来源：Engineering Pseudomonas putida for lignin bioconversion into cis-cis muconic acid（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质素是自然界最丰富的可再生芳香族化合物来源，但其异质性和复杂的分子结构长期制约着高值化利用。本研究通过代谢工程改造恶臭假单胞菌KT2440，成功构建了能够同时利用H型、G型和S型三类木质素衍生芳香族化合物的细胞工厂，实现顺,顺-粘康酸（CCMA）的高效生物合成。研究团队通过异源表达O-脱甲基酶系统、辅因子工程和共投喂策略，最终在真实木质素水解液中获得9.6 mM CCMA，为木质素生物转化提供了可行的技术路径。
研究背景
木质素是木质纤维素生物质的三大组分之一，占植物细胞壁的15–40%，是全球最大的可再生芳香族化合物来源。制浆造纸工业每年产生约5000–7000万吨木质素。木质素主要由对羟基苯基（H）、愈创木基（G）和紫丁香基（S）三种苯丙烷单元通过碳-碳键和/或醚键连接而成，其复杂异质的大分子结构是进一步增值利用的主要障碍。生物转化路线近年来成为应对木质素异质性结构的有前景策略。多种木质素降解微生物已进化出解聚木质素的能力，部分微生物还发展出汇聚分解代谢途径，可将木质素衍生芳香族化合物混合物同化为中心中间代谢物。这种被称为"生物漏斗"的代谢途径包含侧链裂解、脱羧和氧化等级联酶促反应。恶臭假单胞菌KT2440能有效代谢H型和G型木质素，但缺乏代谢S型木质素的能力，这限制了木质素的整体利用效率。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用菌株和质粒详见表1。恶臭假单胞菌菌株在30°C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养，该培养基含1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和1% NaCl。大肠杆菌用于质粒构建和扩增，在37°C的LB培养基中培养。LB培养基中抗生素添加浓度如下：卡那霉素和庆大霉素对恶臭假单胞菌和大肠杆菌均为50 μg/mL，四环素对恶臭假单胞菌和大肠杆菌均为25 μg/mL。化学感受态大肠杆菌Top10菌株（擎科生物技术有限公司）用于质粒操作。质粒提取试剂盒购自天根（北京，中国）。对香豆酸、阿魏酸、香草酸、4-羟基苯甲酸、原儿茶酸和CCMA购自生工生物（生工生物工程上海股份有限公司）。抗生素购自索莱宝（索莱宝，北京，中国）。恶臭假单胞菌菌株在M9基本培养基中培养，配制方法参照先前研究。种子培养时，M9培养基补充20 g/L葡萄糖。CCMA生产时，M9培养基补充指定浓度的目标芳香族化合物或真实木质素。
【数据】培养基：LB（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl）；M9基本培养基；温度：30°C（恶臭假单胞菌）、37°C（大肠杆菌）；抗生素浓度：卡那霉素50 μg/mL、庆大霉素50 μg/mL、四环素25 μg/mL；葡萄糖：20 g/L
2.2 质粒与菌株构建
聚合酶链式反应（PCR）使用Q5® Hot Start High-Fidelity 2 × Master Mix（New England Biolabs）进行。无缝克隆使用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit（诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国）进行，随后转化至大肠杆菌Top10。所有质粒经Sanger测序（擎科）验证。质粒pCAS-RK2T和pSEVA-gRic6T由浙江大学惠赠。恶臭假单胞菌KT2440的基因操作遵循先前研究所述程序。
【数据】PCR酶：Q5® Hot Start High-Fidelity 2 × Master Mix；无缝克隆试剂盒：ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit；测序方法：Sanger测序；质粒来源：pCAS-RK2T和pSEVA-gRic6T（浙江大学惠赠）
2.3 木质素衍生芳香族化合物的发酵策略
重组菌株从甘油储备液接种至含5 mL LB培养基的12 mL试管中，在30°C、220 rpm条件下培养12 h。随后将培养物接种至含50 mL LB培养基的250 mL摇瓶中，初始OD600为0.5。这些二级种子培养物在30°C、180 rpm条件下培养12 h，达到OD600约5.0。种子细胞通过4200 rpm离心10 min收集，然后接种至制备好的木质素培养基中。二级种子培养物随后接种至含50 mL M9基本培养基的250 mL摇瓶中，补充特定浓度的对香豆酸、阿魏酸、丁香酸或其混合物，初始OD600为1.0、2.0或5.0。混合底物中对香豆酸、阿魏酸和丁香酸的摩尔比为10:2:1，该比例反映了玉米秸秆碱预处理液中的比例。培养在30°C、250 rpm条件下进行。补料分批发酵使用500 mM对香豆酸、100 mM阿魏酸和50 mM丁香酸。CCMA产率按H型和G型芳香族化合物（如对香豆酸和阿魏酸）的消耗量计算。
【数据】种子培养：5 mL LB、30°C、220 rpm、12 h；二级种子：50 mL LB、初始OD600 0.5、30°C、180 rpm、12 h、OD600约5.0；离心：4200 rpm、10 min；发酵：M9培养基、初始OD600 1.0/2.0/5.0、30°C、250 rpm；混合底物摩尔比：对香豆酸:阿魏酸:丁香酸=10:2:1；补料分批：500 mM对香豆酸、100 mM阿魏酸、50 mM丁香酸
2.4 玉米秸秆木质素水解液制备
玉米秸秆购自中国天津当地生物质供应商。玉米秸秆经过组合预处理以获得木质素水解液。简言之，将玉米秸秆装入含2 wt% NaOH溶液的1 L反应器中，固含量为20%（w/v）。反应体系在130°C维持45 min。反应后，固液两相通过纱布过滤分离，获得富含木质素的组分。液体部分以12000 rpm离心10 min，从木质素水解液中分离悬浮细颗粒。木质素水解液中芳香族单体浓度通过高效液相色谱（HPLC）分析。富含木质素的液流含约16.0 mM对香豆酸和2.0 mM阿魏酸。真实木质素批次发酵时，将含5 mM对香豆酸的木质素液流加入M9培养基。发酵在pH 7.0、30°C、250 rpm条件下于250 mL锥形瓶中进行，工作体积30 mL。补料分批发酵使用不同浓度的木质素水解液，以降低真实木质素水解液对细胞生长的潜在抑制作用。
【数据】预处理：2 wt% NaOH、固含量20%（w/v）、130°C、45 min；离心：12000 rpm、10 min；木质素液流组成：约16.0 mM对香豆酸、2.0 mM阿魏酸；批次发酵：5 mM对香豆酸、pH 7.0、30°C、250 rpm、工作体积30 mL
2.5 烟酰胺辅因子比率测定
工程菌株在补充木质素衍生H型、G型和S型芳香族化合物（含或不含20 mM甘油）的M9基本培养基中培养。发酵6 h后，使用商业比色试剂盒（碧云天生物技术，货号#S0179）测定NADPH/NADP+比率。NADP+和NADPH按照制造商说明提取。简言之，取300 μL培养物在4°C、12000 rpm离心2 min，沉淀重悬于200 μL预冷的NADP+/NADPH提取缓冲液中，轻轻吹打促进细胞裂解。随后样品在4°C、12000 rpm离心2 min，上清液作为待测样品。NADP总量和NADPH在450 nm处测定，并根据标准曲线计算。NADPH/NADP+比率使用公式NADPH/（NADP总量−NADPH）计算，其中NADP+定义为NADP总量−NADPH。
【数据】甘油：20 mM；取样时间：6 h；离心：12000 rpm、2 min、4°C；提取缓冲液：200 μL预冷NADP+/NADPH提取缓冲液；检测波长：450 nm；计算公式：NADPH/（NADP总量−NADPH）
2.6 分析方法
样品通过Shimadzu LC-20AB HPLC系统分析，配备SPD-40A紫外检测器。样品使用Thermo Fisher C18色谱柱（15 cm × 2.1 mm，2.7 μm）分离，工作温度40°C。流动相由两部分组成：流动相A（含0.1%甲酸的纯水）和流动相B（甲醇）的比例。流动相梯度设置如下：10%溶剂A保持7 min，7–7.5 min内10–30%溶剂A，7.5–18 min保持30%溶剂A，18–18.5 min内30–10%溶剂A，18.5–25 min保持10%溶剂A。CCMA含量按先前方案测定。木质素定量按先前研究进行。木质素的分子量分布通过凝胶渗透色谱（GPC）在生物转化前后表征。木质素连接键和羟基使用2D NMR和31P NMR分析。
【数据】HPLC系统：Shimadzu LC-20AB；检测器：SPD-40A紫外检测器；色谱柱：Thermo Fisher C18（15 cm × 2.1 mm，2.7 μm）；柱温：40°C；流动相A：含0.1%甲酸的纯水；流动相B：甲醇；梯度程序：10% A（0–7 min）→10–30% A（7–7.5 min）→30% A（7.5–18 min）→30–10% A（18–18.5 min）→10% A（18.5–25 min）
研究结果
3.1 S型木质素异源代谢途径的工程策略
S型芳香族化合物占多种木质素来源中木质素含量的50%以上。高效生物转化S型芳香族化合物对提高木质素整体利用效率至关重要。恶臭假单胞菌KT2440能有效代谢H型和G型木质素，但缺乏代谢S型木质素（如丁香酸，一种常见的木质素衍生S型芳香族化合物）的能力。丁香酸中两个甲氧基的存在使后续代谢所需的脱甲基步骤变得复杂。为评估S型木质素代谢能力，将野生型恶臭假单胞菌KT2440在1 mM至20 mM浓度范围的丁香酸中培养（图S1）。结果证实野生型恶臭假单胞菌KT2440不能代谢丁香酸，表明其缺乏丁香酸代谢途径。这归因于恶臭假单胞菌KT2440中缺乏针对丁香酸的特异性高效脱甲基酶，与先前研究一致。此外，野生型恶臭假单胞菌KT2440表现出极少的细胞生长，细胞密度无明显增加，进一步支持丁香酸未被利用的观察结果。因此，有必要对恶臭假单胞菌KT2440进行工程改造，使其获得S型木质素代谢能力，从而实现更高效的木质素利用（图1）。
天然酶VanAB是由末端加氧酶VanA和还原酶VanB组成的异源二聚体酶，能催化生物O-脱甲基反应。本研究成功在质粒和染色体上均表达了VanAB，这两种操作赋予了野生型恶臭假单胞菌KT2440代谢S型木质素的能力（图2）。vanAB基因由Ptac启动子驱动，在pBBR1MCS-2质粒中过表达，构建菌株SE001。同时，菌株SE005通过在fpvA和PP_4218位点之间插入由Ptac启动子驱动的vanAB基因组成型表达盒构建。菌株SE001和SE005分别在72 h和48 h内完全消耗10 mM丁香酸（图2B和F）。在丁香酸代谢过程中，积累了少量3-甲氧基没食子酸，未检测到没食子酸（图2C和G）。这些结果表明，SE001和SE005中Ptac启动子驱动的VanAB组成型表达显著促进了丁香酸的利用。结果显示脱甲基反应仍是丁香酸代谢的限速步骤。值得注意的是，与菌株SE001相比，携带染色体过表达VanAB的菌株SE005表现出更快的丁香酸消耗速率。菌株SE005的优异性能可能归因于消除了抗生素补充的影响。GalA负责裂解没食子酸（丁香酸衍生的中间代谢物），但可能被3-O-甲基没食子酸的积累在体外灭活。PcaHG也能在体外裂解没食子酸，但特异性仅为原儿茶酸的20%。为评估酶功能，在S型木质素代谢菌株SE001和SE005中单独或协同敲除PcaHG和GalA。首先在菌株SE001和SE005中失活PcaHG，分别获得菌株SE002和SE007。图2B和F显示菌株SE002和SE007仍表现出优异的丁香酸代谢能力，表明该工程策略未显著影响S型木质素代谢。此外，通过从菌株SE001和SE005中分别敲除galA基因构建菌株SE003和SE008。值得注意的是，菌株SE003和SE008仅消耗约20%的丁香酸，培养基中残留约8 mM丁香酸。结果证实galA基因在恶臭假单胞菌KT2440的S型木质素代谢中发挥重要作用。进一步地，通过同时敲除pcaHG和galA基因构建菌株SE004和SE0010。有趣的是，菌株SE004和SE0010的丁香酸消耗趋势与菌株SE003和SE008相似。这些结果表明恶臭假单胞菌KT2440中可能存在其他酶参与S型木质素代谢。图2C和G显示工程菌株在丁香酸消耗过程中积累的中间代谢物极少。因此，菌株SE001、SE002、SE005和SE007在以丁香酸为底物时表现出强劲生长。总体而言，VanAB的染色体过表达赋予恶臭假单胞菌KT2440增强的丁香酸代谢能力。结果凸显了galA基因在丁香酸代谢中的重要作用。这些工程策略改善了丁香酸消耗并促进了细胞生长，使工程化恶臭假单胞菌KT2440能够利用S型木质素作为碳源。
【数据】丁香酸浓度：1–20 mM（野生型评估）；10 mM（工程菌株测试）；消耗时间：SE001为72 h、SE005为48 h；中间代谢物：3-甲氧基没食子酸少量积累、没食子酸未检出；SE003/SE008丁香酸消耗量：约20%（残留约8 mM）；PcaHG对没食子酸特异性：仅为原儿茶酸的20%
3.2 对香豆酸和阿魏酸生产CCMA的工程策略
对香豆酸和阿魏酸通常可在恶臭假单胞菌KT2440中通过生物漏斗转化为原儿茶酸（图3和图4）。为提高CCMA产量，需要原儿茶酸脱羧酶将原儿茶酸转化为儿茶酚。因此，从阴沟肠杆菌中筛选出原儿茶酸脱羧酶（AroY），其表现出优异的催化活性。恶臭假单胞菌KT2440携带天然catA和catA2基因，可表达相关酶催化儿茶酚转化为CCMA。值得注意的是，catBC基因编码芳香环裂解途径中的CCMA环异构酶，该酶将导致CCMA的代谢。为积累CCMA，从菌株SE007（ΔpcaHG）中敲除catBC基因，构建菌株SE009。筛选的aroY基因在tac启动子驱动下于菌株SE009中组成型表达，将原儿茶酸转化为儿茶酚，构建菌株SE0011（图3A）。由于AroY是异戊烯化黄素单核苷酸（PrFMN）辅因子依赖性脱羧酶，协同共表达了辅助蛋白EcdB，该蛋白催化黄素单核苷酸（FMN）和二甲基烯丙基单磷酸（DMAP）转化为PrFMN。这种协同表达策略构建了菌株SE0013（图3A）。
使用这些工程菌株从木质素衍生H型芳香族化合物评估CCMA产量。工程菌株SE009、SE0011和SE0013在10 mM对香豆酸中培养。如图3D和G所示，菌株SE009、SE0011和SE0013在24 h内完全消耗10 mM对香豆酸，但只有携带原儿茶酸脱羧酶的菌株SE0011和SE0013成功产生目标产物CCMA。图3C显示了菌株SE0013在0 h和36 h发酵结果的HPLC图谱。值得注意的是，对香豆酸对应的峰消失，同时观察到CCMA的出现。发酵过程中检测到一些中间代谢物如原儿茶酸和4-羟基苯甲酸的积累，表明需要代谢调控策略。菌株SE0013中EcdB的协同表达旨在消除原儿茶酸的积累。36 h后，菌株SE009积累8.5 mM原儿茶酸和2.0 mM 4-羟基苯甲酸。菌株SE0011积累7.0 mM原儿茶酸而不积累4-羟基苯甲酸，而菌株SE0013产生0.5 mM原儿茶酸和2.2 mM 4-羟基苯甲酸（图3E和F）。结果，菌株SE0013产生7.4 mM CCMA，摩尔产率74%，是菌株SE0011的两倍，而菌株SE009不产生CCMA。这些结果表明pcaHG和catBC基因的失活以及AroY和EcdB的协同表达对实现对香豆酸向CCMA的高效转化至关重要。
【数据】底物：10 mM对香豆酸；消耗时间：24 h内完全消耗；SE009积累：8.5 mM原儿茶酸、2.0 mM 4-羟基苯甲酸；SE0011积累：7.0 mM原儿茶酸、无4-羟基苯甲酸；SE0013积累：0.5 mM原儿茶酸、2.2 mM 4-羟基苯甲酸；CCMA产量：SE0013为7.4 mM；摩尔产率：74%（SE0013）、为SE0011的两倍
3.3 三种木质素衍生芳香族化合物向CCMA的汇聚转化
在成功实现S型木质素代谢和H型木质素向CCMA转化的基础上，研究团队进一步评估了工程菌株SE0013同时利用三种类型木质素衍生芳香族化合物生产CCMA的能力（图5）。以5 mM对香豆酸、1 mM阿魏酸和0.5 mM丁香酸的初始浓度进行发酵，初始接种OD600为1.0。结果表明工程菌株SE0013能够同时消耗三种底物并产生CCMA，实现13.1 mM的CCMA产量和99.5%的摩尔产率。该结果证明了多底物汇聚生物转化策略的可行性。
【数据】初始浓度：5 mM对香豆酸、1 mM阿魏酸、0.5 mM丁香酸；初始OD600：1.0；CCMA产量：13.1 mM；摩尔产率：99.5%
3.4 辅因子工程策略提高CCMA产量
为进一步提高三种木质素衍生芳香族化合物向CCMA的转化效率，研究团队实施了辅因子工程策略（图6）。NADPH/NADP+辅因子比率和PobA依赖性辅因子对木质素衍生芳香族化合物的生物转化和CCMA生产具有重要调控作用。通过代谢调控这些辅因子，研究团队构建了一系列工程菌株，显著提高了CCMA产量。
【数据】辅因子工程策略：NADPH/NADP+比率调控、PobA依赖性辅因子调控
3.5 共投喂策略促进辅因子工程菌株的CCMA生产
研究团队进一步实施了共投喂策略，在辅因子工程菌株中促进CCMA生产（图7）。甘油代谢在促进天然PobA的NADPH生成中具有潜在机制。通过添加甘油作为辅助碳源，显著增加了NADPH的可用性，从而增强了木质素衍生芳香族化合物的生物转化和CCMA产量。该策略使CCMA产量提高至46.5 mM，摩尔产率达96.9%。
【数据】CCMA产量：46.5 mM；摩尔产率：96.9%；策略：共投喂甘油以增加NADPH可用性
3.6 工程菌株SE0026利用真实木质素水解液生产CCMA
研究团队最终评估了工程菌株SE0026利用真实木质素水解液生产CCMA的能力（图8）。在含5 mM对香豆酸的木质素培养基中进行批次发酵，监测对香豆酸、阿魏酸和丁香酸的消耗以及中间代谢物和产物积累。分子机制分析表明，设计的细胞工厂在裂解β-O-4连接键方面表现出优异的木质素解聚能力，并具有降解S型和G型木质素的潜力。在补料分批发酵模式下，菌株SE0026消耗了所有芳香族化合物和更多亲水性木质素分子，产生9.6 mM CCMA。
【数据】批次发酵：含5 mM对香豆酸的木质素培养基；补料分批发酵CCMA产量：9.6 mM；降解能力：β-O-4连接键裂解、S型和G型木质素降解
讨论与解读
本研究设计了一种有前景的恶臭假单胞菌KT2440细胞工厂，可高效地将所有类型木质素衍生芳香族化合物转化为CCMA。代谢途径工程使恶臭假单胞菌KT2440获得S型木质素代谢能力以及H型和G型木质素向CCMA的转化能力。该细胞工厂从三类木质素衍生芳香族化合物中生产13.1 mM CCMA，摩尔产率达99.5%。辅因子供应调控工程和共投喂策略进一步促进了三类木质素衍生芳香族化合物的CCMA生产。补料分批发酵在24 h内获得46.5 mM的CCMA滴度。菌株SE0026细胞工厂对真实木质素液流向CCMA的转化也表现出优异的转化能力。分子机制分析表明菌株SE0026具有β-O-4连接键以及S型和G型木质素的解聚能力，促进了木质素生物转化和CCMA生产。为进一步提高木质素生物转化为CCMA的可行性，仍需要开发有效的解聚方法以产生适合下游增值的木质素衍生物。此外，代谢工程和发酵策略对进一步提高木质素生产CCMA的生产率也是必要的。
编译者解读：该研究展示了合成生物学中"底物谱扩展+产物途径构建+辅因子优化"的系统性工程思路。值得关注的是，研究团队没有停留在模式底物验证层面，而是将工程菌株应用于真实木质素水解液，并通过分子机制分析证实了菌株对β-O-4键的实际裂解能力——这从应用端闭环了"木质素解聚-单体转化-产物积累"的全链条。从合成生物学角度看，VanAB的染色体整合表达优于质粒表达、GalA在S型木质素代谢中的关键角色等发现，为后续菌株优化提供了明确靶点。局限在于真实木质素体系中的CCMA产量（9.6 mM）仍显著低于模式底物（46.5 mM），木质素解聚效率与产物合成的匹配度尚有提升空间。
参考来源
期刊：Chemical Engineering Journal, 2024
DOI: 10.1016/j.cej.2024.153375
DOI: 10.1016/j.cej.2024.153375