连二亚硫酸盐支持的重组烯酸还原酶冻干全细胞催化粘康酸生物加氢

来源：Dithionite-supported biohydrogenation of muconic acid to adipic acid by lyophilized Escherichia coli cells expressing recombinant enoate reductase（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

己二酸是年产量超260万吨的大宗化工原料，传统石油路线排放大量温室气体。本研究揭示来自凝结芽孢杆菌（Heyndrickxia coagulans）的全长烯酸还原酶ERBC能以连二亚硫酸盐（DT）替代昂贵的NAD(P)H作为电子供体，还原三种粘康酸异构体生成己二酸。更关键的是，研究者构建了表达ERBC的冻干大肠杆菌全细胞催化体系，DT同时充当还原剂和除氧剂，免去了蛋白纯化与外源辅因子添加，为生物基己二酸的绿色生产提供了全新方案。

研究背景

己二酸是重要的六碳二元酸，广泛用于聚合物（尼龙）、食品、制药和化妆品行业，全球年产量超过260万吨，并以每年3–5%的速度增长。当前工业制造依赖石油基苯经环己烷路线，该过程能耗高、分离成本大，并伴随大量一氧化二氮排放。为应对气候变化与石油资源枯竭的挑战，研究者正积极开发生物基己二酸的可持续合成路线，主要包括三条途径：生物质衍生葡萄糖的化学催化转化、发酵与化学催化结合的化学-生物转化、以及利用工程菌株直接发酵。其中，以木质素等可再生原料生产粘康酸，再经化学催化或酶法还原制备己二酸，是一条颇具前景的半合成路线。2-烯酸还原酶（ERs）能在厌氧条件下以NADH或NADPH为电子供体还原粘康酸，但天然辅因子的高成本限制了其工业化应用。寻找替代电子供体并简化催化体系，是该领域的关键突破口。

研究方法

2.1 实验材料

己二酸、顺,顺-粘康酸（ccMA）、反,反-粘康酸（ttMA）、反-肉桂酸、氢化肉桂酸（苯丙酸）及其他底物和化学品均为最高纯度（分析级），购自Sigma/Aldrich/Merck（加拿大安大略省奥克维尔）。2-己烯二酸（2HDA，98%，顺式和反式异构体混合物）由BOC Sciences（美国纽约州雪莉）合成。顺,反-粘康酸按Amyris专利（EP 2 521 770 B1）所述方法，将顺,顺-粘康酸在90°C预热2小时获得。[4Fe-4S]-铁氧还蛋白（来自激烈火球菌，PDB 4DHV）购自Kerafast（货号# EGA302），马心细胞色素C购自Merck（Sigma-Aldrich，货号# C7752）。

【数据】ccMA：分析级；ttMA：分析级；2HDA：98%（顺/反异构体混合物）；顺,反-粘康酸制备条件：90°C、2h

2.2 基因克隆与蛋白表达

来自凝结芽孢杆菌（Heyndrickxia，原Bacillus coagulans）的全长烯酸还原酶ERBC（Uniprot G2TQU6，1–663 aa）及其截短变体ERBC366（1–366 aa，在Cys366处插入终止密码子），以及来自解淀粉芽孢杆菌的OYE家族酶YqjM（Uniprot I2C7G1，1–338 aa）的编码序列，被克隆至p15TVL载体，在大肠杆菌BL21(DE3) LOBSTR表达菌株中实现N端6His标签重组表达。同样，大肠杆菌FldA（P61949）、FldB（P0ABY4）、谷氧还蛋白GrxA（P68688）、硫氧还蛋白TrxA（P0AA25）、铁氧还蛋白Fdx（2Fe-2S，P0A9R4），以及凝结芽孢杆菌电子转移黄素蛋白Bcoa_2579（G2TKQ8）和Bcoa_2580（G2TKQ9）的编码序列，由Twist Bioscience（南旧金山）合成并克隆至p15TVL载体，在大肠杆菌中重组表达。

好氧条件下的标准蛋白表达：大肠杆菌在含合适抗生素和甘油（4 g/L）的1 L TB培养基（2.5 L挡板摇瓶）中，37°C、200 rpm振荡好氧培养至OD600 0.8–1.0，随后加入IPTG（0.4 mM）诱导，16°C、200 rpm振荡过夜表达。厌氧蛋白表达：IPTG加入后，培养物转移至1 L密闭摇瓶（含磁力搅拌子），补充DMSO（1 ml/L）作为末端电子受体，室温过夜孵育。为研究空气暴露对ERBC表达和活性的影响，IPTG诱导后培养物先在室温、200 rpm振荡好氧孵育指定时间，再转入含DMSO的密闭摇瓶进行厌氧孵育。蛋白表达完成后，大肠杆菌细胞经离心（5000 g）收集，菌体沉淀用液氮冷冻后于−80°C保存，或直接用于蛋白纯化。

【数据】TB培养基：1 L；甘油：4 g/L；IPTG：0.4 mM；好氧表达：37°C、200 rpm、OD600 0.8–1.0、16°C过夜；厌氧表达：DMSO 1 ml/L、室温过夜；离心：5000 g；保存：−80°C

2.3 重组蛋白纯化

ERBC纯化在厌氧手套箱（Coy Laboratory Products，美国密歇根州Grass Lake）中进行，气氛组成为80% N₂、10% H₂、10% CO₂。所有缓冲液使用前均经脱气并用氩气吹扫。菌体沉淀重悬于裂解缓冲液：5 mM咪唑、0.4 M NaCl、50 mM HEPES-K缓冲液（pH 7.5）、5%甘油、0.05% Tween-20、1 mg/ml溶菌酶、3 U/ml苯甲酸酶、0.5 mM EDTA和1 mM DTT，室温孵育30 min。细胞裂解液经离心（40,000 g）澄清，上清液与Ni亲和树脂（Qiagen，美国加州Valencia）在4°C孵育1 h。随后用100 ml洗涤缓冲液（30 mM咪唑、0.4 M NaCl、50 mM HEPES-K缓冲液，pH 7.5，5%甘油）洗涤树脂，结合蛋白用洗脱缓冲液（250 mM咪唑、0.4 M NaCl、50 mM HEPES-K缓冲液，pH 7.5，5%甘油）洗脱。所有其他蛋白（ERBC366、YqjM、Fd）均在有氧条件下使用相同方案和缓冲液纯化。纯化的截短ERBC（ERBC366）与全长ERBC相比黄素水平降低，需进一步重构：将ERBC366（3.5 mg/ml，4°C）与0.1 mM FMN在洗脱缓冲液（250 mM咪唑、0.4 M NaCl、5%甘油、50 mM HEPES-K缓冲液，pH 7.4）中过夜孵育，然后用10 kDa截留分子量的离心柱洗去未结合的FMN。纯化蛋白用离心浓缩器浓缩，液氮保存。蛋白浓度用Bradford试剂（Bio-Rad）测定，蛋白纯度用10%凝胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）评估。

【数据】厌氧气氛：80% N₂/10% H₂/10% CO₂；裂解缓冲液：5 mM咪唑、0.4 M NaCl、50 mM HEPES-K（pH 7.5）、5%甘油、0.05% Tween-20、1 mg/ml溶菌酶、3 U/ml苯甲酸酶、0.5 mM EDTA、1 mM DTT；裂解孵育：室温30 min；离心：40,000 g；Ni树脂孵育：4°C、1h；洗涤：100 ml（30 mM咪唑）；洗脱：250 mM咪唑；ERBC366重构：3.5 mg/ml、0.1 mM FMN、4°C过夜

2.4 烯酸还原酶活性与底物转化测定

纯化蛋白和冻干ERBC细胞的烯酸还原酶活性，通过分光光度法或HPLC法在96孔板或密闭HPLC小瓶中测定，反应在厌氧手套箱中30°C孵育（30–120 min或过夜）。缓冲液和试剂使用前均脱气并用氩气吹扫。反应混合物含100 mM HEPES-K（pH 6.0–7.0）、指定电子供体（NADH、NADPH或连二亚硫酸钠，0.5 mM至0.2 M）、底物（10 mM至0.1 M）和蛋白（0.1–50 μg），终体积200或400 μL。使用前，酸性底物（肉桂酸和粘康酸）储备液通过加入少量NaOH中和至pH 7.0。反应通过监测340 nm处NAD(P)H氧化为NAD(P)⁺引起的吸光度下降，或通过HPLC定量反应产物（2-己烯二酸和己二酸，单独或两者总和）来跟踪。冻干大肠杆菌生物质中重组ERBC的含量估计为每mg干生物质含4 μg蛋白（基于亲和纯化过程中的ERBC回收率）。动力学参数（K_m和V_max）的非线性回归分析使用Prism软件（5.02版；GraphPad Software，美国加州圣地亚哥）进行，方法如前所述[29]。

底物转化率测定：酶反应在1.5 ml带橡胶塞的HPLC小瓶中进行。反应混合物（200–400 μL，脱气并用氩气吹扫）含100 mM HEPES-K（pH 6.0或7.0）、还原剂（NADH、NADPH或DT，按指定浓度）、底物（按指定浓度）和纯化ERBC（3–50 μg）或冻干ERBC细胞（6 mg干生物质）。试管在30°C孵育。30°C过夜（12 h）孵育后，反应混合物经膜过滤器（10 kDa截留）离心澄清，用HPLC或LC-MS分析（如下所述）。

【数据】反应温度：30°C；时间：30–120 min或过夜（12h）；HEPES-K：100 mM（pH 6.0–7.0）；电子供体：0.5 mM–0.2 M；底物：10 mM–0.1 M；蛋白量：0.1–50 μg；反应体积：200或400 μL；ERBC含量：4 μg/mg干生物质

2.5 反应产物的HPLC和LC-MS分析

反应样品和标准品经膜过滤器（10 kDa截留）离心过滤澄清，滤液用配备Aminex HPX-87H色谱柱（300×7.8 mm）（Bio-Rad Laboratories Inc.，美国加州Hercules）的Varian ProStar HPLC系统（Varian Medical Systems，美国加州Palo Alto）分析ccMA、2HDA、己二酸、反-肉桂酸和氢化肉桂酸，同时配备UV（210 nm）和RI检测器。样品用5 mM H₂SO₄洗脱（0.6 ml/min，50°C），底物和产物浓度通过峰面积的线性回归确定。反-肉桂酸和氢化肉桂酸使用Pursuit 5 C18色谱柱（150×4.6 mm）分析，UV检测波长254 nm。样品用含0.1% H₃PO₄（溶剂A）和100%甲醇（溶剂B）的溶剂梯度洗脱。梯度程序：0 min，10% B；10 min，10% B；25 min，44% B；35 min，10% B；然后用10% B平衡5 min。反应样品中己二酸的存在也用LC-MS分析，使用Dionex Ultimate 3000 UHPLC系统和配备HESI源及Hypersil Gold C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.9 µm粒径，Thermo Scientific，美国马萨诸塞州Waltham）的Q-Exactive质谱仪。溶剂A为含0.1%甲酸的水，溶剂B为乙腈。

【数据】HPLC柱：Aminex HPX-87H（300×7.8 mm）；洗脱液：5 mM H₂SO₄；流速：0.6 ml/min；柱温：50°C；UV检测：210 nm；C18柱：Pursuit 5 C18（150×4.6 mm），254 nm；LC-MS柱：Hypersil Gold C18（50×2.1 mm，1.9 µm）；溶剂A：0.1%甲酸水；溶剂B：乙腈

研究结果

3.1 2-烯酸还原酶的域结构与辅因子相互作用分析

根据InterPro/Uniprot数据库，ERBC和其他ERs是包含620–730个氨基酸残基的多域蛋白，排列成两个结构域：N端NADH：黄素氧化还原酶/NADH氧化酶结构域（约350 aa，PF00724）和C端吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶结构域（约300 aa，PF07992）（图2A）。基于序列分析，大肠杆菌2,4-二烯酰-CoA还原酶（DCR，Uniprot P42593）和宏基因组2-萘甲酰-CoA还原酶（NCR，Uniprot E1YD54）也预测了相似的结构域架构，这两种酶催化CoA活化有机酸（分别为2,4-二烯酰-CoA和2-萘甲酰-CoA）中C=C键的还原。然而，DCR和NCR的晶体结构（PDB 1PS9、6QKG、6QKR）显示存在三个结构域：大域、中域和小域[26,27]。大N端结构域（最多400个残基）具有TIM桶折叠（OYE样），结合一个FMN；中域（FAD）由中央和C端片段（共140–160个残基）形成，小域（120–160个残基）插入其间（图2A）。此外，[4Fe-4S]簇由四个配位半胱氨酸配位，位于大域（FMN）和中域（FAD）之间的连接区（20–30个残基）[26,27]。

由于ERs尚无公开的晶体结构，研究者使用Google Colab中的AlphaFold2生成了ERBC的结构模型，包括基于DCR结构（PDB代码1PS9）建模的氧化还原辅因子（FMN、FAD、NADP⁺和[4Fe-4S]簇）（图2B）。如图2B所示，ERBC的大N端结构域（灰色丝带）容纳FMN辅因子，FMN埋藏于底物结合口袋底部，底物预计在FMN si面正上方及附近结合。与DCR类似，FMN异咯嗪环的re面靠近保守Met26的侧链，而其si面朝向保守His177、Tyr180、Tyr280、Trp283和Met371的侧链（图S1）。此外，异咯嗪环靠近Gln107、His174、Glu178和His287的侧链，而FMN磷酸核糖基尾部与Arg228、Arg317和Arg340形成氢键（图S1）。距FMN异咯嗪环5.5–6.2 Å处还有一个[4Fe-4S]簇，由四个保守Cys残基（Cys363、Cys366、Cys370和Cys382）的侧链配位，这些残基属于连接ERBC大域与中域（浅青色丝带，结合FAD辅因子）的长柔性连接区的一部分（图2B）。与FMN类似，FAD和NADP⁺辅因子分别占据ERBC中域和小域内空间上保守的位置，FAD被良好埋藏，靠近Glu432、Lys433、Asn440、Lys450、Asp642、Asn648及若干主链酰胺基团。NADP⁺的烟酰胺碱基被置于FAD异咯嗪环附近，由Glu553、Asn569和Asn648的侧链及若干主链酰胺基团配位。

总体而言，该ERBC结构模型与该酶最近报道的结构模型高度相似，唯一例外是NAD(P)H结合域——在后者模型中该结构域位于C端（aa 525–663）[45]。然而，同源2-烯酸还原酶DCR的晶体结构[27]证明，NAD(P)H结合域（aa 468–625）插入中域（FAD结合域，aa 369–467和626–671）内部，正如我们的ERBC结构模型所示（分别为aa 499–619和394–498及620–663）（图2）。基于DCR晶体结构，ERs中的电子流预期从电子源NAD(P)H流向FAD，再到[4Fe-4S]簇，最后到达FMN[27]。由于ERBC结构模型显示结合的辅因子之间距离相似（均低于提出的电子隧穿极限14 Å[27]），ERBC可提出相同的电子传递路径。此外，OYEs与ERBC大域之间的高度结构相似性（两者均具有TIM桶折叠）提示后者可能潜在结合还原型NAD(P)H辅因子并直接用于FMN还原和底物转化。为探索这一可能性，研究者克隆了一个截短ERBC变体（ERBC366），在Cys366处插入终止密码子，该变体仅含大（FMN结合）结构域，不含中域、小域和[4Fe-4S]簇。

【数据】ERBC长度：1–663 aa；结构域：N端NADH氧化还原酶域（~350 aa）、C端吡啶核苷酸二硫化物氧化还原酶域（~300 aa）；[4Fe-4S]簇与FMN距离：5.5–6.2 Å；电子隧穿极限：14 Å

3.2 纯化ERBC在不同电子供体下的烯酸还原酶活性

前期研究表明，纯化的细菌ERs能以NADH为电子供体还原多种非活化的α,β-不饱和羧酸（烯酸酯），包括反-肉桂酸[29,46]。此外，来自酪丁酸梭菌的纯化ER的Fe-S簇和来自未培养脱硫杆菌属的2-萘甲酰-CoA还原酶（NCR）的三种辅因子（FAD、[4Fe-4S]和FMN）可被连二亚硫酸盐（DT）还原，且DT还原的NCR能催化底物氢化[20,26]。NCR的分步氧化还原滴定显示FAD（还原为FAD半醌）和[4Fe-4S]簇（从2+到1+）的协同还原，而FMN保持完全氧化状态，在进一步滴定后才被还原[26]。此外，NCR也能接受连二亚硫酸盐还原的甲基紫精作为人工电子供体，而低电位铁氧还蛋白（或氧化还原酶的铁氧还蛋白结构域）被提出作为这些酶的天然电子供体[26,47]。在OYEs中，FMN辅因子也可被DT还原，其烯烃还原活性可由电化学还原的甲基紫精或烟酰胺辅因子模拟物支持[48–50]。然而，纯化细菌ERs在NAD(P)H以外的电子供体下的烯酸还原酶活性此前尚未被研究。

在本研究中，ERBC的全长（1–663 aa）和截短（1–366 aa）变体，以及来自解淀粉芽孢杆菌的OYE YqjM，在大肠杆菌细胞中于好氧和厌氧条件下重组表达，亲和纯化的蛋白用不同电子供体分析还原情况。此前，粘康酸到己二酸的电催化加氢已使用过渡金属催化剂在−0.57至−1.72 V电位下实现[51]。本研究使用化学还原剂如连二亚硫酸钠（DT，Na₂S₂O₄，−660 mV）、硫化钠（Na₂S，−570 mV）、亚硫酸钠（Na₂SO₃，−600 mV）、Ti(III)-柠檬酸盐（−480 mV）和焦亚硫酸钠（Na₂S₂O₅，−170 mV）还原纯化ERBC。在生化研究中，这些化学品常被用作还原剂，为不同过程和酶提供电子，并促进酶溶液中的氧气去除[35–37]。

与先前细菌ERs研究类似[20,29]，纯化的氧化态ERBC在溶液中呈黄色，其吸收光谱在450 nm处显示突出的黄素样峰，480 nm处有肩峰（图3A）。加入过量DT（100 mM）导致ERBC完全还原，表现为450 nm处吸光度完全消失；而加入Ti(III)-柠檬酸盐仅导致ERBC部分还原（图3A）。亚硫酸钠（Na₂SO₃）和焦亚硫酸钠（Na₂S₂O₅）对ERBC吸收光谱影响很小，而硫化钠（Na₂S）增加了440–450 nm处的吸光度并产生两个新峰：540 nm处的小峰和640 nm处的显著峰（图S2A）。向来自伍氏醋酸杆菌的纯化[4Fe-4S]-铁氧还蛋白加入硫化钠后也观察到类似峰（440 nm、540 nm和640 nm）（图S2B）。这些结果表明硫化物诱导的光谱变化并非由ERBC的还原引起，而可能是由铁氧还蛋白样[4Fe-4S]簇的化学修饰所致。

【数据】DT还原电位：−660 mV；Na₂S：−570 mV；Na₂SO₃：−600 mV；Ti(III)-柠檬酸盐：−480 mV；Na₂S₂O₅：−170 mV；DT浓度：100 mM；吸收峰：450 nm（肩峰480 nm）；Na₂S处理后新峰：540 nm、640 nm

3.3 纯化ERBC和ERBC366对不同粘康酸异构体的还原

纯化ERBC的烯酸还原酶活性以NADH为电子供体，分别以顺,顺-粘康酸（ccMA）、顺,反-粘康酸（ctMA）和反,反-粘康酸（ttMA）为底物进行测定（图4A）。ERBC能还原所有三种粘康酸异构体，但活性差异显著。以NADH为电子供体时，ERBC对ccMA的还原活性最高，对ctMA的活性约为ccMA的一半，对ttMA的活性最低。除NADH外，DT也能支持ERBC催化反-肉桂酸和ccMA的还原（图4B）。以DT为电子供体时，ERBC还原反-肉桂酸生成氢化肉桂酸，还原ccMA生成2HDA和己二酸。

【数据】底物：ccMA、ctMA、ttMA（10 mM）；电子供体：NADH、DT；活性顺序：ccMA > ctMA > ttMA（原文未给出具体数值）

3.4 氧气暴露和不同电子供体对纯化蛋白还原酶活性的影响

在大肠杆菌细胞中蛋白表达期间的氧气暴露对ERBC活性有显著影响（图5A）。厌氧条件下表达的ERBC显示出最高的NAD(P)H氧化酶活性，而好氧表达的ERBC活性较低。不同电子供体（NADH、NADPH、DT）对纯化ERBC、ERBC366和YqjM的还原酶活性影响不同（图5B）。以2-己烯二酸（2HDA）和顺,顺-粘康酸（ccMA）为底物时，ERBC在DT存在下显示出最高的底物转化活性。

【数据】蛋白量：20 μg/每种；底物浓度：10 mM；电子供体：NADH、NADPH、DT；表达条件：厌氧 vs 好氧

3.5 ERBC的结构分析：连接氧化还原辅因子与蛋白外部的潜在口袋和通道

对ERBC结构模型的进一步分析揭示了蛋白内部存在多个潜在的口袋和通道（图6）。FMN附近存在一个口袋（紫色标记），FAD附近存在另一个口袋（蓝色标记）（图6A）。FMN隧道（图6B）和FAD隧道（图6C）连接辅因子与蛋白外部，[4Fe-4S]簇隧道（图6D）也通向蛋白表面。这些口袋和隧道的存在可能为电子供体（如DT）接近氧化还原辅因子提供通路，从而解释了DT能够直接还原ERBC辅因子的实验观察。

【数据】蛋白口袋：FMN附近（紫色）、FAD附近（蓝色）；隧道：FMN隧道、FAD隧道、[4Fe-4S]簇隧道（原文未给出具体尺寸）

3.6 冻干ERBC细胞以DT为还原剂还原顺,顺-粘康酸

为开发无需蛋白纯化的实用催化体系，研究者制备了表达重组ERBC的冻干大肠杆菌细胞（ERBC细胞），并以DT为还原剂测试其催化ccMA还原为己二酸的能力（图7）。反应混合物含100 mM HEPES-K缓冲液（pH 7.5）、ccMA（按指定浓度）和DT。冻干ERBC细胞能有效还原ccMA生成己二酸。作为对照，纯化ERBC以NADH为电子供体也能催化该反应，但需要添加昂贵的NADH。

【数据】缓冲液：100 mM HEPES-K（pH 7.5）；底物：ccMA（原文未给出具体浓度）；催化剂：冻干ERBC细胞（6 mg干生物质）；还原剂：DT；温度：30°C；时间：过夜（12h）

3.7 空气暴露对冻干ERBC细胞活性和底物转化的优化

研究者进一步考察了表达期间空气暴露时间对ERBC细胞干重积累和粘康酸还原活性的影响（图8A）。从0 h（−O₂，厌氧表达）到过夜（O/N，好氧表达）的不同空气暴露条件下，ERBC细胞的干重积累和活性呈现不同趋势。优化实验表明，适当的空气暴露时间对获得高活性ERBC细胞至关重要。以DT为还原剂时，冻干ERBC细胞在不同底物浓度下均能高效转化ccMA生成己二酸（图8B）。

【数据】空气暴露时间：0 h（厌氧）至过夜（好氧）；底物：ccMA；还原剂：DT（原文未给出具体转化率数值）

3.8 冻干ERBC细胞催化ccMA还原为己二酸的工艺流程

图9展示了使用含ERBC的冻干大肠杆菌细胞、以连二亚硫酸盐为还原剂和除氧剂，将顺,顺-粘康酸生物催化还原为己二酸的完整工艺流程。该流程包括：重组ERBC在大肠杆菌中的表达、细胞收获与冻干、以DT为还原剂的生物催化反应、产物分离纯化等步骤。DT在此过程中同时发挥两个关键作用：作为电子供体驱动ERBC催化的粘康酸还原，以及作为除氧剂维持反应体系的厌氧环境，保护ERBC的氧敏感性[4Fe-4S]簇。

【数据】全细胞催化剂：冻干ERBC细胞；还原剂兼除氧剂：DT；底物：ccMA；产物：己二酸（原文未给出具体工艺参数）

讨论与解读

本研究揭示了细菌2-烯酸还原酶ERBC在电子供体利用方面的新特性。纯化的全长ERBC能以NADH还原三种粘康酸异构体，而化学还原剂DT也能有效驱动其催化活性。结构分析表明，ERBC含三个氧化还原辅因子（FMN、FAD、[4Fe-4S]），电子传递路径为NAD(P)H → FAD → [4Fe-4S] → FMN。DT可能通过蛋白内部的口袋和隧道直接接近并还原这些辅因子。更重要的是，使用冻干重组大肠杆菌全细胞作为催化剂、DT作为还原剂和除氧剂，成功实现了粘康酸到己二酸的高效生物转化。该体系免去了蛋白纯化和昂贵辅因子添加，同时提高了ERBC对高浓度底物的耐受性，为生物基己二酸的工业化生产提供了极具潜力的技术路线。

编译者解读：该研究的核心价值在于用廉价的连二亚硫酸盐替代昂贵的NAD(P)H，并采用冻干全细胞催化策略，大幅降低了生物催化体系的成本与操作复杂度。DT的双重功能——既是电子供体又是除氧剂——巧妙解决了ERBC氧敏感性的问题，这一设计思路对其他需氧敏感氧化还原酶的工业应用具有借鉴意义。从合成生物学角度看，该工作将酶工程与全细胞催化有机结合，展示了"简化即实用"的工程哲学。未来若能进一步优化DT用量、底物浓度和细胞装载量，并开发DT的循环再生策略，该工艺有望向规模化应用迈进。

参考来源

Batyrova KA. Dithionite-supported biohydrogenation of muconic acid to adipic acid by lyophilized Escherichia coli cells expressing recombinant enoate reductase. Enzyme and Microbial Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2025.110797

DOI: 10.1016/j.enzmictec.2025.110797