来源：Metabolic engineering of Pseudomonas putida KT2440 for valorization of terephthalic acid to produce catechol and muconic acid（New Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
PET塑料的环境污染问题日益严峻，将PET解聚单体对苯二甲酸（TPA）生物升级转化为高值化学品，是替代传统回收的可持续路径。本研究以恶臭假单胞菌KT2440为底盘，通过引入TPA降解途径、系统筛选9种异源转运蛋白，成功突破TPA摄取瓶颈，实现了TPA向儿茶酚和粘康酸（MA）的高效转化。其中表达TpaK转运蛋白的工程菌株儿茶酚产量达8.51 mM（摩尔得率86.0%），MA产量达8.45 mM（摩尔得率93.1%）。补料分批发酵进一步验证了工艺可放大性，儿茶酚产量达15.04 mM。该平台为废弃PET的生物升级循环提供了可行方案。
研究背景
PET由TPA和乙二醇聚合而成，凭借优异的机械强度、化学稳定性和低成本，广泛用于饮料瓶、包装材料和纺织纤维。然而，废弃PET的不当管理导致其在陆地和海洋生态系统中大量累积，破碎形成的微塑料对生态环境和人体健康构成严重威胁。开环回收策略——将塑料废弃物转化为高值产品——被认为是缓解塑料污染危机、推动塑料循环经济的重要途径。其中，生物升级利用通过工程微生物将塑料衍生单体转化为增值产品，展现出环境友好优势。生物法PET回收的第一步是将PET解聚为TPA和EG单体，目前已发展出乙二醇解解、化学解聚等多种策略。本研究聚焦于将TPA这一关键单体通过工程菌转化为芳香族高值产品。
研究方法
2.1 质粒构建与菌株构建
本研究所用全部菌株和质粒列于表1。采用大肠杆菌XL1-Blue（Stratagene，美国加利福尼亚州拉荷亚）进行常规基因克隆，所有DNA操作均按标准程序进行。以恶臭假单胞菌KT2440及其突变株作为儿茶酚和MA生产的宿主菌。聚合酶链式反应使用T100热循环仪（Bio-Rad，美国）完成，引物由Bioneer（韩国大田）合成，列于表S1。
为构建TPA转运蛋白表达质粒，从相应基因组DNA中PCR扩增5个转运蛋白基因：来自恶臭假单胞菌的PP2040和PcaK、来自Comamonas sp. E6的TphCII-TpiBA、来自Acinetobacter baylyi ADP1的MucK及MucKmut，所用引物列于表S1。另外4个转运蛋白基因——来自Paraburkholderia sp. PGU19的PcaK2、来自Pseudomonas stutzeri的J4H94_21245、来自Amycolatopsis sp. DSM110486的K1T34_04620以及来自Rhodococcus opacus的TpaK——通过商业合成获得（Cosmogenetech，韩国首尔）。每个转运蛋白基因随后克隆至pSEVA234-MCS载体，受trc启动子驱动，生成一系列pSEVA234衍生质粒。
对于儿茶酚和MA生物合成途径的构建，将aroY、catA1和catA2基因依次组装至pSEVA631pt载体，同时将筛选出的转运蛋白（MucKmut或TpaK）克隆至pSEVA221pt载体，受tac启动子驱动。最终质粒通过电穿孔导入工程恶臭假单胞菌株，用于后续生物转化实验。所有DNA操作所用限制酶均购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州）。
恶臭假单胞菌KT2440的染色体基因修饰使用基于pK19mobsacB的质粒完成，该质粒在恶臭假单胞菌中带有非复制型复制起点。首先，PCR扩增靶基因上下游各500 bp同源片段，连接至pK19mobsacB的HindIII和EcoRI位点，构建染色体缺失质粒。其次，对于基因整合，将途径基因盒插入先前克隆至pK19mobsacB的两个同源臂之间，构建整合质粒。随后，所有基于pK19mobsacB的质粒通过接合转移导入恶臭假单胞菌KT2440，以大肠杆菌S-17-1作为供体菌。转接合子在含卡那霉素的LB琼脂平板上筛选。最后，通过SacB介导的蔗糖培养基反向筛选确认相应基因成功整合至染色体。
【数据】宿主菌：E. coli XL1-Blue（克隆）、P. putida KT2440及其突变株（表达）；抗生素：卡那霉素40 µg/mL、庆大霉素30 µg/mL；同源臂长度：500 bp；PCR仪器：T100 Thermal Cycler（Bio-Rad）；限制酶来源：New England Biolabs
2.2 培养条件
DNA操作使用Luria-Bertani（LB）培养基（含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）培养大肠杆菌XL1-Blue，根据质粒抗性标记向培养基中添加卡那霉素（Km，40 µg/mL）和庆大霉素（Gm，30 µg/mL）。
采用化学成分确定的MR培养基，以TPA和甘油作为重组恶臭假单胞菌KT2440菌株的碳源。MR培养基（pH 7.0）每升含：6.67 g KH₂PO₄、4 g (NH₄)₂HPO₄、0.8 g MgSO₄·7H₂O、0.8 g柠檬酸和5 mL微量元素溶液。微量元素溶液每升含：10 g FeSO₄·7H₂O、2 g CaCl₂、2.2 g ZnSO₄·7H₂O、0.5 g MnSO₄·4H₂O、1 g CuSO₄·5H₂O、0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.02 g Na₂B₄O₇·10H₂O和0.5 M HCl。甘油和MgSO₄·7H₂O溶液分别单独灭菌。
TPA储备液的制备：商品化TPA二钠盐和PET衍生TPA分别制备储备液，各自溶于蒸馏水中，温和加热（50–60 °C）并搅拌至完全溶解。PET衍生TPA按照先前报道的方法从消费后PET饮料杯中制备。溶解后将各溶液pH调至7.0，经0.22 µm膜过滤器无菌过滤。所得TPA溶液用于后续摇瓶和补料分批发酵实验。
恶臭假单胞菌菌株种子培养在含10 mL LB培养基的50 mL圆底管中进行，于30 °C、230 rpm旋转摇床过夜培养。随后，将1 mL过夜种子培养液接种至含100 mL MR培养基的250 mL带挡板摇瓶中，于30 °C、250 rpm培养96 h。培养基中添加甘油、TPA及适量抗生素（卡那霉素和庆大霉素）。所有摇瓶培养均设三次重复。
补料分批发酵在5 L搅拌式生物反应器（BioCNS，韩国）中进行，含2 L MR培养基，温度30 °C。搅拌初始设定为500 rpm，随后调整以维持溶解氧（DO）水平在40%空气饱和度以上。通过自动添加5.6%（v/v）氨水控制培养pH为7.0。按需使用聚丙二醇（Sigma-Aldrich，美国）作为消泡剂。整个发酵过程中培养基内持续添加适量抗生素。接种后培养至OD₆₀₀约3–4，此时残余甘油浓度降至3–5 g/L。在此阶段，以5 mM TPA的初始脉冲开始TPA补料。该补料策略旨在确保底物转化前积累足够生物量，并尽量减少TPA在培养早期的潜在抑制作用。发酵期间使用两种补料溶液：补料溶液A每升含200 g甘油、4 g MgSO₄·7H₂O、40 mg卡那霉素和30 mg庆大霉素；补料溶液B含400 mM TPA。甘油间歇补加以维持培养基中甘油浓度高于10 g/L。基于定期取样和离线HPLC分析，每当残余TPA浓度接近2 mM时，以5 mM增量补加TPA。这些补料策略确保培养过程中不出现底物耗尽或抑制性浓度峰值。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；MR培养基pH：7.0；微量元素液含FeSO₄·7H₂O 10 g/L等；TPA溶解温度：50–60 °C；过滤膜孔径：0.22 µm；种子培养：30 °C、230 rpm、过夜；摇瓶培养：30 °C、250 rpm、96 h；发酵罐：5 L（2 L工作体积）、30 °C、初始搅拌500 rpm、DO>40%、pH 7.0（5.6%氨水控制）；补料A：200 g/L甘油+4 g/L MgSO₄·7H₂O+40 mg/L卡那霉素+30 mg/L庆大霉素；补料B：400 mM TPA；甘油维持>10 g/L；TPA按5 mM增量补加
2.3 分析方法
细胞生长通过UV-1800分光光度计（Shimadzu，日本）测定600 nm处吸光度（OD₆₀₀）监测。TPA及其转化产物采用高效液相色谱（HPLC；Agilent 1100，Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）分析，配备可变波长检测器（VWD）和C18色谱柱（Rstech，韩国大田），柱温30 °C，流速1.0 mL/min。流动相（A）为乙腈与0.1%三氟乙酸（v/v）的混合液，（B）为水与0.1%三氟乙酸（v/v）的混合液（A:B=1:9）。进样量1 μL，紫外检测波长254 nm。甘油浓度采用配备示差折光检测器（RID）和Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad）的HPLC测定，柱温50 °C，流动相为5 mM H₂SO₄，流速0.8 mL/min。
【数据】OD₆₀₀测定：UV-1800分光光度计；HPLC：Agilent 1100，C18柱，30 °C，1.0 mL/min，A:B=1:9（乙腈:水，均含0.1%三氟乙酸），进样1 μL，检测254 nm；甘油HPLC：Aminex HPX-87H柱，50 °C，5 mM H₂SO₄，0.8 mL/min
研究结果
3.1 恶臭假单胞菌KT2440的TPA分解代谢工程改造
在Comamonas sp. E6中，TPA分解代谢由tph操纵子介导，该操纵子编码多组分TPA 1,2-双加氧酶（tphAabc）及相应的脱氢酶（tphB）。这些酶共同将TPA转化为PCA。基于上述发现，将tphAabc和tphB基因通过染色体整合（删除endA基因）引入恶臭假单胞菌KT2440，以赋予其TPA同化能力。同时，在染色体中删除编码PCA 3,4-双加氧酶的pcaHG基因，以防止PCA降解，确保其作为下游代谢增值的关键中间产物。
为检测工程恶臭假单胞菌菌株的TPA利用能力，在含5 mM TPA和10 g/L甘油的MR培养基中于30 °C进行96 h摇瓶培养。如图1所示，野生型菌株仅消耗0.42 mM TPA，表明其天然代谢能力不足以有效同化TPA。与这种有限的摄取一致，野生型菌株中未检测到PCA产生。相比之下，携带TPA降解途径（tphAabc和tphB基因）并删除pcaHG的工程菌株（恶臭假单胞菌PCA）在相同培养条件下消耗了2.49 mM TPA并产生0.43 mM PCA（图1）。
这些结果表明，tphBAabc的引入使TPA分解代谢得以实现，而pcaHG的删除是确保PCA作为代谢中间产物积累所必需的。尽管如此，TPA消耗的总体水平仍然有限，提示需要进一步在底物摄取方面实施代谢工程策略——特别是通过引入高亲和力TPA转运蛋白——以在恶臭假单胞菌中建立高效的TPA同化途径。
【数据】野生型：TPA消耗0.42 mM，PCA产量未检出；工程菌PCA：TPA消耗2.49 mM，PCA产量0.43 mM；培养条件：5 mM TPA+10 g/L甘油，30 °C，96 h
3.2 TPA摄取转运蛋白的筛选
虽然途径工程通过引入tphBAabc操纵子和染色体缺失pcaHG改善了恶臭假单胞菌的TPA同化，但整体TPA摄取能力仍显不足，导致下游增值转化的胞内PCA库有限。为增强TPA利用并提高前体供应，我们探索了异源TPA转运蛋白能否进一步改善恶臭假单胞菌的TPA摄取。从多种微生物中选取9个潜在TPA转运蛋白，检验其增强恶臭假单胞菌TPA摄取的能力。
5个先前报道的转运蛋白——来自恶臭假单胞菌的PP2040和PcaK、来自Comamonas sp. E6的TphcII-TpiBA、来自Acinetobacter baylyi ADP1的MucK及其工程变体MucK M34L T342I（MucKmut）——基于早期研究提示其参与TPA摄取而被纳入。另外4个推定候选转运蛋白——来自Paraburkholderia sp. PGU19的PcaK2、来自Pseudomonas stutzeri的J4H94_21245、来自Amycolatopsis sp. DSM110486的K1T34_04620以及来自Rhodococcus opacus的TpaK——以已知TPA转运蛋白为查询序列，通过BLAST进一步筛选获得。每个基因克隆至pSEVA234-MCS质粒，并分别导入恶臭假单胞菌PCA以评估其TPA转运活性。本研究所用转运蛋白列于表S1。
为评估所引入转运蛋白的性能，9个重组菌株（恶臭假单胞菌PCA-01至PCA-09）在含5 mM TPA和10 g/L甘油的MR培养基中于30 °C培养96 h。转运蛋白筛选的初始TPA浓度设定为5 mM，基于恶臭假单胞菌PCA菌株的初步实验——该菌在此条件下消耗约2.49 mM TPA。该浓度可在途径评估早期可靠监测TPA摄取和PCA形成。
9个重组菌株间TPA消耗呈现显著差异（图2）。对照菌株恶臭假单胞菌PCA消耗2.49 mM TPA并产生0.43 mM PCA；在表达转运蛋白的菌株中，恶臭假单胞菌PCA-01至PCA-03分别消耗2.91、1.49和1.91 mM TPA，PCA产量分别为0.22、0.13和0.16 mM。同样，恶臭假单胞菌PCA-06至PCA-08表现出相对较低的TPA利用，分别消耗2.25、0.82和2.17 mM TPA，相应PCA产量为0.18、0.04和0.29 mM。
相比之下，恶臭假单胞菌PCA-04和PCA-05表现出显著增强的TPA摄取。PCA-04菌株消耗3.92 mM TPA并产生0.69 mM PCA，而恶臭假单胞菌PCA-05完全利用了所供TPA——消耗5.30 mM并产生0.72 mM PCA。恶臭假单胞菌PCA-09表现出可比的性能，同样实现完全TPA消耗（5.33 mM），并达到最高PCA产量1.11 mM。
为进一步评估初筛中表现最优的转运蛋白能否在更高底物浓度下维持其增强活性，选取3个转运蛋白——MucK、MucKmut和TpaK——进行额外评估。摇瓶培养在含10 mM TPA和10 g/L甘油的MR培养基中于30 °C进行96 h。在此条件下，恶臭假单胞菌PCA-04菌株消耗3.85 mM TPA并产生0.77 mM PCA，而恶臭假单胞菌PCA-05菌株消耗7.74 mM TPA，PCA产量1.77 mM。恶臭假单胞菌PCA-09菌株表现出最高活性，消耗8.24 mM TPA并产生1.81 mM PCA（图3）。
这些结果再次证实，MucKmut和TpaK在较高TPA浓度下表现出优越的转运活性，是增强TPA摄取和前体（PCA）形成的最有效转运蛋白。据此，MucKmut和TpaK被选为后续生物合成的最佳转运蛋白。更广泛而言，底物摄取效率低下往往是芳香族化合物微生物转化的主要瓶颈。因此，如本研究所展示的系统性转运蛋白筛选与工程改造，可能代表一种可广泛应用的策略，用于增强恶臭假单胞菌及相关微生物宿主对其他芳香族底物的同化。
【数据】5 mM TPA筛选：对照PCA消耗2.49 mM/产PCA 0.43 mM；PCA-01至03消耗2.91/1.49/1.91 mM（PCA 0.22/0.13/0.16 mM）；PCA-06至08消耗2.25/0.82/2.17 mM（PCA 0.18/0.04/0.29 mM）；PCA-04消耗3.92 mM/产0.69 mM；PCA-05消耗5.30 mM/产0.72 mM；PCA-09消耗5.33 mM/产1.11 mM。10 mM TPA验证：PCA-04消耗3.85 mM/产0.77 mM；PCA-05消耗7.74 mM/产1.77 mM；PCA-09消耗8.24 mM/产1.81 mM。培养条件：30 °C、96 h、10 g/L甘油
3.3 合成及消费后PET衍生TPA向儿茶酚的多功能生物转化
在通过转运蛋白引入实现增强TPA摄取的基础上，我们进一步验证该平台在生产增值芳香族化学品方面的适用性。作为首个概念验证，选择儿茶酚作为代表性产品，利用所开发的具有改善TPA同化能力的工程恶臭假单胞菌菌株建立生物漏斗策略。为此，引入两个最有效的转运蛋白MucKmut和TpaK，并在恶臭假单胞菌PCA中构建儿茶酚生物合成途径。儿茶酚生产途径通过质粒表达阴沟肠杆菌aroY基因实现——该基因介导PCA脱羧生成儿茶酚——同时在恶臭假单胞菌PCA染色体中删除天然catA1和catA2基因以防止儿茶酚降解（图4，恶臭假单胞菌CA）。
当恶臭假单胞菌CA在含10 mM TPA和10 g/L甘油的MR培养基中于30 °C培养96 h时，表达mucKmut的菌株（恶臭假单胞菌CA-01）消耗5.93 mM TPA并产生5.32 mM儿茶酚，基于消耗TPA的摩尔转化率为89.9%。相比之下，表达tpaK的菌株（恶臭假单胞菌CA-02）完全消耗了所供TPA（9.89 mM）并产生8.51 mM儿茶酚，摩尔得率86.0%，展现出显著改善的底物利用能力和目标产物形成能力（图5）。
这些结果表明，将高亲和力TPA转运蛋白与儿茶酚生物合成模块偶联可显著提高TPA向儿茶酚的转化效率，其中TpaK转运蛋白展现出更优越的性能。为进一步评估该系统实际应用的可行性，我们检验了从消费后PET中获得的TPA能否作为可行的底物……
【数据】CA-01（MucKmut）：TPA消耗5.93 mM，儿茶酚5.32 mM，摩尔转化率89.9%；CA-02（TpaK）：TPA消耗9.89 mM（完全消耗），儿茶酚8.51 mM，摩尔得率86.0%；培养条件：10 mM TPA+10 g/L甘油，30 °C，96 h
3.4 通过途径延伸实现粘康酸生产
（此处原文节选未完整提供3.4节内容，但图6显示MA生产菌株的比较。根据摘要信息：通过质粒表达aroY、catA1和catA2，并在染色体中删除catB和catC，实现了高效的MA生产，达到8.45 mM MA，摩尔得率93.1%。）
【数据】MA产量：8.45 mM；摩尔得率：93.1%
3.5 补料分批发酵验证工艺可放大性
补料分批发酵在5 L搅拌式生物反应器中进行，验证了工艺的可放大性。根据摘要信息：从16.76 mM TPA获得15.04 mM儿茶酚。图7显示了补料分批发酵过程中细胞生长、底物浓度和儿茶酚产量的时间曲线。
【数据】补料分批发酵：儿茶酚15.04 mM；TPA 16.76 mM；发酵罐5 L（2 L工作体积），30 °C，pH 7.0，DO>40%
讨论与解读
本研究在恶臭假单胞菌KT2440中建立了模块化生物转化平台，实现TPA向增值芳香族化学品的高效转化。异源tphBAbac基因的引入结合染色体pcaHG缺失使TPA转化为PCA成为可能，而系统性TPA转运蛋白筛选确定MucKmut和TpaK是克服TPA摄取固有局限的关键决定因素。这些转运蛋白的整合使儿茶酚和MA的下游高效生物合成得以实现。特别是表达tpaK的菌株实现了TPA完全消耗，产生8.51 mM儿茶酚（摩尔得率86.0%），而途径延伸至MA后获得8.45 mM MA（摩尔得率93.1%）。重要的是，当使用PET衍生TPA作为底物时，转化效率同样保持，证明了工程菌株对废弃物衍生原料的稳健性。补料分批发酵在受控生物反应器条件下从16.76 mM TPA获得15.04 mM儿茶酚，验证了平台的可放大性。总体而言，本研究凸显了转运蛋白工程作为增强TPA同化的关键策略，并证明将优化摄取系统与模块化代谢途径偶联可实现可规模化且废弃物兼容的PET升级循环。
编译者解读
本研究的一个突出亮点是将底物摄取瓶颈作为独立工程模块进行系统优化——9种转运蛋白的筛选策略思路清晰，MucKmut和TpaK的脱颖而出也提示芳香族转运蛋白的底物谱比预期更宽。从PCA到儿茶酚再到MA的模块化路径设计使平台具有较好的产品灵活性，PET解聚物的实际利用验证则打通了"废弃物-单体-产品"的完整链条。补料分批发酵中16.76 mM TPA获得15.04 mM儿茶酚的转化效率令人鼓舞。值得关注的是，儿茶酚对菌株的毒性问题在本文中着墨不多，未来若向工业化推进，原位产物移除或耐受性进化可能是值得探索的方向。整体而言，该工作为芳香族单体的生物升级提供了可借鉴的范式。
参考来源
Lee ES. Metabolic engineering of Pseudomonas putida KT2440 for valorization of terephthalic acid to produce catechol and muconic acid. New Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.nbt.2026.03.009
DOI: 10.1016/j.nbt.2026.03.009