来源：Corynebacterium glutamicum cell factory design for the efficient production of cis, cis-muconic acid（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
顺,顺-粘康酸（MA）是合成己二酸、对苯二甲酸等重要化学品的关键平台化合物。本研究通过系统代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌，结合计算设计工具OptHandle预测代谢优化靶点，重构莽草酸途径并整合关键基因，最终在5 L生物反应器中获得88.2 g/L MA，为目前以葡萄糖为碳源报道的最高产量。研究还通过适应性实验室进化使菌株能够在玉米秸秆水解液中高效生产MA，为绿色可持续生产提供了新路径。
研究背景
MA是一种含有两个不饱和双键的六碳二元羧酸，是工业合成己二酸、对苯二甲酸等化学品的重要平台物质，在功能树脂、药物和农用化学品合成中具有重要应用潜力。随着相关产业需求持续增长，微生物生产MA受到越来越多研究者关注。1994年，Draths和Frost首次报道了通过生物转化方法生产生物基MA。微生物生产MA的优势在于代谢过程通常在温和条件下进行，相对环境友好。目前微生物转化生产MA主要有两条途径：芳香族化合物的生物转化和糖类微生物发酵。不同微生物具有不同的代谢特征，但在产量和效率方面仍有较大提升空间。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用细菌菌株和质粒列于表1。以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032作为代谢工程改造的出发菌株以过量生产MA。大肠杆菌Trans 10用于常规克隆实验，在37°C、200 rpm条件下于Luria-Bertani（LB）培养基（10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物）中培养。谷氨酸棒状杆菌ATCC13032及其突变株在30°C、200 rpm条件下于脑心浸液山梨醇（BHIS）培养基（LB中添加18.5 g/L脑心浸液和91 g/L D-山梨醇）中培养，或在BHIS平板（1.5%，w/v琼脂）上进行常规培养。
摇瓶MA生产实验中，谷氨酸棒状杆菌在发酵培养基中培养，培养基成分为：45 g/L葡萄糖、8 g/L玉米浆、5 g/L尿素、1 g/L KH₂PO₄、1 g/L K₂HPO₄、1.23 g/L MgSO₄·7H₂O、29.4 mg/L CaCl₂·2H₂O、400 μg/L生物素、400 μg/L维生素B₁和2 mL/L微量元素溶液。用NH₃·H₂O调节pH至7.0。微量元素溶液组成为：1 g/L MnSO₄·H₂O、0.1 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.2 g/L CuSO₄、1 g/L FeSO₄·7H₂O和2 mg/L NiCl₂·6H₂O。
【数据】菌株：C. glutamicum ATCC 13032、E. coli Trans 10；培养基：LB（10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物）、BHIS（LB + 18.5 g/L脑心浸液 + 91 g/L D-山梨醇）、发酵培养基（45 g/L葡萄糖、8 g/L玉米浆、5 g/L尿素、1 g/L KH₂PO₄、1 g/L K₂HPO₄、1.23 g/L MgSO₄·7H₂O、29.4 mg/L CaCl₂·2H₂O、400 μg/L生物素、400 μg/L维生素B₁、2 mL/L微量元素溶液）；温度：37°C（E. coli）、30°C（C. glutamicum）；转速：200 rpm；pH：7.0
2.2 质粒与菌株构建
质粒构建和基因组编辑采用Gibson组装和分子克隆技术完成。菌株基因组工程使用pK18mobsacB系统和两步同源重组方法敲除目标基因。所用质粒列于表1。
【数据】质粒系统：pK18mobsacB；方法：Gibson组装、两步同源重组；原文未详述其他参数
2.3 基因操作靶点预测
采用本课题组前期开发的代谢优化算法OptHandle识别过表达、下调或敲除靶点。葡萄糖摄取速率设定为10 mmol/gDCW/h。过量生产菌株的生物量上限设定为生物量通量理论最大值的5%。
【数据】葡萄糖摄取速率：10 mmol/gDCW/h；生物量上限：理论最大值的5%
2.4 玉米秸秆的预处理与酶解
玉米秸秆水解液的制备采用本课题组开发的蒸汽爆破方法。酶解使用Cellic® CTec2（诺维信公司，中国北京）商业酶混合物。纤维素酶添加量为20 FPU/g干重。固含量（w/v）分别设定为10%、20%和30%。水解在5 L生物反应器中进行，工作体积为3 L，温度50°C，转速180 rpm，用KOH调节pH至4.8。当水解液中糖组成不再发生变化时终止酶解。制备的不同浓度水解液用于适应性实验室进化和菌株发酵实验。
【数据】酶：Cellic® CTec2；酶添加量：20 FPU/g干重；固含量：10%、20%、30%；温度：50°C；转速：180 rpm；工作体积：3 L；pH：4.8
2.5 适应性实验室进化与胁迫耐受性测定
在玉米秸秆水解液中分别添加10 g/L和5 g/L的灭菌蛋白胨和酵母提取物作为驯化培养基。工程菌在驯化培养基和BHIS培养基中交替进行适应性进化。驯化过程中每12小时测定细胞OD₆₀₀值。一旦达到稳定期，立即将菌株转移到新鲜培养基中。每次转接的初始接种OD₆₀₀设定为0.5。通过连续传代培养，使突变株适应特定培养环境。指数生长期ln(OD₆₀₀)对时间作图所得线性回归系数作为最大生长速率（μmax）。每隔一定时间，将驯化菌株划线接种到添加1.5%琼脂的固体驯化培养基上。选取数个较大菌落进行生长测试。表现优良的菌株保存并继续驯化。获得的最终菌株分别在添加不同浓度糠醛、苯酚和香草醛的BHIS固体培养基上进行耐受性评估。菌株OD₆₀₀值设定为10⁰、10⁻¹、10⁻²和10⁻³四个梯度进行测试。
【数据】驯化培养基：玉米秸秆水解液 + 10 g/L蛋白胨 + 5 g/L酵母提取物；OD₆₀₀测定间隔：12 h；初始接种OD₆₀₀：0.5；固体培养基琼脂：1.5%；耐受性测试OD₆₀₀梯度：10⁰、10⁻¹、10⁻²、10⁻³；抑制剂：糠醛、苯酚、香草醛
2.6 5 L补料分批发酵
分批发酵在5 L百仑生物反应器中进行，温度控制设定为30°C，通气速率为2 L/min，转速维持在400 rpm。工作体积设定为50%，通过25%（v/v）NH₃·H₂O维持pH为7.0。初始葡萄糖耗尽后，持续补加葡萄糖溶液（800 g/L）以维持葡萄糖浓度在1–20 g/L。发酵过程中不添加玉米浆。如有泡沫产生，添加适量消泡剂（DF-103）控制泡沫。每12小时取样测定OD₆₀₀并分析代谢产物。
【数据】反应器：5 L；温度：30°C；通气速率：2 L/min；转速：400 rpm；工作体积：50%；pH：7.0（25% NH₃·H₂O维持）；补料葡萄糖浓度：800 g/L；维持葡萄糖浓度：1–20 g/L；取样间隔：12 h
2.7 RNA测序与转录组分析
在5 L生物反应器中，原始菌株和工程菌株分别按发酵体积的10%接种。培养12 h后收集细胞，用PBS缓冲液洗涤三次，随后用干冰冷冻。冷冻样品送至上海生工生物工程有限公司。含有工程菌株的生物反应器继续培养至80 h，收集细胞并按相同程序处理后送样。转录组数据使用Illumina HiSeq-4000平台分析，采用RNA-Seq Quantification文库服务。基于KEGG和Gene Ontology公共数据库进行注释分类和富集分析。
【数据】接种量：10%发酵体积；样品采集时间点：12 h、80 h；测序平台：Illumina HiSeq-4000；数据库：KEGG、Gene Ontology
2.8 代谢产物分析
葡萄糖和乙酸使用HPLC（UltiMate 3000 HPLC，Thermo Scientific）配Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）在65°C下以示差检测器测定。MA、PCA和DHS在40°C下用紫外检测器测定，检测波长分别为262 nm、259 nm和236 nm。使用5 mM硫酸作为流动相，流速为0.6 mL/min。抑制剂分析（包括5-HMF、糠醛和香草醛）使用HPLC配Kromasil 100-5-C18色谱柱（4.6 × 250 mm），在40°C下用UV-VIS检测器（Thermo Scientific）检测，以40%甲醇为流动相，流速0.6 mL/min。
【数据】色谱柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H（65°C）、Kromasil 100-5-C18（40°C）；检测波长：MA 262 nm、PCA 259 nm、DHS 236 nm；流动相：5 mM硫酸（0.6 mL/min）、40%甲醇（0.6 mL/min）；分析物：葡萄糖、乙酸、MA、PCA、DHS、5-HMF、糠醛、香草醛
研究结果
3.1 工程化改造谷氨酸棒状杆菌生产MA
为实现谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中MA的生产，我们首先考察了生物体的天然代谢途径（图1）。莽草酸途径始于糖酵解途径的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）与磷酸戊糖途径（PPP）的D-赤藓糖-4-磷酸（E4P）之间的缩合反应，生成3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）。随后DAHP经过三步连续反应转化为原儿茶酸（PCA）。PCA是多种物质的重要中间体和前体。
然而，野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032缺乏将PCA转化为儿茶酚（CA）所需的PCA脱羧酶。因此，引入外源PCA脱羧酶对于进一步将PCA转化为MA是必要的。已有研究证明，来自肺炎克雷伯菌的PCA脱羧酶已在大肠杆菌、酿酒酵母和谷氨酸棒状杆菌中成功表达。因此，选择编码肺炎克雷伯菌PCA脱羧酶的aroY基因用于MA生产。
先前研究记载，PCA脱羧酶与另外两个基因kpdB和kpdD共表达对于获得最佳酶活性是必要的。额外基因的存在作为变构激活因子，显著增强PCA脱羧酶的活性。例如，在恶臭假单胞菌KT2440中同时表达脱羧酶相关蛋白导致PCA积累减少，MA产量显著增加。因此，我们将来自肺炎克雷伯菌和E. coli的kpdB/D分别与aroY整合，构建了两个质粒（命名为PEC-1和PEC-2）用于MA生产，以选择最佳基因组合。
但野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032含有catB基因，编码氯粘康酸环异构酶，可将MA进一步转化为粘康酸内酯。因此，敲除catB是必要的。此外，MA生产代谢途径中还有两条重要的中间代谢物降解途径。其一，aroE编码莽草酸5-脱氢酶，可将3-脱氢莽草酸（DHS）转化为奎宁酸。该基因在谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中有多个拷贝（cg0504、cg1283和cg1835），为菌株生长提供氨基酸来源，无法完全阻断。已有研究证明，敲除cg1835对菌株生长影响最小，且对DHS积累有积极影响。因此，本研究删除了cg1835。另一条途径涉及pcaG/H，编码原儿茶酸双加氧酶，可将PCA转化为3-羧基-顺,顺-粘康酸，从而减少流向MA生产的通量。因此，通过不同组合敲除上述三个基因，以确定MA生产的最佳基因型。
随后，将上述两个质粒（PEC-1和PEC-2）分别导入不同的基因敲除菌株中，评估PCA和MA的积累情况。结果显示，导入菌株GM4（△aroE、△pcaG/H和△catB）的质粒产生了最高的MA产量，达到333.3 mg/L，是初始菌株的10.4倍（图2a和b）。MA产量的显著提高归因于这三个关键降解基因的敲除，为MA积累提供了更高的代谢通量。
尽管MA产量显著增加，但MA滴度仍相对较低。因此，有必要增强关键中间体（DHS、PCA和CA）的合成。然而，从3-DHA转化为MA需要三步反应，而CA已被发现对菌株具有显著毒性。因此，PCA被认为是提高MA滴度的关键中间体。为验证这一假设，在12 h时添加浓度为1 g/L的PCA以评估其对MA生产的影响。结果（图2c）显示，添加PCA后MA产量显著增加。菌株GM4中MA滴度达到最大值582.3 mg/L，提高了74.71%。这验证了通过增加中间体PCA来增强MA生产的可行性。此外，我们观察到来自肺炎克雷伯菌的aroY和kpdB/D表达比来自E. coli的产生了更高的MA滴度，表明它们更适合MA生产。我们将该菌株命名为MA1用于后续实验。
【数据】初始菌株MA产量：333.3 mg/L（GM4菌株），为初始菌株的10.4倍；PCA添加浓度：1 g/L（12 h时）；添加PCA后MA滴度：582.3 mg/L（GM4），提高74.71%；敲除基因：aroE（cg1835）、pcaG/H、catB；质粒：PEC-1（K. pneumoniae来源aroY+kpdB/D）、PEC-2（E. coli来源）
3.2 通过OptHandle设计最优MA生产菌株
已开发多种计算方法来预测代谢工程策略，以优化代谢通量分布从而增强特定目标化学品的生产。在我们先前的研究中，开发了一种名为OptHandle的计算方法，能够精确预测代谢工程策略。计算建模的这一进展在准确预测代谢工程结果方面具有巨大潜力。在此，我们利用OptHandle优化MA的生物合成，促进代谢调控靶点的识别。
在预测结果中，与莽草酸途径和中心碳代谢相关的靶点是我们关注的焦点。通过代谢途径综合分析、广泛文献调研和预测通量排序，我们确定了12个关键修饰位点。这些修饰位点进一步分为两个模块：（1）莽草酸途径合成的核心酶；（2）负责前体PEP和E4P积累的模块。基于上述结果，进一步开展代谢优化以增强MA生产。
【数据】关键修饰位点：12个；模块分类：核心酶模块（莽草酸途径）、前体积累模块（PEP和E4P）；工具：OptHandle算法
3.3 通过重构莽草酸途径增强代谢通量
基于OptHandle筛选的目标基因，采用级联基因操作策略重构莽草酸途径，旨在增加其代谢通量。这些策略分为三个主要方面：（i）增强核心酶的表达，（ii）促进PEP和E4P的积累，以及（iii）通过不同启动子组合优化基因表达。
如前所述，PCA是莽草酸途径用于MA生产的天然终点。因此，PCA合成强度被用来验证莽草酸途径代谢通量是否增加。首先，通过比较OptHandle鉴定的敲除靶点，我们发现先前敲除的涉及三条降解途径的基因与这些靶点一致。这些基因的敲除一致地提高了莽草酸途径的代谢通量。因此，保留这些敲除操作。
随后，在菌株GM4中分别表达莽草酸途径中的四个关键酶基因（aroG、aroB、aroD和qsuB），以筛选核心途径中的瓶颈基因并促进后续基因组合的设计。这些基因的单独表达导致PCA的显著积累。具体而言，过表达qsuB的菌株PCA产量增加最为显著，达到506.7 mg/L，是GM4菌株的3.2倍（图2d）。这一改善归因于GM4菌株中aroE的敲除，导致DHS积累增加。中间体水平的增加为后续MA生产提供了更充足的前体供应。
【数据】过表达qsuB菌株PCA产量：506.7 mg/L，为GM4菌株的3.2倍；过表达基因：aroG、aroB、aroD、qsuB；背景菌株：GM4（△aroE、△pcaG/H、△catB）
讨论与解读
本研究通过计算工具OptHandle辅助预测最优代谢策略，结合系列代谢工程技术，获得了高效利用葡萄糖生产MA的谷氨酸棒状杆菌菌株。通过增加前体供应、增强核心途径酶表达和选择优化启动子，增强了莽草酸途径的代谢通量。重构的莽草酸途径与MA生产关键基因经优化整合后，所得菌株在50 mL摇瓶中MA产量为0.29 mol/mol葡萄糖（10.35 g/L），在5 L生物反应器中为0.30 mol/mol葡萄糖（88.2 g/L）。这是目前研究中以葡萄糖为碳源报道的最高MA产量，也是谷氨酸棒状杆菌中葡萄糖生产MA的最高报道产量，从而增加了通过生物过程工业化生产MA的潜力。此外，为使菌株能够在更经济的葡萄糖来源中生产MA，研究团队在玉米秸秆水解液中对菌株进行适应性实验室进化，适应后菌株OD₆₀₀提高了227.0%，在高固含量玉米秸秆水解液中MA滴度达19.9 g/L，葡萄糖产率为0.33 mol/mol。
【数据】摇瓶产量：10.35 g/L（0.29 mol/mol葡萄糖）；5 L反应器产量：88.2 g/L（0.30 mol/mol葡萄糖）；ALE后OD₆₀₀提升：227.0%；水解液MA滴度：19.9 g/L；水解液葡萄糖产率：0.33 mol/mol
编译者解读
本研究展示了计算设计与实验验证闭环驱动的菌株工程范式——OptHandle预测靶点与实验敲除结果高度吻合，体现了机器学习辅助代谢工程的实际价值。值得关注的是，研究没有止步于纯葡萄糖发酵，而是通过适应性实验室进化将菌株拓展至玉米秸秆水解液体系，虽然19.9 g/L的绝对产量仍低于纯糖发酵，但0.33 mol/mol的产率反而更高，说明复杂底物中的胁迫压力可能意外激活了有利的代谢重编程。从合成生物学应用角度看，88.2 g/L的产量已具备工业放大潜力，但水解液体系中的产量落差提示，抑制物耐受与高产性状的整合仍需要更精细的调控策略。
参考来源
Li, M. (2024). Corynebacterium glutamicum cell factory design for the efficient production of cis, cis-muconic acid. Metabolic Engineering. DOI: 10.1016/j.ymben.2024.02.005
DOI: 10.1016/j.ymben.2024.02.005