来源：In situ product recovery as a powerful tool to improve the fermentative production of muconic acid in Saccharomyces cerevisiae（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
粘康酸是合成己二酸、对苯二甲酸等重要工业化学品的关键生物基平台分子。然而，产物对微生物的毒性抑制严重限制了其发酵产量。本研究开发了一种基于原位产物回收（ISPR）的发酵策略，通过反应萃取将粘康酸从发酵液中持续移除以解除产物抑制。研究团队筛选出12.5% CYTOP 503/菜籽油组成的萃取体系，兼具高萃取能力和良好生物相容性，在摇瓶水平使生长和产量分别提升44%和18%，并在10 L生物反应器中实现了4.33 g/L的最终产量。
研究背景
在可持续发展需求驱动下，生物基有机酸作为平台化学品的地位日益重要。粘康酸可用于合成对苯二甲酸、己内酰胺和己二酸等重要工业单体。然而，有机酸对微生物的毒性及下游分离纯化的高成本限制了其高效生产。目前，利用工程化大肠杆菌已实现64.5 g/L的最高粘康酸产量，而酿酒酵母凭借其鲁棒性和低pH耐受性成为有吸引力的替代宿主，但产物抑制效应严重制约了产量提升。已有报道在pH 6.0的补料分批发酵中利用酿酒酵母获得22.5 g/L粘康酸，但后续产物沉淀处理需要消耗大量酸碱并产生显著盐废。在降低pH条件下操作，并在发酵过程中将粘康酸萃取至有机相——即原位产物回收策略——有望成为解决上述问题的有效途径。
研究方法
2.1 化学试剂
CYTOP 503购自Solvay公司（比利时布鲁塞尔）。三己基十四烷基氯化膦（CYPHOS IL-101，纯度>95%）和三己基十四烷基双(2,4,4-三甲基戊基)次膦酸膦（CYPHOS IL-104，纯度>90%）购自IoLiTec公司（德国海尔布隆）。菜籽油和葵花籽油购自Vandemoortele公司（比利时根特）。葵花籽脂肪酸甲酯（Sunflower FAME）购自Mosselmann公司（比利时格林）。三辛胺（TOA）和磷酸三丁酯（TBP）购自Sigma-Aldrich公司（美国圣路易斯）。其他化学试剂购自VWR公司（美国宾夕法尼亚州拉德诺）、Thermo Fisher Scientific公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）或Merck公司（德国达姆施塔特），纯度至少为分析纯。
【数据】CYTOP 503来源：Solvay；CYPHOS IL-101纯度：>95%；CYPHOS IL-104纯度：>90%；其他试剂纯度：分析纯及以上
2.2 酵母菌株与培养条件
两株基因改造酵母菌株由KUL-VIB研究所（比利时鲁汶）提供。平台菌株酿酒酵母MDS130具有增强的抑制剂耐受性和木糖利用能力，用于生物相容性测试。酿酒酵母TN22经进一步工程改造用于粘康酸生产（详见参考文献[10]），用于发酵开发。培养在复合培养基中进行，含10 g/L酵母提取物（Kerry Ingredients & Flavours Ltd，荷兰蒂尔堡）和20 g/L细菌学蛋白胨（Thermo Fisher Scientific）。碳源方面，酿酒酵母MDS130添加20 g/L葡萄糖（Brenntag，德国埃森），酿酒酵母TN22添加40 g/L甘油（Brenntag，德国埃森）和20 g/L乙醇（VWR）。
【数据】酵母提取物：10 g/L；细菌学蛋白胨：20 g/L；MDS130碳源：20 g/L葡萄糖；TN22碳源：40 g/L甘油+20 g/L乙醇
2.3 生物相容性测试
生物相容性通过将酿酒酵母MDS130在24孔方孔深孔板（Enzyscreen，荷兰海姆斯泰德）中、于20%（v/v）溶剂或溶剂混合物存在下培养来评估，方法参照De Brabander等人[15]的描述。每轮实验均设置不含溶剂的正对照和未接种的负对照。生物相容性以相对葡萄糖消耗量（相较于正对照的百分比）表示。
【数据】溶剂添加量：20%（v/v）；培养板：24孔方孔深孔板；评估指标：相对葡萄糖消耗量
2.4 发酵实验
发酵实验的种子培养在含20%复合培养基的500 mL挡板摇瓶中进行，接种1 mL来自−80°C冷冻保存的含30%甘油储备液的酵母培养物，在200 rpm（轨道直径5.1 cm）、30°C条件下（Innova S44i，Eppendorf，德国汉堡）培养至OD600≥5。
摇瓶水平发酵中，500 mL挡板摇瓶含20%复合培养基，以5%（v/v）比例接种种子培养物。pH用50 mM柠檬酸缓冲液维持在pH 5.5。培养67 h±1 h后，按20%（v/v）比例添加溶剂混合物。定期取样分析（见2.5节）。
补料分批发酵使用10 L玻璃台式生物反应器（Sartorius，Biostat® B plus，德国哥廷根），初始工作体积4 L。在此实验中，第二个种子步骤在1000 mL挡板摇瓶中进行，其余条件一致，以5%（v/v）比例接种种子培养物，培养28 h后接种主发酵罐。过程参数持续监测和控制，确保紧密跟踪并最小化变异性。温度控制在30°C，溶解氧（DO）通过搅拌速度（200–1100 rpm）和空气流量（0.1–0.8 vvm）的自动控制维持在30%。起始pH设为5.5，在48 h内由产生的粘康酸和添加2 M H₂SO₄降至4.0，此后用24.5% NH₄OH控制pH。当粘康酸达到抑制浓度时，向发酵罐中添加20%（v/v）的溶剂混合物（12.5% CYTOP 503溶于菜籽油）。在线参数使用Eve Bioprocess Software（Infors HT，瑞士博廷根）控制，定期收集和分析样品（见2.5节）。必要时，补充200 g/L浓缩甘油溶液或无水乙醇以避免碳源耗尽。发酵试验作为单次实验进行。
【数据】种子培养条件：200 rpm、30°C、OD600≥5；接种量：5%（v/v）；摇瓶pH缓冲：50 mM柠檬酸缓冲液、pH 5.5；溶剂添加时间：67 h±1 h；溶剂比例：20%（v/v）；10 L反应器：初始体积4 L、温度30°C、DO 30%、搅拌200–1100 rpm、通气0.1–0.8 vvm、起始pH 5.5、48 h内降至4.0、pH控制用24.5% NH₄OH；补料：200 g/L甘油或无水乙醇
2.5 分配系数测定
溶剂对粘康酸萃取能力的筛选基于先前对有机酸萃取的研究[15]。分配系数Kd由以下方程定义：
Kd = c_org/c_aq
其中c_org和c_aq分别为粘康酸在有机相和水相中的浓度。为计算c_org，测定萃取前后水相中粘康酸的浓度，并考虑溶剂的体积比（20% v/v）。在溶剂筛选过程中，向培养基中掺入已知浓度的粘康酸，pH调至4.25±0.05。随后将4 mL培养基与1 mL溶剂（20% v/v）在5 mL Eppendorf管中混合。在Eppendorf ThermoMixer中振荡30 min（900 rpm，30°C）后，离心（14,000 rpm，3 min）并分析水相（见2.5节）。在发酵试验中，在溶剂添加前和添加后恰好30 min取样分析，确定相应的Kd值，由此计算发酵剩余时间内有机相中的粘康酸量。
【数据】Kd定义：Kd=c_org/c_aq；筛选pH：4.25±0.05；培养基/溶剂比：4 mL/1 mL（20% v/v）；振荡：30 min、900 rpm、30°C；离心：14,000 rpm、3 min
2.6 分析方法
生物相容性测试中的葡萄糖浓度使用配备DIONEX ICS-600系统的HPAEC-PAD分析，方法参照De Brabander等人2021年的研究[15]。发酵试验中葡萄糖、乙醇和粘康酸浓度使用Agilent 1260 Infinity HPLC分析，配备Metacarb 67 H色谱柱（300×6.5 mm，连接varia 5244GC预柱）。流动相为2.5 mM H₂SO₄，流速0.8 mL/min，柱温40°C。葡萄糖和乙醇由示差折光检测器（RID）检测，粘康酸由二极管阵列检测器（DAD）在260 nm波长下检测。HPLC结果使用Chemstation软件（版本C.01.05）或Agilent OpenLab CDS（版本2.5）处理。光密度（OD）用分光光度计（Agilent Cary 60，美国加州圣克拉拉）在600 nm波长下测定。为最大程度减少溶剂对OD测量的干扰，发酵样品先离心（5 min，14,000 rpm），然后将细胞重悬于生理盐水（9 g/L NaCl）中再进行测定。
【数据】HPLC流动相：2.5 mM H₂SO₄；流速：0.8 mL/min；柱温：40°C；MA检测波长：260 nm（DAD）；OD测定波长：600 nm；样品预处理：离心5 min、14,000 rpm，重悬于9 g/L NaCl
研究结果
3.1 反应萃取剂评估
本研究对反应萃取剂进行了定向筛选，包括三种离子液体（CYPHOS IL-101、CYPHOS IL-104和Aliquat 336）、两种含磷化合物（磷酸三丁酯（TBP）和CYTOP 503）以及一种胺类化合物（三辛胺（TOA）），这些萃取剂基于先前对类似有机酸反应萃取的研究[14,15]而选定。测试的萃取剂均显示出较高的粘康酸萃取能力，Kd值范围从TOA的3.4到CYPHOS IL-101的510（表1）。所有使用的化合物均为反应萃取剂，很可能与粘康酸形成键合。这导致萃取剂与粘康酸形成复合物，相比单独的粘康酸分子更容易被萃取到有机相中，从而增强萃取过程[5,16]。
然而，对于集成ISPR的有效发酵而言，萃取剂对微生物的生物相容性至关重要。测试的离子液体及TOA已被描述为不可生物相容，表现为可忽略的葡萄糖消耗[15]。而测试的含磷化合物显示出较高的生物相容性，其中CYTOP 503被确认为有前景的萃取剂，生物相容性为55.9%，Kd值为37.9（表1）。
为进一步提高生物相容性，将最有前景的萃取剂与无毒稀释剂混合。在此，选择菜籽油和葵花籽脂肪酸甲酯（FAME）作为可持续、无危险且经济的稀释剂[17–19]。将它们与CYTOP 503或CYPHOS IL-101作为反应萃取剂以不同比例混合测试，旨在通过平衡生物相容性和萃取潜力实现优化萃取。含离子液体CYPHOS IL-101的混合物被发现不适用于酿酒酵母的原位应用（葡萄糖消耗<5%），而CYTOP 503在菜籽油或葵花籽FAME中浓度不超过12.5%（v/v）时完全生物相容（葡萄糖消耗>98%）（表2）。
然而，Kd值随混合物中CYTOP 503浓度的降低而显著下降。例如，25% CYTOP 503/菜籽油对粘康酸的Kd值为8.70，而当混合物中CYTOP 503浓度降至1%时，Kd值降至0.26（表2）。因此，含有12.5%或5% CYTOP 503的菜籽油或葵花籽FAME混合物被选用于发酵研究，因为它们同时表现出高生物相容性和良好的萃取性能，Kd值范围为1.4至5.1。
【数据】Kd范围：3.4（TOA）–510（CYPHOS IL-101）；CYTOP 503生物相容性：55.9%、Kd=37.9；CYPHOS IL-101混合物葡萄糖消耗：<5%；CYTOP 503≤12.5%（v/v）时葡萄糖消耗：>98%；25% CYTOP 503/菜籽油Kd=8.70；1% CYTOP 503/菜籽油Kd=0.26；选定混合物Kd范围：1.4–5.1
3.2 摇瓶水平集成萃取发酵的开发
选定的含CYTOP 503作为反应萃取剂的溶剂混合物在摇瓶水平发酵中进行了评估。使用经工程改造的粘康酸生产菌株酿酒酵母TN22，以甘油为底物，研究了溶剂混合物对生长和粘康酸生产的影响（图1）。发酵约67 h后，所有试验均观察到生长停滞，最可能的原因是粘康酸浓度达到1.6–2.1 g/L时产生的抑制效应（图1B），这与先前报道的粘康酸毒性水平数据[10]一致。
此后，向摇瓶中添加不同的溶剂混合物，所有ISPR摇瓶均重新恢复了生长（图1A）。在含12.5% CYTOP 503/菜籽油的摇瓶中，最终生物量浓度（OD600）相比对照摇瓶提高了44%，而粘康酸产量提高了18%，达到2.75 g/L的粘康酸滴度和0.019 g/L/h的生产率（图1A、C）。
出乎意料的是，在葵花籽FAME中使用相同量的CYTOP 503似乎并未改善粘康酸生产，生长仅比对照增加了28%（图1A）。尽管添加这两种混合物均显示出相似的粘康酸萃取效果，水相中粘康酸浓度相当，约为1.0 g/L（图1D），但使用葵花籽FAME作为稀释剂时，与菜籽油不同，未观察到进一步的粘康酸生产（图1C）。
这证明了向发酵过程中添加溶剂相时存在复杂的相互作用。确实，虽然从发酵液中萃取粘康酸可以减轻产物抑制，但萃取剂也可能表现出毒性效应。在此，与葵花籽FAME相比，菜籽油在保护酵母细胞免受CYTOP 503毒性方面似乎更有效。油类在溶剂存在下的这种保护能力在大豆油中也有观察到，进一步凸显了稀释剂选择的重要性[20]。
因此，选择12.5% CYTOP 503/菜籽油作为反应溶剂混合物，用于进一步评估该技术的潜力，因为它既能充分萃取粘康酸以减轻产物抑制，同时又能降低反应萃取剂的毒性。
【数据】生长停滞时间：约67 h；抑制浓度：1.6–2.1 g/L；12.5% CYTOP 503/菜籽油：生物量提高44%、MA产量提高18%、滴度2.75 g/L、生产率0.019 g/L/h；葵花籽FAME组生长提高28%；水相MA浓度：约1.0 g/L
3.3 10 L生物反应器中ISPR发酵的评估
开发的ISPR工艺在10 L生物反应器中以补料分批发酵模式进行了研究，过程参数连续控制。发酵48 h后，由于粘康酸达到1.39 g/L的抑制浓度，生长和生产停滞（图2），此时向生物反应器中添加溶剂混合物（12.5% CYTOP 503/菜籽油）。
随后，49.5%的粘康酸被萃取到有机相中，这与摇瓶试验相当。此后，生长、甘油消耗和粘康酸生产迅速增加，证明了所开发的ISPR策略在克服产物抑制方面的有效性。发酵76 h后，水相中的粘康酸浓度再次达到抑制浓度（图2A），限制了生产率和生长。
最终总滴度在147 h时达到4.33 g/L粘康酸，最终pH为4.0，有机相中粘康酸浓度高达11.5 g/L。平均生产率为0.029 g/L/h，最大生产率达0.053 g/L/h。
本研究首次在生物反应器规模开发和评估了ISPR补料分批发酵，证明了其在抵消产物抑制和提升目前受产物抑制限制的挑战性发酵过程性能方面的潜力。此外，该研究为粘康酸作为重要平台化学品的可持续生产奠定了基础，可在未来研究中进一步发展。虽然本次中试规模试验未进行进一步萃取，旨在验证该技术在10 L规模的有效性，但使用配备连续分离装置的专业工业发酵设备可以实现进一步的过程强化。在此，由于时间-空间产率提高以及产物富集在有机相中可能降低下游处理复杂度，工艺的成本效益也可以提高。然而，溶剂回收和再利用至关重要，需在后续研究中进一步开发，该技术的进一步放大也将支持具有代表性的技术经济可行性研究。
【数据】抑制浓度：1.39 g/L；萃取率：49.5%；最终总滴度：4.33 g/L；最终pH：4.0；有机相MA浓度：11.5 g/L；平均生产率：0.029 g/L/h；最大生产率：0.053 g/L/h；发酵总时长：147 h
讨论与解读
本研究系统性地建立了基于反应萃取的粘康酸原位产物回收发酵策略。核心发现包括：CYTOP 503在含磷萃取剂中兼具相对较高的萃取能力（Kd=37.9）和生物相容性（55.9%）；以菜籽油为稀释剂时，12.5% CYTOP 503可实现完全生物相容（>98%葡萄糖消耗）且保持可用萃取性能（Kd=1.4–5.1）；在10 L反应器中验证了该策略可有效解除产物抑制，使发酵在产物浓度达到抑制阈值后仍能恢复生产和生长。
值得注意的是，稀释剂的选择对过程成败至关重要——同为12.5% CYTOP 503，菜籽油和葵花籽FAME在萃取能力上几乎无差异，但在支持细胞恢复生长和持续生产方面却截然不同。这一现象提示，有机相的保护效应可能不仅限于简单的萃取去毒，还涉及油类对细胞膜或萃取剂毒性的缓冲机制。有机相中粘康酸浓度高达11.5 g/L，为下游萃取分离提供了有利条件。
编译者解读：该研究展示了过程工程与菌株工程协同优化的价值——在菌株耐受性有限的情况下，通过ISPR策略在不改变菌株的前提下显著提升过程性能。选择食品级菜籽油作为稀释剂兼顾了可持续性与经济性，但Kd值偏低意味着需要较大有机相体积，溶剂回收效率将直接影响工艺的经济可行性。未来若能与连续萃取装置结合，并开发更高效的再生循环方案，该策略向工业规模转化具有现实路径。另外，摇瓶与10 L反应器间产物抑制浓度阈值（1.6–2.1 vs 1.39 g/L）的差异也提示，规模放大时需重新评估关键过程参数。
参考来源
Tönjes S. In situ product recovery as a powerful tool to improve the fermentative production of muconic acid in Saccharomyces cerevisiae. Biochemical Engineering Journal, 2023. DOI: 10.1016/j.bej.2022.108746
DOI: 10.1016/j.bej.2022.108746