来源：Systems metabolic engineering of Escherichia coli for high-yield production of Para-hydroxybenzoic acid（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
对羟基苯甲酸（PHBA）是食品与化妆品行业中广泛使用的防腐剂及稳定剂。本研究以L-苯丙氨酸生产菌株为底盘，通过系统代谢工程改造，将PHBA产量提升至14.17 g/L，并开发了一种新型加速进化系统，使菌株对PHBA的半抑制浓度（IC50）提高47%，最终在5-L发酵罐中实现21.35 g/L的产量。该研究为PHBA的绿色生物制造提供了可行的工业菌株。
研究背景
微生物作为绿色细胞工厂，可利用可再生底物生产多种食品和化妆品相关化合物。大肠杆菌因其遗传背景清晰、遗传工具丰富、遗传特性稳定，被广泛用于食品工业发酵过程。截至目前，已利用大肠杆菌细胞工厂生产了多种高价值化合物，包括氨基酸、萜烯和有机酸等。这些代谢产物不仅是膳食补充剂的关键营养成分，还能改善食品的外观和口感。此外，大肠杆菌细胞工厂还被广泛应用于抗氧化剂、防晒剂及其他生物活性分子的生产。
对羟基苯甲酸（PHBA）是有机合成中的重要化合物，广泛用于食品、化妆品和制药行业，可显著延长产品保质期并增强稳定性。然而，微生物发酵生产PHBA的产量和生产率受限于产物毒性和复杂的代谢通量分布。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于补充表1。质粒构建使用大肠杆菌JM109，基因表达在大肠杆菌BL21中进行，突变模块测试使用大肠杆菌W3110，本实验室保存的大肠杆菌Phe（菌株保藏编号FMME636）作为PHBA生产的底盘菌株。本研究中广泛使用的质粒pQJN、pTrcHisA、pEM和pCDR均来源于本实验室。根据大肠杆菌密码子优化的异源基因合成由天霖生物技术有限公司完成。本研究使用Luria-Bertani（LB）和Terrific Broth（TB）培养基进行大肠杆菌DNA操作和蛋白质筛选相关的培养。大肠杆菌的基因组修饰采用CRISPR-Cas9系统。必要时，培养基中添加氨苄青霉素（100 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）、壮观霉素（33 mg/L）和氯霉素（33 μg/mL）以维持质粒。
【数据】菌株：E. coli JM109、BL21、W3110、Phe（FMME636）；抗生素浓度：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、壮观霉素33 mg/L、氯霉素33 μg/mL
2.2 DNA操作
使用Gibson组装技术构建靶向特定过表达基因的质粒。启动子和核糖体结合位点（RBS）的序列详情见补充表2。工程菌株与含有相关N20序列的pTargetF和pCas9质粒共转化，用于基因组靶向和敲低poxB、ldhA等特定旁系同源基因。包括aroB和aroK在内的某些过表达基因使用特异性试剂盒从基因组中扩增。PrimeSTAR、T4 DNA连接酶、限制性内切酶和ExTaq酶由Takara生物技术有限公司提供。一步同源重组酶由Vazyme生物技术有限公司提供。
【数据】试剂来源：Takara（PrimeSTAR、T4 DNA连接酶、限制酶、ExTaq）；Vazyme（同源重组酶）
2.3 酶活测定
酶的表达和纯化按照先前记载的方法进行（Gao等，2018）。使用纯化酶通过体外级联反应鉴定限速步骤。反应混合物包含100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM莽草酸、10 mM ATP、6 mM PEP、1 mM FMN、5 mM NADPH、50 mM KCl、5 mM MgCl2、200 mM NaCl和纯化酶。反应在37°C孵育30分钟后用盐酸终止。上清液通过12000 rpm离心10分钟获得，然后用高效液相色谱（HPLC）测定PHBA浓度。
【数据】反应体系：100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM莽草酸、10 mM ATP、6 mM PEP、1 mM FMN、5 mM NADPH、50 mM KCl、5 mM MgCl2、200 mM NaCl；温度：37°C；时间：30 min；离心：12000 rpm，10 min
2.4 存活率测定与IC50分析
为评估PHBA的细胞毒性效应，从摇瓶或发酵罐中收集用于PI染色的细胞样品，在4°C下以1000 rpm离心5分钟。样品用预冷PBS（pH 7.0）洗涤并重悬两次，稀释至OD610为0.2，然后加入2 μL PI染料（生工生物，上海，中国）。在4°C避光孵育20–30分钟。使用流式细胞仪通过PE-Cy5-A红色通道（695/40 nm检测滤光片）测定活细胞数，每个样品至少记录20,000个细胞。数据使用FlowJo软件（FlowJo-V10）处理，使用Origin 2018进行非线性曲线拟合以确定半抑制浓度（IC50）。
【数据】离心：1000 rpm，5 min，4°C；OD610：0.2；PI染料：2 μL；孵育：4°C，20–30 min，避光；流式检测：PE-Cy5-A通道，695/40 nm，≥20,000细胞/样品
2.5 启动子和RBS相对强度的测定
以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。使用pET-28a-mKate载体构建含有不同启动子或RBS的重组质粒，并通过测序验证其正确性。含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含抗生素的LB培养基中，于37°C、200 rpm条件下培养12小时。使用PBS将细胞稀释至OD为0.4–0.8，使用酶标仪（Cytation 3，BioTek，Winooski，VT，USA）在激发波长588 nm和发射波长633 nm下测定荧光强度。
【数据】培养条件：LB培养基，37°C，200 rpm，12 h；OD：0.4–0.8；荧光检测：激发588 nm，发射633 nm
2.6 培养条件
摇瓶PHBA生产：用无菌接种环划线斜面培养基。37°C孵育16小时后，加入10 mL无菌水混匀，取2 mL混合物转接至50 mL种子培养基中。混合物在37°C、200 rpm下培养约7.5–8小时，直至OD610达到11–12，制备一级种子液。随后，将5 mL一级种子液转接至含45 mL种子培养基的摇瓶中，在37°C、200 rpm下培养约3.5–4小时，直至OD610达到15–16，制备二级种子液。最后，将5 mL二级种子液接种至含45 mL发酵培养基的摇瓶中，在37°C、200 rpm下培养48小时。
种子培养基成分（1 L）包括：5 g/L NaCl、32 g/L胰蛋白胨、20 g/L酵母提取物（FM902）和5.2 g/L甘油。发酵培养基（1 L）包含：7 g/L K2HPO4、5 g/L酵母提取物（FM902）、2 g/L柠檬酸、30 mg/L FeSO4·7H2O、1.2 g/L酪氨酸、10 g/L葡萄糖、1 g/L MgSO4·7H2O、1 mL金属离子溶液、1 mg/L VBH、0.3 mg/L VB1、0.1 mg/L VB3、3 g/L (NH4)2SO4、0.6 g/L L-苯丙氨酸和6.1 mg/L MnSO4·H2O。发酵培养基中使用酚红（8 mg/L）作为pH指示剂，用25% v/v NH4OH将pH调至6.9。每8小时取样一次。若培养基中残留葡萄糖浓度低于5 g/L，则补充至10 g/L。
发酵罐PHBA生产：将15%（v/v）培养的二级种子液接种至5-L发酵罐，初始通气量为2 vvm，初始搅拌速度为400 rpm。发酵过程中，通过添加25% v/v NH4OH维持pH为6.9，温度控制在37°C，手动调节搅拌速度和通气量以维持溶解氧在30%–40%之间。接种后6小时，随着溶解氧水平升高和初始葡萄糖耗尽，使用720 g/L葡萄糖溶液启动自动补糖，将发酵液中的葡萄糖浓度维持在约1 g/L。当OD610达到19时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。
【数据】种子培养基：5 g/L NaCl、32 g/L胰蛋白胨、20 g/L酵母提取物（FM902）、5.2 g/L甘油；发酵培养基：7 g/L K2HPO4、5 g/L酵母提取物、2 g/L柠檬酸、30 mg/L FeSO4·7H2O、1.2 g/L酪氨酸、10 g/L葡萄糖、1 g/L MgSO4·7H2O、1 mL金属离子溶液、1 mg/L VBH、0.3 mg/L VB1、0.1 mg/L VB3、3 g/L (NH4)2SO4、0.6 g/L L-苯丙氨酸、6.1 mg/L MnSO4·H2O、8 mg/L酚红；pH 6.9；一级种子：37°C，200 rpm，7.5–8 h，OD610 11–12；二级种子：37°C，200 rpm，3.5–4 h，OD610 15–16；摇瓶发酵：37°C，200 rpm，48 h；发酵罐：15%接种量，2 vvm，400 rpm，pH 6.9，37°C，DO 30%–40%，补糖浓度720 g/L，IPTG诱导OD610为19
2.7 体内诱变细胞培养
含有不同Mutator的菌株在含适当抗生素的LB培养基中过夜培养，每个菌株设置三个生物学重复。随后，将过夜培养物以1%接种量转接至含0.04 mM IPTG的新鲜LB培养基中，在24孔板中于37°C、400 rpm振荡培养。细胞每8小时稀释并培养一次，每个间隔计为一个循环，过程重复最多30个循环。每个循环后，部分细胞保存在15%甘油溶液中，于−40°C储存。
【数据】IPTG浓度：0.04 mM；培养条件：37°C，400 rpm，24孔板；循环周期：8 h/循环，最多30循环；保存：15%甘油，−40°C
2.8 利福平抗性测试
在不同时间点，将诱变细胞在新鲜LB培养基中十倍梯度稀释，并涂布于含或不含50 μg/mL利福平的LB琼脂平板上。37°C孵育超过15小时后，计数含利福平和不含利福平的LB琼脂平板上的菌落数，以确定获得利福平抗性的细胞比例。
【数据】利福平浓度：50 μg/mL；孵育：37°C，>15 h；稀释方式：十倍梯度
2.9 抗生素抗性测试
30轮诱变循环（共240小时）后，将培养物十倍稀释并涂布于不含抗生素或含利福平（50 μg/mL）、头孢噻肟（5 μg/mL）、四环素（10 μg/mL）、链霉素（30 μg/mL）或氯霉素（30 μg/mL）等抗生素的LB琼脂平板上。随后，平板在37°C恒温培养箱中孵育超过15小时。利用各平板的菌落计数确定对各种抗生素的抗性频率。
【数据】诱变循环：30轮（240 h）；抗生素：利福平50 μg/mL、头孢噻肟5 μg/mL、四环素10 μg/mL、链霉素30 μg/mL、氯霉素30 μg/mL；孵育：37°C，>15 h
2.10 PHBA耐受性的适应性进化
菌株PHBA08在LB培养基中过夜培养，随后转接至三个含抗生素、0.04 mM IPTG和新鲜发酵培养基的摇瓶中。
【数据】IPTG浓度：0.04 mM；摇瓶数：3个
研究结果
3.1 基于化学计量学分析的底盘菌株筛选
为选择合适的PHBA生产底盘菌株，首先使用理性化学计量学分析了PHBA的生物合成途径。从葡萄糖底物合成PHBA的优化化学计量方程为：4葡萄糖 → 2 PHBA + 4 CO2 + 4 NADH + 2 NADPH，最大理论产率为0.5 mol/mol（补充图1）。考虑到磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）是PHBA生产的关键前体，潜在的底盘菌株包括本实验室保存的3-脱氢莽草酸、莽草酸（SA）、L-苯丙氨酸（Phe）、L-酪氨酸（Tyr）和L-色氨酸（Trp）高产菌株。进一步考虑到PHBA生产的最佳PEP/E4P比为2:1，最终选择芳香族氨基酸——特别是Phe、Tyr和Trp的高产菌株作为起始菌株，因为它们的最佳PEP/E4P需求比与PHBA生产相同（图1a）。分支酸（CHA）是芳香族氨基酸和PHBA共有的代谢中间体（图1a）。
为实现PHBA积累，在三个芳香族氨基酸生产工程菌株中分别破坏了从CHA到Phe、Tyr和Trp的途径。同时，引入来自大肠杆菌的分支酸脱羧酶（由ubiC编码），构建菌株PHBA01–1、PHBA01–2和PHBA01–3。摇瓶发酵实验表明，大肠杆菌PHBA01–1的PHBA产量最高，达到0.68 g/L，同时副产物Phe产量为1.21 g/L（图1c）。因此，该菌株更名为PHBA01，并被选作后续优化对象。
【数据】理论产率：0.5 mol/mol；最佳PEP/E4P比：2:1；PHBA01–1产量：0.68 g/L；副产物Phe：1.21 g/L
3.2 通过系统代谢工程提高PHBA产量
在PHBA生物合成途径中，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）和SA被确定为关键代谢节点。因此，将整个生物合成途径分为三个模块：葡萄糖到DAHP（模块1）、DAHP到SA（模块2）和SA到PHBA（模块3），进行系统模块化优化（图1a）。
增强PEP和E4P的供应是增加模块1代谢通量的关键瓶颈，因为这两种代谢物是DAHP生物合成的重要前体。首先过表达aroG S180F以缓解反馈抑制，从而促进PEP和E4P缩合生成DAHP，构建菌株PHBA02（图2a）。结果显示，PHBA的产量较PHBA01提高了35%，达到0.92 g/L（图1b）。
为提高PEP供应，在PHBA02中过表达磷酸烯醇式丙酮酸合酶（由ppsA编码），并从基因组中敲除poxB和ldhA基因以阻断冗余途径，构建菌株PHBA03–1。结果显示，PHBA产量进一步提高至1.45 g/L，较PHBA02提高了58%（图2a）。此外，为增强E4P供应，在PHBA03–1中过表达转酮醇酶基因tktA，构建菌株PHBA03–2（pTrc-EcubiC-aroG S180F-ppsA-tktA），PHBA产量进一步达到1.92 g/L（图2a）。随后，将表达盒（pTrc-EcubiC-aroG S180F-ppsA-tktA）插入PHBA02的基因组中，构建菌株PHBA03。摇瓶发酵显示，该菌株的PHBA产量提高至2.05 g/L（图1b）。
为增强模块2的代谢通量，选择优化3-脱氢奎尼酸合酶（由aroB编码）和莽草酸5-脱氢酶（由aroE编码）的表达水平，因为AroB和AroE是SA代谢途径中的关键酶（图1a）。使用pEM（中等拷贝数）质粒作为载体调控aroB和aroE的表达水平，采用一系列不同强度的启动子（PJ23119为高表达，PJ23108为中等表达，PJ23114为低表达）（补充图2）。构建了aroB和aroE的九种遗传构建体，分别插入菌株PHBA03中，构建菌株PHBA04–1至PHBA04–9。通过摇瓶发酵确定最佳组合。结果表明，菌株PHBA04–5的PHBA产量最高（2.85 g/L），该菌株中aroB和aroE均以中等水平表达（图2b）。因此，大肠杆菌PHBA04–5更名为PHBA04。
模块3通过四步级联反应将SA转化为PHBA，依次由莽草酸激酶（AroK，EC 2.7.1.71）、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（AroA，EC 2.5.1.19）、分支酸合酶（AroC，EC 4.2.3.5）和分支酸脱羧酶（UbiC，EC 4.1.3.40）催化（图3a）。基于eQuilibrator分析，对整个级联途径的热力学进行了分析。在pH = 7.0时，从SA到PHBA的级联反应各步骤的吉布斯自由能变化（ΔrG0'）分别为−126.4、−51、−97.2和−164.2 kJ/mol，整个级联反应的总吉布斯自由能为−438.8 kJ/mol。
为鉴定模块3中的限速步骤，构建无细胞系统进行精确指导。基于文献挖掘和包括NCBI和BRENDA在内的数据库，选择并纯化了来自不同物种的AroK、AroA、AroC和UbiC酶。基于酶活测定，选择CgAroK、EcAroA、BsAroC和PrUbiC作为模块3的途径酶（补充表3）。当纯化酶CgAroK、EcAroA、BsAroC和PrUbiC的摩尔比控制在1:1:1:1时，30分钟内可从10 mM SA产生1.06 μM PHBA（图3b–e）。随后，在保持其他酶浓度恒定的情况下，改变每种酶的浓度，以评估单个酶对级联途径的影响。当CgAroK、EcAroA、BsAroC和PrUbiC的浓度分别单独提高至初始浓度的三倍时，模块3的产物产量分别增加了1.6倍、2.7倍、5.6倍和1.6倍。这些结果表明，EcAroA和BsAroC对模块3的影响更显著，其中BsAroC是关键限速酶（图3e）。
根据体外测试结果，在菌株PHBA04中以相似比例过表达模块3中的途径酶。以pCDR质粒为载体，使用PJ23114/PJ23108/PJ23119/PJ23114启动子分别表达CgAroK、EcAroA、BsAroC和PrUbiC（PJ23119为高表达；PJ23108为中等表达；PJ23114为低表达），构建菌株PHBA05（补充图2）。结果表明，PHBA05的PHBA产量达到3.97 g/L，较PHBA04提高了39%。然而，该菌株的最大细胞密度（OD610）降低了28%（图1b）。
为优化PHBA合成途径中的碳通量转化并防止生长抑制，对模块2和模块3的质粒载体进行了优化。使用不同拷贝数的质粒（pQJN：低拷贝数；pEM：中等拷贝数；pCDR：高拷贝数）控制模块2和模块3的表达。构建了九个表达盒并整合至PHBA05中，构建菌株PHBA06–1至PHBA06–9，通过摇瓶发酵筛选最佳组合。如图所示，PHBA06–8（模块2低表达，模块3中等表达）在九个菌株中获得了最高的PHBA产量（4.81 g/L）。此外，其生长状况得到改善，最大OD610为30.70，较PHBA05提高了22%，因此命名为PHBA06（图2c）。PHBA06中的主要副产物为CHA，浓度为3.2 g/L。
【数据】PHBA02产量：0.92 g/L（较PHBA01提高35%）；PHBA03–1产量：1.45 g/L（较PHBA02提高58%）；PHBA03–2产量：1.92 g/L；PHBA03产量：2.05 g/L；PHBA04–5产量：2.85 g/L；ΔrG0'值：−126.4、−51、−97.2、−164.2 kJ/mol；总ΔrG0'：−438.8 kJ/mol；体外产物：1.06 μM PHBA（10 mM SA，30 min）；酶浓度提高3倍后产量增加：CgAroK 1.6倍、EcAroA 2.7倍、BsAroC 5.6倍、PrUbiC 1.6倍；PHBA05产量：3.97 g/L（较PHBA04提高39%），OD610降低28%；PHBA06–8产量：4.81 g/L；最大OD610：30.70（较PHBA05提高22%）；主要副产物CHA：3.2 g/L
讨论与解读
生产途径中代谢通量低限制了大肠杆菌生产高价值化学品的能力。本研究通过系统代谢工程对关键基因进行了广泛改造，将生产率提高至此前报道值（0.17 g/L/h）的2.66倍。在高价值化学品生产中，单一代谢工程策略往往只关注优化某一特定代谢节点或关键酶活性，导致产量提升有限。系统代谢工程通过整合多种策略优化整个代谢网络，促进生长与生产之间的动态平衡，以最大化菌株的生产能力。
本研究采用理性系统代谢工程策略，使PHBA产量较原始菌株提高了20.8倍。研究中首先通过化学计量学分析筛选底盘菌株，随后将整个合成途径分为三个模块进行系统优化，利用体外无细胞系统精确鉴定限速步骤，再通过拷贝数优化实现模块间平衡。针对产物毒性问题，开发了包含脱氨酶、RNA聚合酶α亚基、尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂和PHBA响应型启动子PyhcN的新型加速进化系统，在15天内获得IC50提高47%的突变菌株。最终该菌株在5-L发酵罐中达到21.35 g/L的PHBA产量。
编译者解读
本研究展示了典型的"理性设计+自适应进化"双轮驱动策略——先通过模块化代谢工程将产量推到较高水平，再用定向进化解决产物耐受性这一瓶颈问题。体外级联反应鉴定限速酶的方法尤其值得借鉴，避免了盲目过表达带来的代谢负担。值得注意的是，最终产量21.35 g/L虽已处于领先水平，但0.19 g/g葡萄糖的得率仍低于理论值，说明碳流分配和副产物（如CHA积累）仍有优化空间。该策略对其它芳香族化合物（如没食子酸、水杨酸）的微生物生产具有直接参考价值。
参考来源
Liu Q. Systems metabolic engineering of Escherichia coli for high-yield production of Para-hydroxybenzoic acid. Food Chemistry, 2024. DOI: 10.1016/j.foodchem.2024.140165
DOI: 10.1016/j.foodchem.2024.140165