来源：Metabolic engineering of Escherichia coli for the efficient production of 5-hydroxyvaleric acid（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
5-羟基戊酸（5-HV）是合成聚酯和聚氨酯的重要五碳平台化合物，化学合成法条件苛刻且成本高。本研究通过系统代谢工程改造大肠杆菌W3110，引入假单胞菌的赖氨酸单加氧酶（DavB）和5-氨基戊酰胺水解酶（DavA），结合大肠杆菌内源的转氨酶（GabT）及三种醛还原酶，构建了基于5-氨基戊酸（AMV）途径的5-HV微生物合成体系。研究发现醛还原酶YqhD效果最佳，双质粒系统过表达YajO可显著提升产量，赖氨酸通透酶LysP的过表达进一步增效，而hok/sok毒素-抗毒素系统的引入有效维持了质粒稳定性。最终摇瓶发酵产量达5.59 g/L，10 L发酵罐补料分批发酵产量达35.6 g/L。
研究背景
5-羟基戊酸是重要的五碳平台化合物，广泛应用于聚氨酯、可生物降解聚酯制备及制药工业，同时也是1,5-戊二醇和δ-戊内酯的关键合成前体。含有5-HV单体的聚羟基脂肪酸酯（PHA）因其优异的材料性能和生物降解性而备受关注。现有化学合成法如戊二酸还原或糠酸氢化需要苛刻的反应条件和昂贵的催化剂，成本和环境问题突出。基于赖氨酸分解代谢的AMV途径为5-HV的微生物生产提供了可行路线：L-赖氨酸在赖氨酸单加氧酶（DavB）和5-氨基戊酰胺水解酶（DavA）催化下转化为AMV，再经转氨酶和醛还原酶等作用生成5-HV。然而，目前5-HV的微生物生产效率低下，难以满足规模化需求，亟需开发高效的微生物生产系统。
研究方法
2.1 质粒构建与菌株构建
本研究所用菌株和质粒见表1（原文Table 1），克隆宿主为大肠杆菌BL21，生产菌株为大肠杆菌W3110。所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表2，原文Table 2）。PCR扩增使用Proflex PCR系统（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）。
从pSTV-Plac-T7rbs-PpDavBA-dplac3（KEGG登录号PP_0383和PP_0382）扩增恶臭假单胞菌davB和davA基因，从大肠杆菌扩增gabT（KEGG登录号b2662）和yqhD（KEGG登录号b3011）基因，插入pUC57载体获得重组质粒pUC57-davBA-gabT-yqhD。质粒骨架pSTV-Plac由实验室保存的pSTV28-Plac-T7rbs-ldcC-dPlac3经BamHI和SacI双酶切获得。以pSTV-davB-F/pSTV-davB-R为引物从pUC57-davBA-gabT-yqhD扩增davBA-gabT-yqhD片段，克隆至pSTV-Plac获得质粒pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yqhD。随后用KpnI和SacI酶切去除yqhD片段，获得用于连接其他醛还原酶基因的质粒骨架。扩增大肠杆菌yahK片段和恶臭假单胞菌KT2440 yajO片段，通过Gibson assembly克隆至上述质粒骨架，获得重组质粒pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yahK和pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yajO。类似地，扩增大肠杆菌gabP基因并插入pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yqhD，获得重组质粒pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yqhD-gabP。扩增大肠杆菌lysP基因并插入pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yqhD-gabP，获得重组质粒pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yqhD-gabP-lysP。
pCDF-Trc质粒由pTrc99a衍生而来。从pTrc99a扩增Trc片段，PCR产物连接获得pCDF-Trc。随后将yqhD、yahK和yajO分别克隆至pCDF-Trc。从大肠杆菌XL1-Blue扩增hok/sok基因，插入质粒pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yqhD-gabP，获得质粒pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yqhD-gabP-lysP-hok/sok。同样，将hok/sok基因扩增并插入pCDF-Trc-yajO，获得质粒pCDF-Trc-yajO-hok/sok。
【数据】菌株：E. coli BL21（克隆宿主）、E. coli W3110（生产菌株）；模板菌：P. putida、P. putida KT2440、E. coli XL1-Blue；质粒骨架：pSTV-Plac（BamHI/SacI酶切）、pCDF-Trc（由pTrc99a衍生）；工具酶：BamHI、SacI、KpnI；组装方法：Gibson assembly；PCR系统：Proflex PCR系统（Thermo Fisher Scientific）
2.2 培养基
大肠杆菌BL21在LB培养基（含10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物）中培养，用于质粒繁殖和细胞生长。工程大肠杆菌W3110产5-HV的摇瓶培养基为M9Y培养基，由M9基础培养基（6.78 g/L Na₂HPO₄、0.5 g/L NaCl、3 g/L KH₂PO₄、1 g/L NH₄Cl、246.5 mg/L MgSO₄·7H₂O、14.7 mg/L CaCl₂·2H₂O）添加10 g/L葡萄糖、5 g/L酵母提取物和15 g/L L-赖氨酸盐酸盐配制而成。根据需要添加硫酸链霉素（100 μg/mL）和氯霉素（34 μg/mL）。
分批发酵初始培养基为M9Y培养基，含40 g/L葡萄糖、5 g/L酵母提取物和40 g/L L-赖氨酸盐酸盐；发酵进行至55 h时，向发酵罐补加55 g L-赖氨酸盐酸盐。根据需要添加硫酸链霉素（100 μg/mL）和氯霉素（34 μg/mL）。
【数据】LB培养基：10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物；M9基础培养基：6.78 g/L Na₂HPO₄、0.5 g/L NaCl、3 g/L KH₂PO₄、1 g/L NH₄Cl、246.5 mg/L MgSO₄·7H₂O、14.7 mg/L CaCl₂·2H₂O；摇瓶培养基：10 g/L葡萄糖、5 g/L酵母提取物、15 g/L L-赖氨酸盐酸盐；发酵初始培养基：40 g/L葡萄糖、5 g/L酵母提取物、40 g/L L-赖氨酸盐酸盐；抗生素：链霉素100 μg/mL、氯霉素34 μg/mL；补料：55 h补加55 g L-赖氨酸盐酸盐
2.3 摇瓶培养生产5-HV
种子摇瓶培养在振荡培养箱中进行，温度37°C、转速170 rpm。挑取重组大肠杆菌W3110的新鲜单菌落，接种至含5 mL LB培养基的50 mL摇瓶中，培养8 h。随后将种子培养物转移至含40 mL M9Y培养基的250 mL摇瓶中，在37°C、170 rpm振荡培养箱中培养。当培养物光密度（OD₆₀₀）达到0.6–0.8时，加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM，摇瓶培养在30°C、200 rpm条件下进行。摇瓶培养期间取样测定5-HV和L-赖氨酸盐酸盐浓度、pH及细胞生长。
【数据】种子培养：37°C、170 rpm、8 h、5 mL LB/50 mL摇瓶；发酵培养：40 mL M9Y/250 mL摇瓶、37°C、170 rpm；诱导条件：OD₆₀₀ 0.6–0.8时加IPTG至0.5 mM；诱导后培养条件：30°C、200 rpm
2.4 分批发酵
使用10 L生物反应器（国强生物工程设备有限公司，上海，中国，FUS-10 L）进行主发酵。挑取新鲜单菌落接种至含50 mL LB培养基的500 mL摇瓶中，培养10 h。随后将50 mL培养液转移至含5 L M9Y培养基（含40 g/L葡萄糖、5 g/L酵母提取物和40 g/L L-赖氨酸盐酸盐）的10 L生物反应器中。通气比和罐压分别控制在0.4 vvm和0.05–0.08 MPa。通过流加30%（w/v）氢氧化钠水溶液维持pH为6.7。发酵过程中搅拌转速为400 rpm，随着溶解氧下降，提高搅拌转速以维持溶解氧在20%–40%之间。温度设定为37°C维持9 h，随后调整至30°C维持至发酵结束，同时向发酵罐中加入IPTG至终浓度0.5 mM。
【数据】发酵罐：10 L（FUS-10 L）；装液量：5 L M9Y培养基；通气比：0.4 vvm；罐压：0.05–0.08 MPa；pH：6.7（30% w/v NaOH流加维持）；搅拌转速：400 rpm起始，依溶解氧调整；溶解氧维持：20%–40%；温度：37°C（9 h）→30°C（剩余时间）；IPTG：0.5 mM
2.5 分析方法
通过紫外分光光度计UV1900（SHIMADZU，京都，日本）测定600 nm处吸光度（OD₆₀₀）监测细菌生长。采用比色法测定培养液中L-赖氨酸盐酸盐浓度：取一定量培养液稀释后与茚三酮在沸水浴中反应，测定475 nm处吸光度，获得L-赖氨酸盐酸盐浓度。采用气相色谱测定5-HV浓度：取一定量培养液，在12000 rpm离心15 min，使用GC2010pro（SHIMADZU）测定。进样口温度设为280°C，氮气流量2.6 mL/min，进样量0.5 μL，分流比30:1。FID检测器温度300°C，空气流量400 mL/min，氮气流量25 mL/min，氢气流量30 mL/min。柱温程序：初始温度50°C维持5 min，升温至210°C维持5 min。色谱柱类型为Wondacap-5 30 m × 0.25 mm × 0.25 µm。
【数据】OD₆₀₀测定：UV1900紫外分光光度计（SHIMADZU）；L-赖氨酸盐酸盐测定：茚三酮比色法、沸水浴、475 nm；5-HV测定：气相色谱GC2010pro；离心条件：12000 rpm、15 min；进样口温度：280°C；氮气流速：2.6 mL/min；进样量：0.5 μL；分流比：30:1；FID温度：300°C；空气流速：400 mL/min；氮气流速：25 mL/min；氢气流速：30 mL/min；柱温程序：50°C保持5 min→210°C保持5 min；色谱柱：Wondacap-5 30 m × 0.25 mm × 0.25 µm
研究结果
3.1 三种醛还原酶对5-HV生产的影响
基于AMV途径对大肠杆菌W3110进行工程改造以生产5-HV，策略如图1所示。由于醛还原酶催化5-HV生物合成中的关键步骤，将大肠杆菌的yqhD和yahK以及恶臭假单胞菌KT2440的yajO克隆至pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT。随后将各重组质粒转化至大肠杆菌W3110，构建三株5-HV生产重组菌株：大肠杆菌5HV1（携带pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yqhD，如图2A所示）、大肠杆菌5HV2（携带pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yahK，如图2B所示）和大肠杆菌5HV3（携带pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yajO，如图2C所示）。所有菌株均能生产5-HV。培养120 h后，5-HV浓度分别达到1.22 ± 0.10 g/L（大肠杆菌5HV1，图2D）、0.97 ± 0.06 g/L（大肠杆菌5HV2，图2E）和0.93 ± 0.06 g/L（大肠杆菌5HV3，图2F）。YajO首次被报道用于高效生产5-HV。大肠杆菌5HV1的5-HV产量比其他两株菌高25%，表明YqhD比其他两种醛还原酶更具优势。
考虑到醛还原酶活性影响5-HV生产效率，评估了在双质粒系统中使用强启动子过表达醛还原酶基因的效果。将yqhD、yahK和yajO基因克隆至pCDF-Trc的Trc启动子下。将构建的质粒转化至大肠杆菌5HV1，获得大肠杆菌5HV4（质粒基因组成如图3A所示）、大肠杆菌5HV5（质粒基因组成如图3B所示）和大肠杆菌5HV6（质粒基因组成如图3C所示）。摇瓶培养结果显示，双质粒系统的5-HV产量较单质粒系统显著提高。特别是大肠杆菌5HV6可生产1.87 ± 0.09 g/L（图3F），比大肠杆菌5HV4（1.47 ± 0.02 g/L，图3D）高27.2%，比大肠杆菌5HV5（1.62 ± 0.02 g/L，图3E）高15.4%。
【数据】5-HV产量（120 h）：5HV1 1.22 ± 0.10 g/L（yqhD）、5HV2 0.97 ± 0.06 g/L（yahK）、5HV3 0.93 ± 0.06 g/L（yajO）；5HV1比5HV2/5HV3高25%；双质粒系统：5HV4 1.47 ± 0.02 g/L、5HV5 1.62 ± 0.02 g/L、5HV6 1.87 ± 0.09 g/L；5HV6比5HV4高27.2%、比5HV5高15.4%
3.2 转运蛋白对5-HV生产的影响
底物进入细胞的速率以及胞外中间体转运进入细胞的效率对产物合成至关重要。在戊二酸或1,5-戊二醇的微生物生产中，AMV是主要副产物之一。为提高L-赖氨酸盐酸盐进入细胞的速率并减少AMV在胞外的积累，构建了大肠杆菌5HV7（携带pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yqhD-gabP和pCDF-Trc-yajO，如图4A所示）和大肠杆菌5HV8（携带pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yqhD-gabP-lysP和pCDF-Trc-yajO，如图4B所示）用于5-HV的微生物生产。大肠杆菌5HV8可达到2.73 ± 0.15 g/L的5-HV产量（图4C），比大肠杆菌5HV7高43.68%（图4D），说明过表达lysP比gabP更有效地促进了5-HV的微生物生产。
【数据】5-HV产量：5HV8 2.73 ± 0.15 g/L（gabP+lysP）、5HV7（仅gabP）；5HV8比5HV7高43.68%
3.3 通过分离后杀伤系统维持质粒稳定性
质粒不稳定性主要由细胞分裂过程中质粒不均等分配至子细胞的因素引起。为提高质粒稳定性，将来自大肠杆菌XL1-Blue的hok/sok系统插入pSTV-Plac-T7rbs-davBA-gabT-yqhD-gabP-lysP和pCDF-Trc-yajO中，获得大肠杆菌5HV9（质粒基因组成如图5A所示）。在摇瓶培养过程中比较了大肠杆菌5HV9和5HV8的5-HV产量及质粒稳定性。每24 h取样测定5-HV滴度、L-赖氨酸盐酸盐浓度和细胞生长。将培养物涂布于含适当抗生素的LB琼脂平板以检测质粒稳定性。
如图5B所示，大肠杆菌5HV8在24 h时的质粒丢失率相对较高，且随培养时间延长急剧增加，表明培养期间质粒丢失严重。相比之下，大肠杆菌5HV9在培养期间质粒丢失率低于10%，表明hok/sok系统显著提高了质粒稳定性。
大肠杆菌5HV8和5HV9摇瓶培养生产5-HV的时间曲线如图6所示。随着培养时间延长，培养液pH从约7.0降至5.0以下，L-赖氨酸盐酸盐浓度逐渐降低（图6A和图6B）。两株菌的生长过程几乎相同：24 h后微生物生长进入稳定期，OD₆₀₀约为2.0（图6A和图6B）。最终，大肠杆菌5HV9实现了5.59 ± 0.02 g/L的5-HV产量（图6B），产率为0.96 mol/mol（5-HV/L-赖氨酸盐酸盐），是大肠杆菌5HV8的2倍以上，与以往系统相比，5-HV微生物生产取得了重大进展。微生物OD较低可能是由于培养液pH值持续下降所致，这可能不利于5-HV的生产，但需要进一步探索。
【数据】质粒丢失率：5HV8在24 h时相对较高且随培养时间急剧增加；5HV9低于10%；pH变化：从约7.0降至5.0以下；OD₆₀₀稳定期：约2.0（24 h后）；5-HV产量：5HV9 5.59 ± 0.02 g/L，产率0.96 mol/mol（5-HV/L-赖氨酸盐酸盐）；5HV9比5HV8产量提高2倍以上
3.4 工程菌株分批发酵生产5-HV
在10 L罐式发酵罐中进行分批发酵以评估大肠杆菌5HV9的5-HV生产能力，结果如图7所示。细胞密度达到20以上（OD₆₀₀），远高于摇瓶培养。葡萄糖浓度从40 g/L降至发酵结束时的几乎为0。5-HV积累在3 h时首次检测到，最终实现35.6 ± 0.3 g/L的5-HV产量，产率为0.92 mol/mol（5-HV/L-赖氨酸盐酸盐）。
分批发酵过程中的在线参数如图8所示。24 h后微生物生长增加，溶解氧（DO）下降。搅拌转速从400 rpm逐渐提高至600 rpm以维持DO在15%–30%之间。CER和OUR缓慢上升至约10 h，在剩余的大部分发酵时间内，CER可达15 mmol/L·h以上，OUR在10 mmol/L·h以上。
【数据】细胞密度：OD₆₀₀ > 20；葡萄糖：40 g/L降至几乎为0；5-HV产量：35.6 ± 0.3 g/L；产率：0.92 mol/mol（5-HV/L-赖氨酸盐酸盐）；首次检测到5-HV：3 h；搅拌转速：400→600 rpm；DO维持：15%–30%；CER：>15 mmol/L·h；OUR：>10 mmol/L·h
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程策略实现了大肠杆菌高效生产5-HV。醛还原酶筛选表明，来源于大肠杆菌的YqhD最适合5-HV生产，而YahK此前被报道更适合谷氨酸棒杆菌的5-HV生产，说明不同宿主对醛还原酶的选择存在差异。双质粒系统过表达醛还原酶显著提升了产量，其中YajO在双质粒系统中的表现尤为突出。转运蛋白工程显示，LysP过表达比GabP更有效地促进了5-HV生产。hok/sok系统的引入有效降低了质粒丢失率，保证了生产稳定性。最终，10 L发酵罐分批发酵实现了35.6 g/L的5-HV产量，产率0.92 mol/mol，展示了该策略的工业化潜力。图9总结了本研究的系统代谢工程策略。
【编译者解读】本研究展示了"酶筛选—表达优化—转运强化—质粒稳定"四位一体的系统代谢工程范式。值得注意的是，作者将来源于不同物种的醛还原酶在同一宿主中进行平行比较，这种策略避免了跨研究数据可比性差的痛点。hok/sok系统作为不依赖抗生素的质粒维持手段，在工业放大中具有实际价值——抗生素添加在大规模发酵中既不经济也不符合绿色生产理念。不过，摇瓶培养中较低的OD₆₀₀（约2.0）提示pH下降可能限制了菌体生长，若能结合pH调控策略，产量仍有提升空间。该工作为五碳平台化学品的生物合成提供了可借鉴的系统改造思路。
参考来源
Chen Chen. Metabolic engineering of Escherichia coli for the efficient production of 5-hydroxyvaleric acid. Process Biochemistry, 2023. DOI: 10.1016/j.procbio.2023.05.021
DOI: 10.1016/j.procbio.2023.05.021