测序；GenBank登录号：PZ459056–PZ459063
2.2 酿酒工艺与发酵条件
中国杨梅（Myrica rubra cv. 'Heitan'）果实在商业成熟度时采自浙江省余姚市某果园。根据中国鲜食杨梅商业销售标准NY/T 750—2020，果实可溶性固形物含量不得低于10 °Bx，可滴定酸度（以柠檬酸当量计）不得高于12 g/L。果实运抵实验室后，挑选健康无损果实，用自来水清洗并沥干。随后去梗、手工破碎获得均匀果浆，剧烈搅拌使之均质化。均质后果浆分装至25 L玻璃罐中，以确保每个发酵重复具有相同的初始条件。向杨梅果浆中添加终浓度50 mg/L的二氧化硫（SO₂）以抑制腐败微生物。4小时后，加入20 mg/L果胶酶（诺维信，中国天津）以促进果汁提取和澄清。杨梅汁初始成分如下：可溶性固形物含量13.8 °Bx，可滴定酸度8.7 g/L（以柠檬酸当量计），pH 3.42。对照发酵（CK）以2 × 10⁶ CFU/mL的酿酒酵母（EXCELLENCE® XR，Lamothe-Abiet，法国卡内让）纯种接种。共发酵组以10⁶ CFU/mL酿酒酵母与8株非酿酒酵母中的每一株共同接种。本文中共发酵酒样名称以非酿酒酵母菌株缩写标记。所有发酵均在25 °C下进行8天，每天压帽两次以确保均匀浸提并防止腐败。当残糖浓度达到4 ± 1 g/L时视为酒精发酵完成。发酵结束后，新酒转移至−4 °C静置48小时以促进冷沉降，然后倒罐去酒泥。倒罐后再次添加SO₂（50 mg/L）。均质后的酒样随后在−4 ± 1 °C下冷稳定1至4个月，之后进行进一步分析。所有发酵和分析均设三次重复。
【数据】发酵温度：25°C；发酵时间：8天；SO₂浓度：50 mg/L（两次添加）；果胶酶用量：20 mg/L；初始可溶性固形物：13.8 °Bx；初始可滴定酸度：8.7 g/L；初始pH：3.42；酿酒酵母接种量：2×10⁶ CFU/mL（CK）/10⁶ CFU/mL（共发酵）；残糖终点：4 ± 1 g/L；冷沉降：−4°C、48h；冷稳定：−4 ± 1°C、1–4个月；发酵容器：25 L玻璃罐
2.3 标准酿酒参数与酚类组成
乙醇含量（OIV-MA-AS312-01）、可滴定酸度（OIV-MA-AS313-01）、挥发酸度（OIV-MA-AS313-02）、还原糖（OIV-MA-AS311-01A）和色度特征（a和b，OIV-MA-AS2-11）均按照国际葡萄与葡萄酒组织（OIV，2018）官方方法测定。总酚、总黄酮和总花青素按照此前报道的常规分光光度法测定（Wang等，2023b）。所有测量均设三次重复，结果以平均值±标准差表示。
【数据】检测方法：OIV官方方法（OIV-MA-AS312-01、AS313-01、AS313-02、AS311-01A、AS2-11）；酚类测定：分光光度法；重复次数：3次
2.4 HS-SPME-GC-MS挥发性化合物分析
挥发性化合物采用顶空固相微萃取（HS-SPME）提取，使用DVB/CAR/PDMS纤维（2 cm，50/30 μm；Supelco，美国贝尔丰特），并通过气相色谱-质谱联用（GC-MS，TRACE DSQ，Thermo-Finnigan，美国）分析，色谱柱为MEGA-5MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm内径，0.25 μm膜厚）。HS-SPME和GC-MS分析程序参照文献（Wang等，2024）。每个8 mL杨梅酒样品含20 μL 2-辛醇（24 mg/L）作为内标。化合物通过将质谱与NIST 2.0谱库及文献保留指数（RI）数据比对进行鉴定。定量分析通过目标化合物的标准校准曲线完成，详细信息见补充表2。对于缺乏参考标准的化合物，其浓度根据具有相似官能团和/或相近碳原子数的标准品进行近似定量。该方法在样品分析前经过线性、灵敏度和精密度验证。所有目标化合物均获得良好线性，相关系数（R²）> 0.99。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别在信噪比3和10下确定，数值处于同类方法的典型范围内（LOD：0.05–500 μg/L；LOQ：0.2–1000 μg/L）。日内和日间精密度以相对标准偏差（RSD）表示，分别持续低于10%和15%，证实了该方法具有良好的重复性。气味活性值（OAV）通过将每种挥发性化合物的浓度除以其文献报道的相应气味阈值计算（补充表3）。虽然OAV > 1通常用于评估气味强度，但阈值以下化合物（0.1 < OAV < 1）也可能通过协同效应参与香气感知（Sam等，2025）。因此，保留OAV > 0.1的化合物进行进一步分析。
【数据】SPME纤维：DVB/CAR/PDMS（2 cm，50/30 μm）；GC柱：MEGA-5MS（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；样品量：8 mL；内标：20 μL 2-辛醇（24 mg/L）；R²> 0.99；LOD：0.05–500 μg/L；LOQ：0.2–1000 μg/L；日内RSD<10%；日间RSD<15%；OAV筛选阈值：>0.1
2.5 衍生化液体进样GC-MS非靶向代谢组学
非靶向代谢组学采用化学衍生化后的GC-MS分析。衍生化是分析葡萄酒中极性非挥发性代谢物所必需的步骤，因为碳水化合物、有机酸、氨基酸以及其他含羟基或羧基的代谢物由于低挥发性和热不稳定性而无法直接进行GC-MS分析。为实现检测，采用两步衍生化方案：甲氧胺化稳定羰基并防止酮-烯醇互变异构，随后用BSTFA-TMCS进行硅烷化，将–OH、–SH、–NH和–COOH基团中的活泼氢替换为三甲基硅烷基（TMS）基团，形成挥发性和热稳定性衍生物。样品制备参照文献（Khakimov等，2022；Marinaki等，2023）。取50 μL酒样与1 mL乙腈/异丙醇/水（3:3:2，v/v/v）混合，室温超声处理30分钟。离心后，取500 μL上清液用离心浓缩器（Eppendorf Concentrator plus，德国汉堡）浓缩至干燥。干燥残渣用80 μL盐酸甲氧胺吡啶溶液（20 g/L）在60 °C下衍生化60分钟，随后加入100 μL BSTFA-TMCS（99:1，v/v）在70 °C下反应90分钟。GC-MS分析前，加入20 μL肉豆蔻酸甲酯至最终体积作为外标，以校正进样体积和检测器响应的变化。离心后，上清液注入Agilent 7000D GC-TQMS系统（Agilent Technologies，美国圣克拉拉）分析。GC-MS分析在HP-5 MS UI色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）上进行，氦气载气流速1.5 mL/min。柱温箱程序……（原文后续未详述）。
【数据】样品量：50 μL；萃取溶剂：乙腈/异丙醇/水（3:3:2，v/v/v）；超声：室温、30 min；浓缩上清液：500 μL；甲氧胺化：80 μL（20 g/L）、60°C、60 min；硅烷化：100 μL BSTFA-TMCS（99:1）、70°C、90 min；外标：20 μL肉豆蔻酸甲酯；载气：氦气、1.5 mL/min；色谱柱：HP-5 MS UI（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）
研究结果
3.1 酿酒参数
不同酵母菌株发酵的杨梅酒的酿酒参数——包括乙醇含量、还原糖、可滴定酸度和挥发酸度——见表1。乙醇含量不受不同非酿酒酵母菌株的显著影响，这与先前研究一致（Aplin等，2019；Lee & Park，2020）。在相同发酵条件下，Pkl8菌株共发酵的杨梅酒表现出最低的残糖含量。不同非酿酒酵母共发酵对可滴定酸度和挥发酸度产生了一致的影响。具体而言，某些非酿酒酵母菌株提高了这两项参数，其中Wa7酒样的可滴定酸度和挥发酸度值最高（p < 0.05），其次是Mp13酒样。相比之下，Pg6和Wa5菌株显著降低了共发酵杨梅酒的这两项参数（p < 0.05），获得最低值。这些结果表明，不同酵母菌株对果酒中有机酸的影响具有菌株特异性，早期研究中也报道了大量不一致的发现（Aplin等，2019；Lee & Park，2020）。在共发酵中，酿酒酵母通常在短时间内占据优势地位，从而减少乙酸的产生（Aplin等，2019）。然而，一些报道表明某些非酿酒酵母不会被酿酒酵母抑制（Andorrà等，2010）。共接种发酵以及纯种发酵获得的挥发酸度值均在可接受范围内，符合红餐酒质量标准。
表1还展示了不同酵母菌株对酚类化合物水平和颜色特征的影响。库德里阿兹威毕赤酵母和异常威克汉姆酵母菌株均显著提高了总酚含量（p < 0.05），其中Wa5杨梅酒的总酚含量最高（967.87 mg/L）。相比之下，Pkl8菌株显著降低了总酚含量，获得最低值（p < 0.05）。在总黄酮含量方面，所有共发酵杨梅酒均显著高于对照CK酒（p < 0.05）。类似地，除Wa5杨梅酒外，所有共发酵酒的总花青素含量均显著提高（p < 0.05），尤其是库德里阿兹威毕赤酵母和克卢伊维毕赤酵母发酵的酒样（图1A）。两株异常威克汉姆酵母菌株（Wa5和Wa7）对杨梅酒花青素含量的相反效应可能归因于菌株在花青素吸附潜力方面的特异性差异，尽管与酿酒酵母相比，异常威克汉姆酵母普遍具有较高的羟基肉桂酸脱羧酶活性和乙烯基酚吡喃花青素产量（Božič等，2020）。
一般而言，红葡萄酒的颜色强度与花青素浓度呈正相关。相应地，接种库德里阿兹威毕赤酵母和克卢伊维毕赤酵母的三款共发酵杨梅酒表现出显著更高的a值，表明红色组分更强，同时L值相应低于CK杨梅酒（p < 0.05）。多种机制可能解释毕赤酵母共发酵酒的颜色增强。库德里阿兹威毕赤酵母可能表现出更高的羟基肉桂酸脱羧酶（HCDC）活性，促进稳定的吡喃花青素形成（Morata等，2012；Zhou等，2024）。它还可能产生更多vitisin型吡喃花青素形成的前体以稳定颜色（Morata等，2012）。此外，酵母来源的多糖（如甘露糖蛋白）可能通过非共价相互作用增强花青素稳定性（Fernandes等，2021）。另外，除Wa5菌株外，所有非酿酒酵母均显著提高了杨梅酒的b值，显示出更大程度的黄色调（p < 0.05）。先前研究报道，在葡萄酒发酵中混合接种异常威克汉姆酵母和酿酒酵母可提高花青素水平（Wang等，2023b）。然而，本研究筛选的两株异常威克汉姆酵母表现出截然不同的特性。我们的发现也与先前一项报道不同——该报道显示M. pulcherrima降低了葡萄酒颜色强度以及a、b*和花青素值（Muñoz-Redondo等，2021）——表明不同非酿酒酵母菌株在混合发酵中可赋予杨梅酒独特的特性。
【数据】最高总酚：Wa5酒样，967.87 mg/L；最低总酚：Pkl8酒样（p<0.05）；总黄酮：所有共发酵酒均显著高于CK（p<0.05）；总花青素：除Wa5外均显著提高（p<0.05）；最高可滴定酸度和挥发酸度：Wa7酒样（p<0.05）；最低残糖：Pkl8共发酵酒样
3.2 陈酿期间花青素的降解动力学
图1A展示了四个月陈酿期间总花青素的降解情况。在陈酿的前两个月中，总花青素含量迅速下降，随后下降速度放缓。在第三至第四个月之间，总花青素含量保持相对恒定，表明杨梅酒的颜色在陈酿四个月后基本趋于稳定。然而，总体降解率高达73–81%，证明杨梅酒中的花青素高度不稳定且易于降解，这与先前报道一致（Li等，2024；Zhang等，2019）。陈酿早期观察到的花青素快速降解归因于多种因素：氧化、pH诱导的结构转变以及亚硫酸氢盐的亲核攻击（Morata等，2012；Cheng等，2023）。非酿酒酵母共发酵同时提高了花青素的含量和稳定性。陈酿四个月后，Pk2共发酵杨梅酒在所有样品中总花青素含量最高，比CK酒高出124%。Pk2酒优异的颜色稳定性可能归因于其均衡产生吡喃花青素前体以及可能的更高HCDC活性，这能促进稳定吡喃花青素的形成（Morata等，2012；Zhou等，2024）。如图1B所示，Pk2、Pg6、Mp13和Pkl8共发酵酒在陈酿四个月后显示出更深的颜色强度。相比之下，尽管Pk3共发酵酒在发酵结束时表现出较高的初始花青素水平和a*值，但它在陈酿期间花青素降解最快，未能维持高水平的颜色稳定性——可能原因是稳定色素产量较低或前体代谢效率不足。然而，需要更广泛的研究来证实这些假设。
【数据】花青素总降解率：73–81%；Pk2酒陈酿4个月总花青素比CK高124%；快速降解期：前2个月；稳定期：第3–4个月；颜色最深的共发酵酒：Pk2、Pg6、Mp13、Pkl8
3.3 挥发性化合物与感官评价
#### 3.3.1 挥发性化合物
在发酵结束（EOF）和陈酿四个月（4 MA）时，杨梅酒样品中分别鉴定出43种和36种挥发性化合物，分为六个化学家族（补充表3和4）。高级醇是酵母在酒精发酵过程中产生的一类理想挥发性化合物，对葡萄酒香气贡献显著并赋予草本香气（Jiang等，2025；Álvarez-Suárez等，2026）。在所有挥发性化合物家族中，高级醇在两个阶段的所有杨梅酒中均表现出最高丰度，检测到的高级醇数量从EOF时的15种减少到4 MA时的10种。酯类主要在发酵过程中形成，是杨梅酒香气的第二大贡献者。酯类赋予细腻的果香和花香，并影响葡萄酒的感官特性和香气特征（Jiang等，2025；Álvarez-Suárez等，2026）。在EOF和4 MA两个阶段，杨梅酒中均持续检测到15种乙酸酯和乙基酯。除单萜醇外，石竹烯（杨梅的特征化合物）的异构体和氧化衍生物也在两个阶段被检测到。不同非酿酒酵母菌株对杨梅酒中各类挥发性化合物的影响……（原文后续未详述）。
【数据】EOF鉴定挥发性化合物：43种；4 MA鉴定挥发性化合物：36种；化学家族：6类；高级醇数量：EOF 15种→4 MA 10种；酯类数量：两个阶段均15种
讨论与解读
本研究系统揭示了非酿酒酵母菌株特异性代谢活动对杨梅酒风味动态和陈酿稳定性的决定性作用。Pk2菌株展现出作为优良起始菌株的潜力——提供一致的感官品质和陈酿稳定性，尽管在发酵结束时有短暂溶剂味——适合优质杨梅酒的商业化生产。相比之下，Pkl8菌株虽产生强烈的新鲜果香，但由于其较差的陈酿稳定性，更适合短期即饮型产品。这些发现为杨梅酒生产者提供了菌株选择框架，可根据产品定位（即饮或陈酿）定制发酵方案，同时凸显了本土非酿酒酵母在丰富果酒产品组合中的价值。未来研究应聚焦于这些菌株特异性代谢性状的遗传基础，以实现靶向起始菌株开发。
编译者解读
本研究最值得称道之处在于采用了时间序列多组学策略——将挥发性代谢物、非挥发性代谢物与感官评价在EOF和4 MA两个时间点进行关联分析，从而区分了"发酵期风味生成"与"陈酿期风味维持"两个阶段的不同代谢逻辑。Pk2与Pkl8这对"对照组合"尤其具有工业参考价值：前者以碳氮流重定向和胁迫适应路径激活换取陈酿稳定性，后者以酯类和萜烯类高产换取即饮香气——这种"稳定性"与"爆发力"的权衡正是果酒菌株筛选的核心命题。从合成生物学角度看，若能将Pk2的代谢调控机制解析至关键酶水平（如HCDC、支链氨基酸转氨酶），有望通过代谢工程在单一菌株中兼顾两种优良性状。局限在于，当前结论仍以表型和代谢物相关性为主，菌株基因组层面的遗传差异尚未深入挖掘，这为后续功能基因验证留下了空间。
参考来源
Zhang Y. Strain-specific metabolic trajectories of indigenous non-Saccharomyces yeasts shape volatile, non-volatile, and sensory profiles of bayberry wine: A time-series multi-omics analysis. LWT, 2026. DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119830
DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119830