来源：Metabolic engineering of Escherichia coli for upcycling of polyethylene terephthalate waste to vanillin（Science of The Total Environment）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
PET塑料废弃物因难以自然降解而成为严峻的环境问题。本研究通过在大肠杆菌中构建多酶级联系统，将PET降解单体对苯二甲酸（TPA）转化为高价值化学品香兰素（VAN）。通过敲除内源醛还原酶和醇脱氢酶抑制VAN降解、修饰膜蛋白增强TPA摄取等代谢工程策略，工程菌从1992 mg/L TPA中产出658.55 mg/L VAN，摩尔转化率达71.1%，为目前以TPA为底物生产VAN的最高报道水平。该研究为PET废弃物升级再利用提供了绿色生物转化路径。
研究背景
PET塑料凭借轻质、耐用和成本低廉等优势被广泛应用，但其固有的抗降解性导致不当处置后引发严重环境问题。一次性使用后丢弃PET造成其总价值95%的损失，全球每年经济损失约1100亿美元。传统回收策略中，物理回收所得再生PET质量较低且成本较高，往往降级用于低价值应用；热化学回收（如热解、气化）虽可在高温下将PET转化为化学品，但能耗大且产生温室气体排放；化学回收中的溶剂解聚方法（如乙二醇解、水解）虽能有效将PET分解为单体，但常涉及有毒物质，难以规模化应用。因此，开发温和条件下将PET废弃物转化为高价值化学品的生物催化路线，具有重要的环境与经济意义。
研究方法
2.1 材料与试剂
标准品VAN、香草酸（VA）、原儿茶酸（PCA）、原儿茶醛（PCL）和香草醇（VAL）购自上海源叶生物科技有限公司。TPA购自Sigma-Aldrich（上海）。其他试剂购自国药集团（北京）。PET瓶取自饮用水瓶（娃哈哈，杭州），经低温旋转切割机切割后，由配备匀浆器的挤出机进行预处理。预处理后的PET在液氮中微粉化，获得粒径小于500 μm的PET粉末。角质酶4Mz溶液（3 g/L）按照先前描述的方法制备，来源于江南大学酶技术与生物过程工程实验室。
2.2 菌株、质粒与基因
本研究所用菌株和质粒保存于江南大学酶技术与生物过程工程实验室。大肠杆菌JM109用于质粒构建，大肠杆菌BL21(DE3)作为全细胞催化剂生产VAN。质粒pET-21a(+)（AmpR）、pRSFDuet-1（KanR）和pCDFDuet-1（SpeR）用于克隆和亚克隆。pTargetF（Addgene，#62226）和pCas（Addgene，#62225）由杭州BioSci提供，用于CRISPR-Cas9介导的基因组编辑。金唯智生物科技（苏州）商业合成并进行了密码子优化的基因包括：来源于丛毛单胞菌属（Comamonas sp.）的tphA1、tphA2、tphB2和DCDDH，来源于Rhodococcus jostii RHA1的TpaAa、TpaAb、TpaB和TpaC，来源于Ideonella sakaiensis的ISF6-0227、ISF6-0228、ISF6-0229和ISF6-0230，来源于Nocardia iowensis的CAR（NiCAR），以及来源于褐家鼠（Rattus norvegicus）的COMT（S-COMT）。
2.3 分子操作
本研究所用引物列于表S2，由金唯智生物科技（苏州）设计合成。过表达质粒通过同源重组PCR构建，并按照先前描述的方法转化至大肠杆菌BL21中，获得工程菌株Y1-C.as、Y1-I.sa、Y1-R.ha、YB、YC、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8-L、Y8-N、Y8-M、Y8-T和Y9。基因敲除采用CRISPR/Cas9技术进行。为敲除大肠杆菌基因组中的braun脂蛋白基因（lpp），以基因组DNA为模板，使用引物lpp-up-F/R和lpp-down-F/R分别扩增lpp基因的上、下游片段，再用引物lpp-up-F和lpp-down-R进行重叠PCR，生成完整的lpp敲除片段。将含有lpp特异性互补N20序列的pTargetF质粒与lpp敲除片段一同电转化至含有pCas质粒的大肠杆菌BL21感受态细胞中。敲除成功的阳性克隆在30°C培养16 h以去除pTargetF质粒，随后在42°C培养12 h以消除pCas质粒，最终获得lpp基因缺失的大肠杆菌Δlpp。所有构建菌株、过表达质粒和敲除质粒的详细信息见表S1。
2.4 全细胞生物催化剂的制备与VAN转化
含有过表达质粒的工程菌株大肠杆菌BL21接种于10 mL含相应抗生素的LB培养基中，37°C振荡培养8 h。随后按5% v/v接种量转接至含相应抗生素的新鲜LB培养基中，37°C、200 rpm培养至OD600 = 0.6–0.8，加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM。30°C、200 rpm诱导培养24 h后，4000 rpm、4°C离心20 min收集菌体，用100 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5）洗涤。菌体作为全细胞生物催化剂，重悬于转化缓冲液中至OD600为80。取500 μL重悬菌液加入含底物TPA的50 mL Falcon™管中。转化反应在30°C、200 rpm条件下进行26 h。采用高效液相色谱（HPLC）验证VAN及中间产物的产生。转化缓冲液每升含：20 g甘油、6.7 g KH₂PO₄、4 g (NH₄)₂HPO₄、0.8 g MgSO₄·7H₂O、0.8 g柠檬酸、1.49 g L-蛋氨酸、10 mg硫胺素-HCl和5 mL浓缩痕量金属溶液。浓缩痕量金属溶液含FeSO₄（5.46 g/L）、CaCl₂（1.51 g/L）、ZnSO₄（1.23 g/L）、MnSO₄（0.34 g/L）、CuSO₄（0.64 g/L）、(NH₄)₆Mo₇O₂₄（0.09 g/L）和Na₂B₄O₇（0.01 g/L）。
2.5 PET废弃物向VAN的升级转化
PET水解液由角质酶4Mz降解PET制备，方法参照先前文献并作修改。PET水解液经多层纱布过滤去除不溶性物质（如残余PET和蛋白质聚集体），HPLC分析显示其含86.5 g/L TPA和64.5 g/L乙二醇（EG）。将PET水解液用转化缓冲液稀释至不同倍数（1×、5×、10×、20×、40×），并用100 mM HCl调节pH至7.0。工程菌株大肠杆菌BL21菌体重悬于各PET水解液中至OD600为80。转化反应条件与TPA转化相同。采用HPLC验证VAN及中间产物的产生。
2.6 分析方法
#### 2.6.1 HPLC分析
取250 μL转化液，加入750 μL甲醇混匀，涡旋后在4°C静置30 min，1300 rpm、4°C离心5 min，经0.22 μm针头式过滤器过滤。使用配备Athena C18-WP色谱柱（100 Å，4.6×250 mm，5 μm）的Agilent 1200 HPLC测定转化液中的产物（VAN、VA、PCL、TPA和VAL）。柱温维持在30°C，进样量5 μL。检测波长为230 nm，以1.5%（v/v）乙酸水溶液和35%甲醇为流动相等度洗脱，流速0.7 mL/min。根据保留时间鉴定产物，并通过峰面积与定量标准品对比进行定量。所有样品均来自三次独立实验。
#### 2.6.2 液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析
2.6.1节获得的转化液进一步采用LC-MS定量。LC-MS系统由配备2996 PDA检测器的Waters Acquity超高效液相色谱（UPLC）和配备BEH C18色谱柱（2.1×150 mm，1.7 μm）的Waters MALDI SYNAPT Q-TOF MS组成，柱温45°C。样品以0.1%（w/v）甲酸水溶液和100%乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速0.3 mL/min。MS分析采用ESI（电喷雾电离）正离子模式。离子源温度100°C，脱溶剂气温度400°C。氮气作为脱溶剂气（700 L/h）和锥孔气（50 L/h）。锥孔电压10 V，毛细管电压3 kV。样品在质荷比（m/z）800–1200范围内分析。
2.7 统计分析
所有数据表示为三次平行实验的平均值±标准差。统计分析使用Origin 9.1软件（OriginLab Corporation，Northampton，Massachusetts，USA）进行。
【数据】菌株：E. coli JM109（质粒构建）、E. coli BL21(DE3)（全细胞催化）；培养基：LB；诱导剂：IPTG 0.5 mM；培养条件：37°C/200 rpm至OD600=0.6–0.8，30°C/200 rpm诱导24 h；离心：4000 rpm/4°C/20 min；洗涤缓冲液：100 mM磷酸钠缓冲液pH 6.5；转化条件：30°C/200 rpm/26 h；菌体浓度：OD600=80；转化液体积：500 μL；转化缓冲液组分：20 g/L甘油、6.7 g/L KH₂PO₄、4 g/L (NH₄)₂HPO₄、0.8 g/L MgSO₄·7H₂O、0.8 g/L柠檬酸、1.49 g/L L-蛋氨酸、10 mg/L硫胺素-HCl、5 mL/L浓缩痕量金属溶液；PET水解液：86.5 g/L TPA、64.5 g/L EG；稀释倍数：1×、5×、10×、20×、40×；pH 7.0；HPLC条件：Athena C18-WP柱（100 Å，4.6×250 mm，5 μm）、柱温30°C、进样5 μL、检测波长230 nm、流动相1.5%乙酸/35%甲醇、流速0.7 mL/min；LC-MS条件：BEH C18柱（2.1×150 mm，1.7 μm）、柱温45°C、流速0.3 mL/min、ESI正离子模式、源温100°C、脱溶剂气温度400°C、脱溶剂气700 L/h、锥孔气50 L/h、锥孔电压10 V、毛细管电压3 kV、m/z 800–1200
研究结果
3.1 大肠杆菌TPA到VAN转化模块的设计与验证
基于图2a，在大肠杆菌中建立了三个转化模块（I、II和III），以验证将PET降解单体TPA转化为VAN的可行性。PCA是TPA到VAN整体转化途径中的关键中间体。TPA到PCA的转化已在丛毛单胞菌属E6、Ideonella sakaiensis 201-F6和Rhodococcus jostii RHA1中成功发现。TPA由TPADO转化为1,2-二羟基-3,5-环己二烯-1,4-二甲酸（DCD），随后由DCDDH转化为PCA。分别选取来源于丛毛单胞菌属、I. sakaiensis和R. jostii的TPADO和DCDDH在大肠杆菌中过表达（菌株Y1-C.as、Y1-I.sa和Y1-R.ha），构成转化模块I（图2b）。
在996 mg/L TPA存在下孵育26 h后，菌株Y1-C.as和Y1-I.sa中成功检测到PCA（图2c）。其中，菌株Y1-C.as在第26小时PCA产量最高，摩尔转化率达87.69%（mol/mol）（图S1），与先前结果相当。然而，菌株Y1-R.ha中未检测到PCA，可能由于来源于R. jostii的TPADO和DCDDH基因在大肠杆菌中异源表达存在困难（图S2）。模块II设计用于将PCA转化为PCL。来源于N. iowensis的NiCAR已被证明能将PCA转化为PCL，而来源于枯草芽孢杆菌的Sfp是NiCAR翻译后修饰所必需的。因此，构建了过表达NiCAR和Sfp的大肠杆菌菌株YB，验证了其将PCA转化为PCL的能力（图2d）。来源于褐家鼠的COMT突变体（S-COMT）对PCL间位甲基化具有高度立体选择性，催化其转化为VAN。过表达S-COMT的大肠杆菌菌株YC作为模块III，成功以PCL为底物生成VAN（图2e）。
【数据】TPA浓度：996 mg/L；孵育时间：26 h；菌株Y1-C.as的PCA摩尔转化率：87.69%（mol/mol）；模块II：NiCAR+Sfp（YB菌株）；模块III：S-COMT（YC菌株）
3.2 三菌株微生物系统生产VAN
由菌株Y1-C.as、YB和YC组成的三菌株微生物系统用于TPA到VAN的一锅法转化（图3a）。Y1-C.as、YB和YC的不同体积比对VAN产量有显著影响。当Y1-C.as、YB和YC的体积比为2∶1∶2时，VAN产量最高，达5.37 mg/L。
孵育过程中检测到大量副产物VAL，浓度范围为140.89 mg/L至404.55 mg/L，是VAN产量的28–80倍（图3b）。这归因于大肠杆菌内源AKRs和ADHs对VAN的降解作用。PCA和PCL作为中间产物，在TPA到VAN的转化过程中也被检测到（图3c）。有趣的是，VA仅在Y1-C.as、YB和YC体积比为1∶1∶3时被特异检测到。先前研究表明，S-COMT可将PCA转化为VA，而NiCAR能将VA转化为VAN。因此，鉴定出两条TPA到VAN的转化途径：1）菌株Y1-C.as将TPA转化为PCA，菌株YB将PCA转化为PCL，菌株YC将PCL转化为VAN；2）菌株Y1-C.as将TPA转化为PCA，菌株YC将PCA转化为VA，菌株YB将VA转化为VAN（图3d和e）。值得注意的是，其他系统中未观察到VA积累，表明S-COMT对PCL的特异性高于PCA。PCA产量高于PCL，表明菌株Y1-C.as的转化能力最强，其次是菌株YB和YC。由于PCL大量积累，S-COMT被确定为VAN转化中的主要限速步骤，这与先前研究结果一致。此外，Y1-C.as、YB和YC体积比为3:1:1时TPA消耗量最大（从996 mg/L降至34.5 mg/L），但仅检测到微量VAN和147.1 mg/L VAL（图3f）。该体积比下的菌株可能导致代谢失衡：1）菌株Y1-C.as产生的TPA可能无法有效传递至菌株YB和YC——这些中间体的主要消费者对VAN转化的后续步骤至关重要；2）负责将VAN转化为VAL的酶相对于参与TPA上游生产VAN的酶过表达或活性更高。
【数据】三菌株系统最佳体积比（Y1-C.as:YB:YC）：2∶1∶2；VAN最高产量：5.37 mg/L；VAL范围：140.89–404.55 mg/L（VAN产量的28–80倍）；TPA最大消耗：996 mg/L降至34.5 mg/L（体积比3:1:1）；VAL产量：147.1 mg/L（体积比3:1:1）
3.3 双菌株微生物系统生产VAN
将含有NiCAR和S-COMT基因的质粒pG2与质粒p-Sfp共转化至大肠杆菌，获得菌株Y2（图4a）。由菌株Y1-C.as和Y2组成的双菌株微生物系统用于研究其对VAN生产的影响。如图4b所示，随着菌株Y1-C.as体积比增加，VAN产量先升高后降低。当Y1-C.as和Y2体积比为1∶1时，VAN产量最高，达42.2 mg/L。
起初，增加菌株Y1-C.as的比例可增强VAN生产的整体代谢能力，因为其在将前体转化为VAN中起主要作用。然而，超过一定阈值后，菌株Y1-C.as的优势可能破坏VAN最优转化所需的微生物平衡，可能与菌株Y2产生资源竞争。有趣的是，Y1-C.as和Y2体积比为4∶1时TPA被完全消耗，但该体积比导致VAN和中间产物产量最低（图4c和d）。这可能是由于菌株Y1-C.as和Y2之间的代谢竞争，大部分TPA在菌株Y1-C.as中被代谢为PCA后分流至其自身的非生产性代谢途径，而非将PCA传递给菌株Y2。
【数据】双菌株系统最佳体积比（Y1-C.as:Y2）：1∶1；VAN最高产量：42.2 mg/L；体积比4∶1时TPA完全消耗但VAN和中间产物产量最低
3.4 单菌株微生物系统生产VAN
含有质粒pG1、pG2和p-Sfp的大肠杆菌（菌株Y3）作为单菌株微生物系统，无需细胞间中间体跨膜转运即可将TPA转化为VAN（图5a）。
菌株Y3在996 mg/L TPA中孵育26 h后，VAN产量为35.3 mg/L。该产量低于双菌株系统（42.2 mg/L），但高于三菌株系统（5.3 mg/L）。此外，观察到显著的VAL积累，三菌株系统中产量最高（404.55 mg/L），其次是单菌株系统（335.17 mg/L）和双菌株系统（293.94 mg/L）。在单菌株系统中，携带多个质粒的大肠杆菌执行多种酶促转化，可能导致竞争性抑制和整体效率降低。然而，由于不存在中间体传递（不同微生物间扩散可能引入低效性），其效率高于三菌株系统。双菌株系统中菌株Y1-C.as和Y2之间的代谢任务分工可减轻各菌株的代谢负担，实现更高效的底物利用和产物生成。这种设计最大程度减少了单菌株系统中代谢负荷的负面影响，同时避免了三菌株系统的复杂性和低效性。在三菌株系统中，每个菌株承担VAN转化途径的一部分（图S3）。虽然这种分工可提高局部系统效率，但空间分离和不同代谢速率可能导致中间体和副产物积累，无法有效转化为VAN，从而降低整体产量。
【数据】单菌株系统VAN产量：35.3 mg/L（996 mg/L TPA，26 h）；双菌株系统VAN产量：42.2 mg/L；三菌株系统VAN产量：5.3 mg/L；VAL最高产量：三菌株系统404.55 mg/L、单菌株系统335.17 mg/L、双菌株系统293.94 mg/L
3.5 膜蛋白缺失对菌株Y7合成VAN的影响
为提高细胞通透性以增强TPA摄取，对菌株Y7进行了膜蛋白缺失改造。菌株Y8-L为lpp基因缺失的Y7菌株。膜蛋白缺失对VAN合成的影响如图6所示。通过增加细胞膜通透性，促进了底物TPA进入细胞及产物VAN的释放，从而提高了VAN产量。
【数据】膜蛋白缺失策略：敲除lpp基因（菌株Y8-L）；原文未详述具体VAN产量数值
3.6 利用菌株Y9将PET瓶转化为VAN
将工程菌株Y9应用于实际PET瓶水解液的VAN转化。PET水解液经不同倍数稀释后作为转化底物。工程菌株在温和条件下成功将消费后PET废弃物转化为VAN，在20×稀释的PET水解液中VAN产量最高，达259.2 mg/L。该结果验证了工程菌在实际PET废弃物升级再利用中的应用潜力。
【数据】PET水解液TPA浓度：86.5 g/L；EG浓度：64.5 g/L；最佳稀释倍数：20×；VAN最高产量：259.2 mg/L（20×稀释PET水解液）
3.7 工程菌株的VAN产量优化
通过组合代谢工程策略——包括敲除内源醛还原酶和醇脱氢酶以抑制VAN降解、修饰膜蛋白以增强TPA摄取——最终获得的工程大肠杆菌从1992 mg/L TPA中产出658.55 mg/L VAN，摩尔转化率达71.1%。这是目前以TPA为底物生产VAN的最高报道水平。
【数据】TPA浓度：1992 mg/L；VAN产量：658.55 mg/L；摩尔转化率：71.1%
讨论与解读
本研究通过系统的代谢工程策略，成功实现了大肠杆菌将PET废弃物转化为高价值化学品VAN。三种微生物系统（单菌株、双菌株、三菌株）的比较揭示了一个核心问题：代谢任务的空间分配需要在"减轻代谢负担"与"避免中间体传递损耗"之间寻找平衡。双菌株系统以42.2 mg/L的产量优于单菌株（35.3 mg/L）和三菌株系统（5.37 mg/L），表明适度的分工可提高效率，而过度的分割反而因中间体跨细胞传递而损失整体产能。VAN降解是另一关键瓶颈——所有系统中VAL的大量积累（最高达VAN产量的80倍）说明内源氧化还原酶对产物的攻击不容忽视。通过基因敲除抑制VAN降解、膜蛋白缺失增强底物摄取后，最终产量提升至658.55 mg/L，摩尔转化率71.1%，并在实际PET水解液中实现了259.2 mg/L的VAN生产。
编译者解读：本研究展示了合成生物学在塑料废弃物高值化领域的典型应用范式——以模式微生物为底盘，通过多模块级联设计和系统代谢工程优化，将低价值废弃物转化为高附加值产品。其方法学亮点在于系统性地比较了单菌株、双菌株和三菌株三种组织架构，为多酶级联反应的菌株配置提供了实验依据。然而，658.55 mg/L的产量距离工业化仍有距离，且PET水解液的复杂成分对菌株稳健性构成挑战。未来若能在酶工程（如提高S-COMT催化效率）和发酵工艺（如补料分批策略）层面持续优化，该技术有望成为PET化学回收的绿色替代方案。
参考来源
期刊：Science of The Total Environment, 2024
DOI: 10.1016/j.scitotenv.2024.177544
DOI: 10.1016/j.scitotenv.2024.177544