无质粒大肠杆菌代谢工程强化葡萄糖合成戊二酸

来源：Metabolic engineering of plasmid-free Escherichia coli for enhanced glutarate biosynthesis from glucose（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：高级引物设计工具

导读

戊二酸是合成聚酯和聚酰胺的重要前体，但现有高产菌株多依赖质粒系统，难以满足工业化需求。本研究以赖氨酸高产菌株为底盘，通过ARTP诱变、MUCICAT基因组整合、戊二酸生物传感器筛选及转运蛋白工程等手段，构建了一株无质粒重组大肠杆菌。最终在5-L补料分批发酵中，工程菌RY29实现戊二酸产量44.8 g/L、得率0.28 g/g、生产强度0.62 g/L/h。该研究为微生物细胞工厂稳定生产戊二酸提供了系统性的基因组整合策略。

研究背景

戊二酸是一种C5二羧酸，广泛用于聚酯和聚酰胺的合成。目前工业上主要通过丁内酯与氰化钾的开环反应生产，但该工艺存在能耗高、产生有毒废弃物和环境污染等问题。开发生物合成方法已成为可持续替代的重要方向。目前已报道的戊二酸生物合成途径包括α-酮戊二酸还原途径、反向己二酸降解途径、酮戊二酸碳链延伸途径以及赖氨酸降解途径。其中，基于赖氨酸降解的5-氨基戊酸（5-AVA）和尸胺（CAD）途径因可利用高产赖氨酸菌株而具有广阔应用前景。已有研究利用CAD途径在大肠杆菌中实现54.5 g/L戊二酸产量，而利用5-AVA途径的谷氨酸棒杆菌工程菌在69小时内产量达105.3 g/L，为目前报道的最高产量。然而，这些研究多依赖质粒表达系统，存在代谢负担重、遗传不稳定等缺陷，不利于工业化应用。本研究旨在构建一株无质粒重组大肠杆菌，通过基因组整合实现戊二酸的高效稳定合成。

研究方法

2.1 菌株与质粒

本研究所用菌株、质粒、引物、crRNA、启动子及异源基因分别列于表S1至S6。大肠杆菌JM109作为质粒构建的克隆宿主，大肠杆菌Lys（CCTCC M2019435）作为筛选高产赖氨酸突变株的起始菌株。质粒构建使用Vazyme Biotech的一步克隆试剂盒和Takara Bio的连接克隆试剂盒。来自恶臭假单胞菌的PpdavB、PpdavA、PpdavT、PpdavD和PpCsiR编码基因由Azenta Life Sciences合成，并针对大肠杆菌进行了密码子优化。基于MUCICAT（CRISPR相关转座酶多拷贝染色体整合）系统的质粒（pDonor、pQCascade和pCutAmp）按照Zhang等人报道的序列合成。pDonor质粒使用Vazyme Biotech的一步克隆试剂盒构建，并与davBA和davTD基因连接。构建pQCascade时，设计含有靶向不同位点crRNA的引物作为同源臂，用于线性化和同源重组。含有八个不同位点crRNA的pQarray-1质粒由Azenta Life Sciences合成。

【数据】菌株：E. coli JM109、E. coli Lys (CCTCC M2019435)；质粒：pDonor、pQCascade、pCutAmp、pQarray-1；基因：PpdavB、PpdavA、PpdavT、PpdavD、PpCsiR；工具：Vazyme一步克隆试剂盒、Takara连接克隆试剂盒

2.2 培养基

LB培养基（酵母提取物5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L）用于大肠杆菌JM109的培养。斜面培养基（胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L、丙酮酸钠0.4 g/L、酵母提取物5.0 g/L、琼脂20.0 g/L）、一级种子培养基（胰蛋白胨7.0 g/L、蔗糖3.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、(NH4)2SO4 2.5 g/L、K2HPO4 1.0 g/L）和二级种子培养基（无水葡萄糖15.0 g/L、玉米浆干粉4.5 g/L、(NH4)2SO4 14.4 g/L、KH2PO4 1.44 g/L）用于细菌培养。发酵培养基含葡萄糖30 g/L、玉米浆粉15 g/L、甜菜糖蜜35.2 mL/L、生物素30 μg/L、(NH4)2SO4 1.8 g/L、甜菜碱4 g/L、KH2PO4 0.6 g/L、K2HPO4 1.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L。

【数据】LB培养基：酵母提取物5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L；斜面培养基：胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L、丙酮酸钠0.4 g/L、酵母提取物5.0 g/L、琼脂20.0 g/L；一级种子：胰蛋白胨7.0 g/L、蔗糖3.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、(NH4)2SO4 2.5 g/L、K2HPO4 1.0 g/L；二级种子：无水葡萄糖15.0 g/L、玉米浆干粉4.5 g/L、(NH4)2SO4 14.4 g/L、KH2PO4 1.44 g/L；发酵培养基：葡萄糖30 g/L、玉米浆粉15 g/L、甜菜糖蜜35.2 mL/L、生物素30 μg/L、(NH4)2SO4 1.8 g/L、甜菜碱4 g/L、KH2PO4 0.6 g/L、K2HPO4 1.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L

2.3 培养条件

摇瓶发酵。 大肠杆菌菌株首先在斜面固体培养基上于37°C培养24小时。用10 mL无菌水冲洗大肠杆菌，取2.5 mL菌悬液接种至100 mL一级种子培养基中。摇瓶在190 rpm、37°C条件下振荡培养8小时。随后，将5 mL一级种子培养物转移至42 mL二级种子培养基中，在190 rpm、37°C条件下振荡培养8.5小时。最后，以15%（v/v）的比例接种发酵培养基，在190 rpm、37°C条件下振荡培养72小时。

5-L发酵罐发酵。 戊二酸发酵过程中温度维持在37°C。使用纯氨水将pH调节至6.9，同时用500 g/L (NH4)2SO4溶液将氨氮含量控制在0.05%至0.10%之间。使用800 g/L葡萄糖溶液确保残糖水平维持在0至1 g/L之间。为维持溶解氧（DO）水平为30%，搅拌速度初始设定为500 rpm，随后增加至800 rpm。当搅拌达到800 rpm时，罐压从0逐渐升至0.09 MPa。通过添加消泡剂抑制泡沫形成。

【数据】斜面培养：37°C、24h；一级种子：190rpm、37°C、8h、接种量2.5mL/100mL；二级种子：190rpm、37°C、8.5h、接种量5mL/42mL；发酵：15%接种量、190rpm、37°C、72h；5-L发酵：温度37°C、pH 6.9（纯氨水）、氨氮0.05%-0.10%、残糖0-1 g/L、DO 30%、搅拌500→800rpm、罐压0-0.09MPa

2.4 菌株诱变与筛选

ARTP诱变和菌株筛选按照先前研究的方法进行。将大肠杆菌Lys在LB培养基中培养12小时，5000 rpm离心收集细胞。细胞用无菌水洗涤两次，重悬于10%甘油中至光密度（OD562）约为1.0。菌悬液用常压室温等离子体（ARTP）诱变系统处理25秒。采用流式细胞术筛选突变体文库中高荧光强度的菌株，随后将筛选出的菌株涂布于选择性琼脂平板上。将所得菌落接种至96孔深孔板中进行进一步培养，最终分离获得LYS-01至LYS-24菌株。

【数据】ARTP处理：25s；细胞浓度：OD562≈1.0；离心：5000rpm；重悬液：10%甘油；筛选方法：流式细胞术+96孔深孔板

2.5 荧光强度测定

为测定荧光强度，将对数期细胞以初始OD562为0.5接种至含有3 mL LB培养基的24孔板中。培养8小时后，使用SpectraMax M3酶标仪（Molecular Devices，美国）测量荧光强度。mKate荧光强度在激发波长588 ± 10 nm和发射波长645 ± 10 nm下检测。GFP荧光强度在激发波长488 ± 10 nm和发射波长525 ± 10 nm下检测。

【数据】接种OD562：0.5；培养：8h；mKate：激发588±10nm/发射645±10nm；GFP：激发488±10nm/发射525±10nm；仪器：SpectraMax M3

2.6 基因编辑工具选择

使用CRISPR/Cas9、Cas-12a、Cas-12f和MUCICAT系统评估大肠杆菌LYS-14中的基因编辑工具，操作流程遵循先前报道的方案。PCR扩增基因组位点的同源臂和GFP基因，融合后生成供体DNA。将供体DNA与靶向每个位点的三个gRNA一起导入携带质粒的宿主细胞中。通过菌落PCR评估整合效率。

【数据】评估系统：CRISPR/Cas9、Cas-12a、Cas-12f、MUCICAT；方法：菌落PCR

2.7 基因组整合

使用MUCICAT系统进行基因组整合涉及pDonor、pQCascade（或其变体）和pCutAmp质粒的转化和诱导。为实现多位点整合并避免使用额外质粒，将戊二酸生物传感器构建在pCutAmp质粒上以生成其变体（pCutAmp-csiR-PG-mKate）。首先通过热激将pCutAmp质粒（或其变体pCutAmp-csiR-PG-mKate，用于多位点整合）导入化学感受态细胞。随后将所得重组菌株制备成电转感受态，通过电穿孔导入pDonor和pQCascade（或其变体pQCascade-array-1，用于多位点整合）。转化细胞在含33 μg/mL氯霉素、100 μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL卡那霉素的三抗LB-琼脂平板上筛选。37°C培养24小时后，刮取菌落，重悬于新鲜LB培养基中，重新涂布于含相同抗生素和1000 ng/mL脱水四环素（aTC）的LB-琼脂平板上，以诱导转座相关蛋白的表达。37°C再培养24小时后，将菌落刮入含100 μg/mL氨苄青霉素和10 mM鼠李糖的LB培养基中，以消除pDonor和pQCascade。随后将细胞划线涂布于含相同抗生素和鼠李糖的LB-琼脂平板上。随机挑选菌落进行菌落PCR验证或在24孔板中筛选（用于多位点整合）。最后，含有sacB基因的pCutAmp质粒（或其变体）通过在含10 g/L蔗糖的LB-琼脂平板上划线被消除。

【数据】抗生素：氯霉素33 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL；诱导剂：aTC 1000 ng/mL；质粒消除：氨苄青霉素100 μg/mL+鼠李糖10mM；sacB反选：蔗糖10 g/L；温度：37°C；时间：24h×2

2.8 转录组分析

将对数期大肠杆菌细胞用30 g/L戊二酸处理6小时。随后在4°C、5000 rpm条件下离心5分钟，用PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤两次，液氮冷冻后送至Genewiz进行转录组数据分析。对照菌株不进行戊二酸胁迫处理。

【数据】戊二酸浓度：30 g/L；处理时间：6h；离心：4°C、5000rpm、5min；缓冲液：PBS pH 7.4

2.9 拷贝数测定

拷贝数通过菌落PCR测定。验证引物设计靶向基因组中crRNA上游和下游250 bp的区域。使用2×Phanta Flash Master Mix（Vazyme Biotech）生成菌落PCR产物。从平板上随机挑选菌落，转移至含10 μL 2×Phanta Flash Master Mix、1 μL引物和8 μL H2O的反应混合物中。PCR程序如下：95°C初始变性5分钟；随后34个循环的98°C变性10秒、55°C退火5秒、72°C延伸40秒；最后4°C保持。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离以确认整合状态。阳性样品随后送至Azenta Life Sciences进行进一步验证。

【数据】引物设计：crRNA上下游各250bp；PCR体系：2×Phanta Flash Master Mix 10μL、引物1μL、H2O 8μL；PCR程序：95°C 5min；34×（98°C 10s、55°C 5s、72°C 40s）；4°C保持；电泳：1%琼脂糖凝胶

研究结果

3.1 在赖氨酸高产菌株中引入戊二酸生物合成途径

选择实验室保存的L-赖氨酸生产菌株大肠杆菌Lys（CCTCC M2019435）作为戊二酸生物合成的底盘菌株。为提高赖氨酸产量，利用先前报道的赖氨酸响应启动子和报告蛋白绿色荧光蛋白（GFP）构建了赖氨酸生物传感器（pAG）。含pAG的大肠杆菌Lys经ARTP诱变系统处理。突变体文库培养12小时后，通过FACS基于eGFP信号分选突变菌株，获得143个菌落并进一步在96深孔板中筛选。随后，选择荧光强度最高的24株菌（LYS-01至LYS-24）进行摇瓶发酵测试。培养48小时后，最优突变株LYS-14达到最大OD562为25，赖氨酸产量、得率和生产强度分别为11.2 g/L、0.48 g/g和0.23 g/L/h（图S1）。

本研究选择5-AVA途径用于戊二酸生产，因其所需辅因子和酶最少（图1a）。该途径包括来自恶臭假单胞菌KT2240的L-赖氨酸2-单加氧酶（DavB）、5-氨基戊酰胺酶（DavA）、5-氨基戊酸转氨酶（DavT）和戊二酸半醛脱氢酶（DavD）。将密码子优化的davBATD基因克隆至不同拷贝数的表达质粒中（pTet为低拷贝数，pETM6R1为中拷贝数，pRSF为高拷贝数），并导入LYS-14菌株，获得大肠杆菌RY01菌株。摇瓶培养显示，携带pTet（低拷贝）的RY01因基因表达不足，戊二酸产量有限（0.15 g/L）；而高拷贝pRSF变体则因严重代谢负担同样导致低产率。最优性能由中拷贝pETM6R1质粒实现，戊二酸产量为0.65 g/L，赖氨酸为2.7 g/L（图1b和图S2）。然而，即使该菌株与亲本LYS-14相比，最大细胞密度（OD562）仍降低58.0%，葡萄糖消耗减少47.4%（图1c），表明存在显著的代谢权衡。推测质粒上5-AVA途径酶的组成型表达造成了代谢负担，对细胞生长和赖氨酸生物合成产生负面影响。因此，考虑将戊二酸生物合成途径整合到大肠杆菌LYS-14的基因组中。

【数据】最优突变株LYS-14：OD562=25、赖氨酸11.2 g/L、得率0.48 g/g、生产强度0.23 g/L/h；RY01-pTet：戊二酸0.15 g/L；RY01-pETM6R1：戊二酸0.65 g/L、赖氨酸2.7 g/L；细胞密度降低58.0%；葡萄糖消耗减少47.4%

3.2 戊二酸生物合成途径的染色体整合

鉴于传统基因编辑策略（如CRISPR-Cas9）在ARTP来源突变株LYS-14中效率较低（<1%），本研究探索了高效基因编辑工具和稳定整合位点，用于将AMV途径基因染色体整合以生产戊二酸。为选择合适的基因编辑方法，以GFP为报告基因，评估了三种方法——Cas-12a、Cas-12f和CRISPR相关转座酶多拷贝染色体整合（MUCICAT）——在三个中性位点yncI、yahJ和gatZ的基因编辑效率（图2a）。在这些方法中，MUCICAT利用crRNA引导转座酶将目标DNA序列插入细菌染色体而不造成双链DNA断裂，平均基因整合效率达72%，显著优于其他两种方法（图2b）。因此，选择MUCICAT构建戊二酸微生物细胞工厂。

为鉴定菌株LYS-14中适合基因编辑的整合位点，通过将菌株E. coli LYS-14与模式菌株E. coli MG1655的基因组序列进行比较，共筛选了15个候选位点。这些潜在整合位点包括推定基因（yncI、rph、ilvG、gatZ、yahJ、yciQ、yjgN、ylbE、yeeP、yejO、yfdH和ygaY）和副产物基因（ldcC、cadA和csiD）。使用MUCICAT方法，将受组成型启动子PTac控制的报告基因gfp整合至这些位点，以评估整合效率、细胞生长和基因表达水平。如图2c所示，yncI、ilvG、gatZ和rph的整合效率接近100%。除ylbE和yciQ外，大多数位点的整合效率均大于50%，展示了MUCICAT方法的高效性（图2c）。所有15株工程菌的最大光密度（OD562）均与对照菌株相当（图2d），表明这些位点的基因组整合未干扰正常细胞生长。各位点的表达水平在荧光强度上差异达4.1倍（图2d），其中ilvG的荧光强度最高（86,570 Flu/OD562），yciQ最低（21,058 Flu/OD562）。位点cadA、yncI和yahJ表现出相对较高的表达水平，因此优先用于戊二酸合成途径的基因整合。此外，为测试不同整合位点的表达稳定性，将整合GFP于不同位点的菌株传代培养30代以上。GFP荧光波动值小于5%，表明每个位点在传代过程中均保持稳定表达（图S3）。

随后，将戊二酸合成途径整合至赖氨酸高产菌株E. coli LYS-14中。该途径在5-AVA代谢节点处分为上游DavBA模块和下游DavTD模块。这些模块在yncI和ilvG位点使用三种启动子（PTac、PTrc、PT5）进行优化，获得9株工程菌（命名为E. coli RY02至RY10）。摇瓶培养中，E. coli RY06的戊二酸产量最高，达2.1 g/L，较E. coli RY01提高2.2倍（图2e）。此外，E. coli RY06的OD562达到18.0，葡萄糖消耗为23.8 g/L，分别增加122.2%和72.5%（图S4）。然而，5-AVA的积累（5.8 g/L）表明下游DavTD模块仍需加强。

【数据】MUCICAT平均整合效率：72%；yncI/ilvG/gatZ/rph整合效率：~100%；表达水平差异：4.1倍；ilvG荧光：86,570 Flu/OD562；yciQ荧光：21,058 Flu/OD562；传代稳定性：30代、波动<5%；RY06：戊二酸2.1 g/L、较RY01提高2.2倍、OD562=18.0、葡萄糖消耗23.8 g/L、分别增加122.2%和72.5%；5-AVA积累：5.8 g/L

3.3 基于戊二酸生物传感器的菌株筛选平台的建立

除启动子工程外，MUCICAT系统还支持基因拷贝数和整合位点的组合优化，从而实现对限速酶表达的精准微调。为此，开发基于戊二酸响应生物传感器的高通量筛选平台至关重要。先前研究表明，恶臭假单胞菌KT2440中的调控蛋白CsiR与csiD基因的PG启动子结合，抑制其转录，戊二酸作为效应物发挥作用（图S5a）。受此启发，本研究设计并评估了戊二酸生物传感器系统（Ptac-csiR/PG-mKate），但发现无论是否添加戊二酸，荧光强度均可忽略不计（图S5a和S5b）。高水平的csiR表达可能阻止了启动子PG结合区域的完全释放。为优化传感器性能，评估了不同启动子和优化RBS用于CsiR表达。最优组合（由PJ23113和RBS30控制）表现出最大的线性范围，在2至18 mM范围内有60倍的变化（图S4c和图S5d）。此外，通过测试戊二酸生物合成的已知前体验证了传感器的特异性；即使在高浓度（40 mM）下，戊二酸副产物也未触发mKate表达超过对照基线（图S5e）。

构建了靶向八个特定基因组位点（yfdH、yejO、gatZ、rph、yjgN、csiD、ldcC和cadA）的pQarray-1质粒，并导入大肠杆菌RY06菌株中。该策略便于对戊二酸合成途径中限速DavTD模块进行拷贝数和整合位点的组合优化（图3a）。通过流式细胞术基于mKate荧光强度对整合菌株文库进行分选，从约8,000个突变体中筛选出高荧光菌株。经96深孔板复筛和摇瓶验证，获得最优菌株E. coli RY29。该菌株戊二酸产量达5.2 g/L，较RY06提高148%（图3b）。同时，E. coli RY29的OD562为17.2，葡萄糖消耗为26.2 g/L，残余5-AVA降至1.8 g/L（图3c和图3d）。这些结果表明，基于生物传感器的高通量筛选平台有效优化了限速模块的拷贝数和整合位点，显著提升了戊二酸合成效率。

【数据】传感器线性范围：2-18mM、60倍变化；副产物测试浓度：40mM；pQarray-1靶位点：yfdH、yejO、gatZ、rph、yjgN、csiD、ldcC、cadA；突变体文库：~8,000个；RY29：戊二酸5.2 g/L、较RY06提高148%、OD562=17.2、葡萄糖消耗26.2 g/L、残余5-AVA 1.8 g/L

3.4 转运蛋白工程强化戊二酸生产

在戊二酸合成途径优化的基础上，戊二酸的跨膜转运对进一步提高产量至关重要。通过转录组分析，鉴定出一个潜在的戊二酸转运蛋白YidE。为验证其功能，将yidE基因与赖氨酸转运蛋白基因lysP在大肠杆菌RY29中分别及组合过表达（图4a）。摇瓶评估结果显示，单独过表达yidE使戊二酸产量从5.2 g/L提高至6.1 g/L；单独过表达lysP使产量提高至5.8 g/L；而同时过表达yidE和lysP的菌株产量最高，达7.2 g/L（图4b）。细胞生长方面，过表达yidE和lysP的菌株OD562为17.8，与对照菌株（17.2）相当（图4c）。葡萄糖消耗为26.8 g/L，与对照（26.2 g/L）相近。这些结果表明，YidE作为戊二酸外排转运蛋白，与赖氨酸内转运蛋白LysP协同作用，有效促进了戊二酸的分泌，缓解了产物对细胞的毒性。

【数据】RY29+yidE：戊二酸6.1 g/L；RY29+lysP：戊二酸5.8 g/L；RY29+yidE+lysP：戊二酸7.2 g/L、OD562=17.8、葡萄糖消耗26.8 g/L；对照：戊二酸5.2 g/L、OD562=17.2、葡萄糖消耗26.2 g/L

3.5 5-L生物反应器中菌株RY29的生产性能优化

在摇瓶水平获得最优菌株E. coli RY29后，进一步在5-L生物反应器中评估其补料分批发酵性能。首先优化了发酵过程中的pH条件。在pH 6.9条件下，戊二酸产量为38.5 g/L；pH 7.2时产量降至35.2 g/L；pH 6.6时产量为33.8 g/L（图5a）。pH 6.9为最优条件。随后在pH 6.9条件下优化溶解氧（DO）水平。DO为30%时，戊二酸产量达44.8 g/L；DO为20%时产量为36.4 g/L；DO为40%时产量为41.2 g/L（图5b）。DO 30%仍为最优条件。在最优条件（pH 6.9、DO 30%）下进行补料分批发酵，E. coli RY29在72小时内戊二酸产量达到44.8 g/L，得率为0.28 g/g葡萄糖，生产强度为0.62 g/L/h（图5c）。最终戊二酸对葡萄糖的得率较初始菌株提高了数倍，展示了基因组整合策略结合发酵条件优化的有效性。

【数据】pH优化：6.9→38.5 g/L、7.2→35.2 g/L、6.6→33.8 g/L；DO优化：30%→44.8 g/L、20%→36.4 g/L、40%→41.2 g/L；最优发酵：戊二酸44.8 g/L、得率0.28 g/g、生产强度0.62 g/L/h、时间72h

讨论与解读

本研究成功构建了一株无质粒大肠杆菌用于戊二酸生物合成。无质粒菌株具有两方面关键优势：（1）降低代谢负担——基因组整合避免了质粒复制与宿主代谢之间的资源竞争，同时消除了非必需基因（如抗生素抗性标记）的不必要表达；（2）提高遗传稳定性——染色体整合确保生产途径在传代中稳定遗传，不同于质粒系统在细胞分裂过程中容易丢失。这不仅降低了生产成本，在食品和医药等领域的应用中也具有显著优势。

目前常用的三种基因组整合优化策略各有不足：CRISPR-Cas9不适用于非模式微生物；Cas-12a和Cas-12f虽扩大了靶向范围，但在某些菌株中效率有限；MUCICAT系统虽然高效，但需要复杂的质粒体系。本研究系统评估了这些工具在ARTP突变株中的表现，最终选择MUCICAT作为基因整合工具，并筛选出15个适合的整合位点，为无质粒菌株的构建奠定了基础。通过戊二酸生物传感器结合MUCICAT系统，实现了限速模块拷贝数和整合位点的高通量组合优化，这一策略具有通用性，可推广至其他产物的代谢工程改造。

编译者解读： 本研究的技术路线具有突出的工程系统性和可移植性——从底盘菌株诱变、基因组整合工具筛选、生物传感器辅助高通量筛选到转运蛋白挖掘，形成了一套完整的无质粒菌株构建范式。特别是将MUCICAT与代谢物生物传感器联用，巧妙解决了基因组多拷贝整合缺乏高通量筛选手段的瓶颈。然而，44.8 g/L的产量与已报道的质粒系统（105.3 g/L）仍有差距，说明无质粒策略在表达强度上的固有局限。未来若能在基因组整合表达强度和发酵工艺（如两阶段发酵）上进一步突破，该策略在工业化应用中的潜力将更加可观。

参考来源

Chu R, et al. Metabolic engineering of plasmid-free Escherichia coli for enhanced glutarate biosynthesis from glucose. Chemical Engineering Journal, 2025. DOI: 10.1016/j.cej.2025.163077

DOI: 10.1016/j.cej.2025.163077