来源：Engineering glucose metabolism for enhanced muconic acid production in Pseudomonas putida KT2440（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
恶臭假单胞菌KT2440是重要的工业生物催化剂，但将其改造为高效生产粘康酸（muconate）的菌株时，删除葡萄糖脱氢酶基因（gcd）虽消除了副产物2-酮葡萄糖酸的积累，却导致菌株生长严重受阻。本研究通过适应性实验室进化、基于粘康酸响应型生物传感器的荧光激活细胞分选（FACS）以及理性工程改造三种策略，成功鉴定出hexR、gntZ和gacS三个关键基因缺失可协同提升菌株生长和粘康酸产量。最终工程菌株在补料分批生物反应器中达到22.0 g/L粘康酸，产率0.21 g/L/h，较亲本菌株提升约3倍。
研究背景
全球气候变化危机推动可再生生物基燃料、化学品和材料的发展，微生物底盘的选择也日趋多样化。恶臭假单胞菌KT2440作为一种革兰氏阴性、耐胁迫、遗传可操作的土壤细菌，拥有丰富的代谢途径多样性，可利用多种底物生产目标产物。在葡萄糖利用方面，该菌通过Entner-Doudoroff途径、糖异生型Embden-Meyerhoff-Parnas途径和磷酸戊糖途径共同构成EDEMP循环进行代谢。然而，周质空间中的葡萄糖氧化会导致大量副产物2-酮葡萄糖酸的积累，降低产物得率与选择性。删除glucose dehydrogenase（gcd）基因虽能阻止2-酮葡萄糖酸积累，却显著减缓菌株生长和粘康酸生产。如何在不产生2-酮葡萄糖酸的前提下恢复菌株生长并提升粘康酸产量，成为本研究要解决的核心问题。
研究方法
2.1 质粒构建
所有聚合酶链式反应均使用Phusion® High-Fidelity Polymerase（New England Biolabs）。质粒构建使用Gibson Assembly® Master Mix（New England Biolabs）或NEBuilder HiFi Assembly Master Mix（New England Biolabs），随后转化至化学感受态NEB 5-α F'I q E. coli（New England Biolabs）或电击感受态P. putida KT2440。转化子在含有10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl和15 g/L琼脂的Lysogeny Broth（LB）琼脂平板上筛选，添加50 μg/mL卡那霉素（Kan50），E. coli于37°C、P. putida于30°C过夜培养。构建结果通过Sanger测序（GENEWIZ, Inc.）确认。详细质粒构建信息见补充信息。
【数据】抗生素浓度：50 μg/mL卡那霉素；培养基：LB琼脂；培养温度：E. coli 37°C / P. putida 30°C；测序方法：Sanger测序
2.2 菌株构建
电击感受态细胞制备方法：从甘油储备液中接种P. putida菌株至LB培养基，30°C、225 rpm振荡过夜培养。按照Choi等（2006）的方法，用300 mM蔗糖洗涤制备电击感受态细胞。转化时，向60 μL电击感受态细胞中加入200–500 ng质粒DNA，使用Gene Pulser Xcell（Bio Rad）电穿孔仪，按照0.1或0.2 cm电击杯的推荐细菌电穿孔参数进行电击。电击后立即将细胞重悬于800 μL SOC复苏培养基（New England Biolabs），在1.5 mL微量离心管中于30°C、225 rpm振荡复苏2小时。基因替换按照我们此前工作Johnson和Beckham（2015）中详述的方法进行，采用基于pK18sB骨架（Jayakody等，2018）的选择标记（nptII，卡那霉素抗性）和反选择标记（sacB，蔗糖敏感）策略。正确的基因替换通过菌落PCR诊断，使用MyTaq™ Red Mix（Bioline）和与靶向同源臂外侧退火的引物。菌落在LB琼脂和LB Kan50琼脂上划线以确保卡那霉素敏感性。本研究所用菌株见表1。
【数据】电击转化质粒量：200–500 ng；电击杯规格：0.1或0.2 cm；复苏时间：2 h；复苏温度：30°C；振荡转速：225 rpm；蔗糖浓度：300 mM
2.3 摇瓶与酶标仪培养生长
摇瓶实验：从甘油储备液接种种子培养物至5 mL LB培养基，30°C、225 rpm过夜培养。随后用过夜培养物以600 nm光密度（OD600）0.2（使用Beckman DU640分光光度计，Beckman Coulter）接种至LB培养基进行第二次种子培养。第二次种子培养于30°C、225 rpm培养2–3小时，直至OD600达到约2。这些种子培养物以4500 rpm离心5分钟，沉淀重悬于1X M9盐溶液，用于接种含有改良M9极限培养基的摇瓶，培养基组成包括：6.78 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl、2 mM MgSO₄、100 μM CaCl₂、18 μM FeSO₄，以及25 mM或30 mM葡萄糖（按文中指定），起始OD600为0.1。培养生长通过定期测定OD600监测，同时经0.2 μm滤膜过滤后收集样品用于代谢物分析。
【数据】起始OD600：0.1（摇瓶）/ 0.2（种子培养）；离心条件：4500 rpm、5 min；培养基成分：6.78 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl、2 mM MgSO₄、100 μM CaCl₂、18 μM FeSO₄；葡萄糖浓度：25 mM或30 mM；培养温度：30°C；转速：225 rpm
2.4 代谢物分析
前期工作使用的粘康酸定量方法无法区分其异构体——已知cis,cis-粘康酸在pH < 7时会发生自发异构化（Carraher等，2017）。cis,cis-和cis,trans-粘康酸异构体具有不同的检测器响应因子，若未分离这两种异构体，定量结果将不准确。因此前期工作中的粘康酸滴度可能被轻微低估。本研究开发了一种新方法定量cis,cis-和cis,trans-粘康酸异构体。总粘康酸分析按照NREL实验室分析规程（Black等，2019）进行。使用配备二极管阵列检测器（DAD，监测波长265 nm）和示差折光检测器（RID）的Agilent 1200 Series系统（Agilent Technologies）。cis,cis-和cis,trans-粘康酸异构体的分离在Luna C18(2)色谱柱（5 μm，4.6 × 150 mm，Phenomenex）上完成，使用水/甲醇（80/20）含0.16%甲酸的等度流动相，流速0.65 mL/min，总运行时间15分钟。色谱柱和RID温度恒定在45°C。样品和标准品进样体积8 μL。cis,cis-和cis,trans-粘康酸分析标准品分别配制，浓度范围0.5–1000 mg/L。定量用检测器响应基于R²值≥0.995的校准曲线。葡萄糖分析在配备RID的Agilent 1200 Series HPLC系统（Agilent Technologies）上进行。分离使用Shodex SP0810糖柱（7 μm，8 × 300 mm，Shodex），HPLC级水为流动相，等度流速0.6 mL/min，总运行时间42分钟。色谱柱和RID温度分别恒定在85°C和55°C。每个样品和标准品进样体积10 μL。分析标准品购自AbsoluteStandard，浓度范围0.5–36 g/L。定量采用R²值≥0.995的标准曲线。校准验证标准品（CVS）偏差不超过3%。葡萄糖酸和2-酮葡萄糖酸按照先前发表的方法分析（Borrero-De Acuña等，2014）。
【数据】粘康酸检测波长：265 nm（DAD）；色谱柱：Luna C18(2) 5 μm, 4.6×150 mm；流动相：水/甲醇(80/20)+0.16%甲酸；流速：0.65 mL/min；运行时间：15 min；柱温：45°C；进样量：8 μL；标准品范围：0.5–1000 mg/L；R²≥0.995。葡萄糖色谱柱：Shodex SP0810 7 μm, 8×300 mm；流速：0.6 mL/min；运行时间：42 min；柱温：85°C；RID温度：55°C；进样量：10 μL；标准品范围：0.5–36 g/L；CVS偏差≤3%
2.5 适应性实验室进化
连续传代在上述改良M9极限培养基中进行，以30 mM葡萄糖为唯一碳源，30°C、225 rpm振荡培养。观察到生长后（初始需长达72小时培养），将1%（体积/体积）的培养物转移至新鲜培养基。每次传代测定OD600以记录代数，计算公式为：代数 = ln(OD终/OD初)/ln(2)。进化菌株的性能通过分离克隆并在M9 + 30 mM葡萄糖培养基上使用TECAN Infinite 200酶标仪（TECAN US）测定生长来评估。150 μL培养基以OD600 0.1接种至96孔板的各孔中。每15分钟监测生长，30°C下振幅4 mm振荡。所得OD600测量值使用标准曲线归一化，以与Beckman DU640分光光度计的输出关联。生长速率通过取TECAN测得的OD600值的自然对数并使用Python脚本自动计算培养过程中4个点的最大斜率获得。生长迟滞期计算为进入稳定期所需时间。菌株定期以甘油储备液形式保存于−80°C。
【数据】传代比例：1%（体积/体积）；葡萄糖浓度：30 mM；培养温度：30°C；转速：225 rpm；初始最长培养时间：72 h；酶标仪监测间隔：15 min；振荡振幅：4 mm；保存温度：−80°C
2.6 生物传感器介导的进化群体筛选
详细的粘康酸传感器开发信息见补充信息。进化群体用粘康酸响应型生物传感器构建体pCatM_C2转化（按2.2节方法），产生群体GB052。分选前，GB052群体从甘油储备液复苏，在LB Kan50液体培养基中过夜培养，再传代培养8小时。培养物在磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释至OD600 0.01，在BD FACSAria III流式细胞分选仪（BD Biosciences）上以GFP荧光标准设置进行分析和分选，细胞群体以FSC/SSC严格设门。采用两步分选法。第一轮，分选收集荧光最强的5%细胞，在LB Kan50液体培养基中过夜复苏。第二轮，对该亚群培养物分选荧光最强的1%细胞，分离株在LB Kan50琼脂平板上复苏。
【数据】分选前OD600：0.01；第一轮分选：前5%荧光细胞；第二轮分选：前1%荧光细胞；复苏培养基：LB Kan50
2.7 粘康酸传感器质粒从*P. putida*中的去除
（此节原文未提供完整内容）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 适应性实验室进化改善细胞生长
为改善粘康酸生产菌株CJ522在以葡萄糖为唯一碳源时的生长，进行了适应性实验室进化。前期工作证明了该菌对葡萄糖酸途径的代谢偏好（Nikel等，2015）。删除gcd因此改变了这一碳通量方向，这很可能解释了该菌株表现出的生长缺陷。我们假设适应性实验室进化可以找到克服此缺陷的解决方案。每24小时进行连续传代（1%体积/体积），或直至观察到可见生长（图2A）。初始需要72小时才能观察到生长。约45代后出现突破性生长——仅过夜培养即可观察到可见生长。所得群体保存为GB038（图2A）。从GB038群体中分离的克隆使用酶标仪筛选生长性能。亲本菌株CJ442和CJ522被纳入异质进化群体（GB038）和分离克隆的比较中（图2A，浅蓝色显示）。与保留gcd的祖亲菌株CJ442相比，CJ522中gcd缺失导致的严重生长缺陷清晰可见，与Johnson等（2019）的报道一致。进化分离株中观察到广泛的生长表型，大多数分离株相比异质进化群体GB038和未进化的亲本菌株CJ522均表现出改善的生长（图2A）。许多进化克隆相比CJ522表现出更高的最大比生长速率（μ）以及更短的迟滞期（图2B）。在进化分离株中，GB045表现出显著改善的生长，达到比CJ442更高的μ且更快（图2B）。
基于这些结果，接下来在摇瓶实验中评估了GB045的粘康酸产量。本研究使用了新的分析方法（材料与方法2.4节），可定量cis,cis-和cis,trans-粘康酸（Black等，2019）。使用该新方法，观察到cis,trans-粘康酸在摇瓶培养中约占10–15%，在pH受控的生物反应器中约占5–8%。GB045的粘康酸产量峰值比亲本菌株CJ522提前近60小时（图3A、B）。尽管GB045产粘康酸更快，但其最终粘康酸滴度显著更低（P < 0.0001）。虽然我们的分析方法专门定量粘康酸和葡萄糖作为关键代谢物，但未观察到其他明显的峰，表明没有大量共产物产生。
【数据】cis,trans-粘康酸占比：摇瓶10–15%、生物反应器5–8%；GB045产量峰值提前：~60 h；GB045最终滴度显著低于CJ522（P < 0.0001）
3.2 基于产物的筛选：粘康酸响应型生物传感器的开发
虽然GB038群体的大多数分离株比CJ522生长更快，但这些进化分离株不一定产生更多粘康酸——菌株GB045即为明证（图3B）。另一种策略是基于粘康酸产量进行高通量筛选，以分离同时具有改善生长和粘康酸产量的菌株。基于荧光激活细胞分选（FACS）的高通量分析方法可根据粘康酸产量分离细胞，但首先需要功能性粘康酸响应型生物传感器。
#### 3.2.1 用于粘康酸检测的传感器-报告基因构建体
鉴于粘康酸是β-酮己二酸途径中的关键中间体，数种生物已进化出粘康酸响应型调控因子（Harwood和Parales，1996）。两个研究较为透彻的粘康酸响应转录因子是来自Acinetobacter baylyi ADP1的CatM和BenM（Tropel和van der Meer，2004）。虽然此前已在E. coli（Rogers和Church，2016）和S. cerevisiae（Skjoedt等，2016）中建立了粘康酸传感器，但两者均使用BenM开发，而BenM通过次级结合位点与苯甲酸盐的交叉反应已有充分文献记载（Ezezika等，2007）。因此选择CatM开发用于P. putida的粘康酸传感器。传感器pCatM的构建使得超折叠GFP（sfgfp）（Pédelacq等，2006）的转录受catM-catB基因间启动子区（称为P_catB）控制，该区域包含三个CatM结合位点（Ezezika等，2006）（图4A和图S1）。P. putida KT2440不能以粘康酸为唯一碳源生长，提示粘康酸转运能力差，因此使用可被摄入并代谢为粘康酸的前体来表征传感器。使用一株经改造可高效将前体原儿茶酸（PCA）、苯甲酸盐和儿茶酚转化为粘康酸的菌株（CJ184，Johnson等，2016）来表征传感器pCatM。遗憾的是，由PCA产生的粘康酸未能诱导GFP表达（图4B和图S1A，pCatM），表明需要进一步优化传感器。
核糖体结合位点（RBS）被替换为最优序列——此策略此前已被证明可改善传感器动态范围（Jha等，2014）。启动子和操纵子位点也进行了多样化以改善动态范围（图S1B）。构建了包含超过65,000种RBS、启动子和操纵子组合的质粒文库（pCatM_lib），并转化至菌株CJ184（Johnson等，2016），生成文库RJ17A。随后在PCA和其他粘康酸前体存在下，使用FACS筛选RJ17A（图S2）。分离克隆进行进一步表征，构建体pCatM_C2被鉴定为最优粘康酸响应型变体，具有低背景荧光和高动态范围（图4B和图S2C）。与初始传感器pCatM不同，引入菌株CJ184的pCatM_C2（菌株RJ17O）对由PCA、苯甲酸盐和儿茶酚代谢产生的胞内粘康酸表现出清晰的剂量依赖性响应（图4B、D）。为测试传感器特异性，将pCatM_C2转化至CJ072（Jha等，2018），生成菌株RJ17P（图4C）。当RJ17P暴露于苯甲酸盐和儿茶酚时，由于β-酮己二酸途径的儿茶酚分支完整，观察到剂量依赖性荧光响应（图4C和D）。由于RJ17P中粘康酸分解代谢基因完整，预期其胞内粘康酸浓度低于RJ17O——因为粘康酸被代谢用于细胞生长。与此一致，RJ17P中的传感器响应显著低于RJ17O（图4D）。还评估了传感器对苯甲酸盐、儿茶酚和PCA的交叉反应性，三者均未激活传感器（图S3）。通过测定饲喂一系列粘康酸前体浓度的菌株中的荧光响应和粘康酸浓度，确定了粘康酸浓度与荧光之间的直接相关性（图S4）。综合这些数据表明，优化后的构建体pCatM_C2是P. putida中合适的胞内粘康酸传感器。
【数据】传感器文库规模：>65,000种组合；筛选方法：FACS；传感器响应：剂量依赖性；交叉反应：苯甲酸盐/儿茶酚/PCA均无激活
#### 3.2.2 FACS分离产粘康酸细胞
将这种新型粘康酸响应型生物传感器用于从进化群体GB038中分离具有改善粘康酸产量的克隆。该群体用pCatM_C2生物传感器转化，所得群体命名为GB052，通过流式细胞术分析粘康酸诱导的GFP荧光。观察到多个GFP群体，证实进化群体内粘康酸产量的异质性。收集GFP信号最强的5%细胞，复苏后第二轮分选GFP荧光前1%的细胞（图S5）。由此分离出两个克隆，命名为NN21和NN23。
【数据】第一轮分选：前5% GFP信号；第二轮分选：前1% GFP荧光；分离克隆：NN21、NN23
#### 3.2.3 分选克隆的摇瓶表征
接下来检查了这些分选克隆的粘康酸产量。由于分离克隆携带生物传感器质粒，首先去除质粒以消除相关代谢负担，分别从NN21和NN23生成菌株NN97和NN103（表1）。进行摇瓶培养，两株菌相比菌株CJ522均表现出改善的生长（原文此处截断）。
【数据】原文未详述（此段原文被截断）
（以下结果部分原文节选结束）
讨论与解读
本研究探索了多种策略来克服P. putida KT2440中因删除葡萄糖脱氢酶导致的生长缺陷——该缺陷是工程菌株以葡萄糖生产粘康酸时的瓶颈。不删除该基因时，大量2-酮葡萄糖酸积累，降低粘康酸得率和产率（Johnson等，2019）。研究采用三种方法改善菌株性能：进化、生物传感器辅助筛选和理性工程。基于生长单独筛选进化菌株时，所得克隆虽生长改善但粘康酸产量受损。粘康酸响应型生物传感器的开发使基于目标产物粘康酸的克隆筛选成为可能，分离出的克隆在生长和粘康酸产量两方面均有显著提升。两种方法获得的克隆中观察到的突变指导了理性工程改造——edd启动子突变指向hexR缺失，另有突变提示GntZ和GacS参与菌株性能。三基因缺失共同改善了菌株生长和粘康酸产量。
编译者解读
本研究的亮点在于将无偏进化筛选与理性逆向工程有机结合——先通过FACS生物传感器筛选获得优良克隆，再利用全基因组重测序锁定关键突变位点，最终用靶向基因敲除验证并简化改造方案。这种"进化发现—机制解析—精准重构"的闭环策略值得合成生物学借鉴。值得注意的是，研究开发的新型粘康酸定量方法区分了cis,cis和cis,trans异构体，修正了此前可能被低估的滴度数据，提示分析方法的严谨性在代谢工程中同样关键。最终三基因缺失菌株实现22.0 g/L粘康酸、产率0.21 g/L/h、得率38%（mol/mol），展示了组合改造的协同效应。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2020
DOI: 10.1016/j.ymben.2020.01.001
DOI: 10.1016/j.ymben.2020.01.001