来源：Construction of high ethyl acetate-producing diploid/ tetraploid Saccharomyces cerevisiae through CRISPR/Cas9-mediated mating-type switching（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
乙酸乙酯是白酒中赋予果香风味的关键酯类化合物，对清香型白酒风格的形成尤为重要。本研究以实验室前期构建的高产乙酸乙酯单倍体酿酒酵母PGα为亲本，利用CRISPR/Cas9介导的交配型转换技术，构建了一系列高产乙酸乙酯且具有较好酸耐受性的二倍体和四倍体酵母菌株。其中杂合二倍体菌株PGAY在固态发酵中乙酸乙酯产量达479.76 mg/L，是单倍体PGα的1.7倍；四倍体菌株AY1PG3产量达3431.05 mg/L，是工业菌株YQ的3.2倍，为白酒风味品质提升提供了新途径。
研究背景
白酒是世界六大蒸馏酒之一，也是中国的民族酒精饮料，已有2000多年的生产历史。酯类化合物具有芳香性和挥发性，对白酒的风味和品质有重要影响。乙酸乙酯是白酒中四大酯类之一，在所有香型白酒中含量均较高，尤其与乳酸乙酯共同决定了清香型白酒的香气风格。白酒中的乙酸乙酯主要由酵母在发酵过程中产生。目前，具有较强乙酸乙酯合成能力的酵母菌株（如异常威克汉姆酵母、季也蒙汉逊酵母等）多从酒曲中分离，这些产酯酵母多为非酿酒酵母，其产乙醇能力通常弱于酿酒酵母。此外，白酒发酵过程中微生物代谢产物（如乙醇、乙酸和乳酸等）会抑制菌株生长，因此构建兼具高产乙酸乙酯和良好酸耐受性的酿酒酵母菌株具有重要应用价值。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究使用的所有菌株和质粒列于补充表1。酿酒酵母在YEPD培养基（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物）中、30°C静置或180 rpm摇床培养。阳性转化子筛选时培养基中添加300 mg/L G418。大肠杆菌DH5α用于质粒构建和扩繁时，在LB培养基（10 g/L氯化钠、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物）中、37°C、200 rpm摇床培养，添加100 mg/L氨苄青霉素。固体培养基添加2%琼脂。
【数据】酿酒酵母培养基：YEPD（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物）；温度：30°C；转速：180 rpm；筛选浓度：300 mg/L G418；大肠杆菌培养基：LB（10 g/L氯化钠、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物）；温度：37°C；转速：200 rpm；筛选浓度：100 mg/L氨苄青霉素；固体培养基琼脂：2%
2.2 酵母交配型转换相关质粒和菌株的构建
质粒Yep-Cas9-KAN用Not I限制性内切酶酶切，载体片段经胶回收纯化。以Yep-SNR52和Yep-SUP4质粒为模板获得gRNA片段。设计带有Yep-Cas9-KAN载体Not I酶切位点两侧20 bp同源序列的引物，以Yep-SNR52和Yep-SUP4质粒为模板进行PCR扩增获得融合片段。将所得片段融合生成靶向MAT基因的gRNA片段，gRNA序列参考文献报道。将gRNA片段与线性化质粒载体重组，构建质粒YEP-Cas9-MATa或YEP-Cas9-MATα。质粒序列经测序验证正确性。使用引物JPX-F和JPX-R分别从AY14a基因组DNA扩增3292-bp的MATa盒供体DNA片段，从AY14α基因组DNA扩增3397-bp的MATα盒供体DNA片段。将相应的交配型转换盒和质粒通过醋酸锂化学转化法共转化至酵母细胞中进行交配型转换，并通过PCR和测序验证。
【数据】限制酶：Not I；MATa供体片段：3292 bp；MATα供体片段：3397 bp；转化方法：醋酸锂化学转化法；验证方法：PCR和测序
2.3 二倍体和四倍体酿酒酵母菌株的构建及倍性测定
二倍体和四倍体酵母的构建方法为：将等量的两种交配型MATa（MATa/a）和MATα（MATα/α）酵母细胞置于含30 μL无菌水的无菌1.5 mL离心管中，充分混匀后将混合细胞悬液点种于YEPD平板上，30°C培养2天。挑取部分菌株在YEPD平板上划线，30°C培养2–3天，挑取单菌落通过PCR验证获得二倍体和四倍体酵母菌株。酵母菌株的交配型通过PCR确定，使用引物MAT-R、MATa-F和MATα-F，具体序列见补充表2。此外，采用流式细胞术测定酵母细胞内DNA含量以确定倍性。具体步骤为：将酵母培养至对数生长期，收集细胞（约1×10⁷个），用水洗涤两次，然后在70%乙醇溶液中室温（20–25°C）固定1 h。离心收集细胞，重悬于1 mL 50 mM柠檬酸钠缓冲液中。再次离心后，将细胞重悬于975 μL柠檬酸钠缓冲液中，加入25 μL RNase A（500 U/mL），50°C孵育1 h。然后加入50 μL蛋白酶K（600 U/mL），50°C继续孵育1 h。将SYBR染料用Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0）按1:10稀释，取20 μL稀释液加入上述体系中，室温（20–25°C）避光孵育1 h。最后加入Triton X-100至终浓度0.25%，充分涡旋混匀，样品通过流式细胞仪分析。
【数据】交配混合体积：30 μL无菌水；培养温度：30°C；培养时间：2天（划线2–3天）；固定液：70%乙醇；固定温度：20–25°C；固定时间：1 h；柠檬酸钠缓冲液浓度：50 mM；RNase A用量：25 μL（500 U/mL）；孵育温度/时间：50°C/1 h；蛋白酶K用量：50 μL（600 U/mL）；孵育温度/时间：50°C/1 h；SYBR稀释比：1:10（Tris-EDTA pH 8.0）；避光孵育：20–25°C/1 h；Triton X-100终浓度：0.25%；细胞量：约1×10⁷个
2.4 酵母菌的分离纯化
从清香型大曲（山东某清香型酒厂提供）和市售酒曲中筛选酵母菌。将10 g酒曲加入100 mL无菌水中，在摇床中（30°C、180 r/min）振荡30 min，使酒曲中的微生物均匀分散，制得酒曲浸出液。将悬液用无菌水进行系列梯度稀释。随后取100 μL不同稀释度的稀释液涂布于WL琼脂培养基上，30°C培养2–3天。挑取单菌落划线于WL琼脂平板，30°C培养48 h。经过2–3轮划线纯化后获得初步纯化的菌落，4°C保存备用。
【数据】酒曲用量：10 g；无菌水体积：100 mL；振荡条件：30°C、180 r/min、30 min；涂布体积：100 μL；培养温度/时间：30°C/2–3天；划线培养：30°C/48 h；纯化轮数：2–3轮；保存温度：4°C
2.5 高粱水解液培养基液体发酵
高粱水解液培养基制备：将水（60–70°C）与高粱糁按3:1比例混合，60°C糊化30 min；加入α-淀粉酶，90°C液化30 min；然后在电磁炉上煮沸20 min；加入糖化酶，60°C糖化4 h；最后加入酸性蛋白酶，40°C水解2 h。所得培养基用四层纱布过滤。
发酵：酵母细胞在5 mL 8°Bx高粱水解液培养基中30°C预培养24 h，然后转入含45 mL 12°Bx高粱水解液的150 mL锥形瓶中，30°C培养16 h获得种子培养物。将种子培养物接种于高粱水解液培养基中，初始OD600调至0.5。然后加入1 mL营养盐（75 g/L KH₂PO₄、81 g/L尿素和15 g/L MgSO₄）。混合物在30°C下发酵，直至12 h后CO₂失重小于0.2 g。
【数据】水与高粱糁比例：3:1；糊化：60°C/30 min；液化：90°C/30 min（α-淀粉酶）；煮沸：20 min；糖化：60°C/4 h（糖化酶）；水解：40°C/2 h（酸性蛋白酶）；预培养：5 mL 8°Bx/30°C/24 h；种子培养：45 mL 12°Bx/30°C/16 h；初始OD600：0.5；营养盐：1 mL（75 g/L KH₂PO₄、81 g/L尿素、15 g/L MgSO₄）；发酵终点：12 h CO₂失重<0.2 g
2.6 模拟小曲清香型白酒固态发酵
麸皮固体酵母种子培养制备：玉米水解液培养基按文献方法制备。将水（60–70°C）与玉米糁按3:1比例混合，60°C糊化20 min；加入α-淀粉酶，90°C液化90 min；最后加入糖化酶，60°C糖化20 h。所得培养基用四层纱布过滤。
麸皮固体酵母制备：酵母细胞在5 mL 8°Bx玉米水解液培养基中30°C预培养24 h，转入含45 mL 12°Bx玉米水解液的150 mL锥形瓶中，30°C培养16 h。将75 g麸皮和7.5 g玉米粉置于500 mL锥形瓶中，搅拌均匀，加入45%水。润湿30 min后，115°C灭菌30 min，然后接种4%酵母种子液（玉米水解液种子培养物），搅拌均匀，30°C培养2天。
模拟固态发酵：小曲清香型白酒模拟固态发酵流程如图1所示。首先，高粱在75°C水中浸泡20 h。随后，浸泡后的粮食在115°C、0.1 MPa下蒸煮20 min，再在65°C水中焖粮5 min。然后再次在115°C、0.1 MPa下蒸煮15 min。待温度降至40°C后，加入相当于高粱初始重量1%的混合酒曲粉，堆成特殊形状和厚度，并用稻壳覆盖粮面。32°C糖化24 h。糖化完成后，将糖化粮和蒸馏粮混合（1:2，w/w），转入发酵容器中发酵。
【数据】玉米水解：水与玉米糁比例3:1、糊化60°C/20 min、液化90°C/90 min、糖化60°C/20 h；麸皮用量：75 g；玉米粉用量：7.5 g；加水量：45%；润湿：30 min；灭菌：115°C/30 min；接种量：4%；培养：30°C/2天；高粱浸泡：75°C/20 h；蒸煮：115°C/0.1 MPa/20 min；焖粮：65°C/5 min；二次蒸煮：115°C/0.1 MPa/15 min；酒曲添加量：1%；糖化：32°C/24 h；糖化粮与蒸馏粮比例：1:2（w/w）
研究结果
3.1 二倍体酿酒酵母菌株的构建与发酵特性
在自然界中，酵母通常以单倍体和二倍体两种状态存在。二倍体比单倍体具有更多的生长和产量优势。AY14α是实验室开发的一株单倍体菌株，具有优异的酸耐受性和发酵性能；PGα是通过在AY14α中过表达ALD6（乙醛脱氢酶）、ACS1（乙酰辅酶A合成酶）和AeAT9（醇酰基转移酶），并敲除POR2（线粒体孔蛋白）构建的。基于这两种菌株，利用CRISPR/Cas9交配型转换技术构建了两株二倍体酿酒酵母菌株PGaα（MATa/α）和PGAY（MATa/α）。首先，通过PGα（MATα）的交配型转换获得酿酒酵母菌株PGa（MATa）（图2A）。然后，将PGα与PGa交配获得菌株PGaα，将PGa与AY14α交配获得菌株PGAY（图2A）。通过PCR和胞内DNA含量检测确认二倍体菌株构建成功（图2B和图S2）。
采用500 mL锥形瓶进行XQLAB模拟固态发酵实验，测试二倍体菌株的发酵性能。以工业菌株YQ和单倍体菌株PGα为对照。测定发酵过程中的CO₂失重和发酵后酒醅的发酵参数（水分含量、还原糖和残余淀粉）。结果显示，不同实验设计之间的CO₂失重、水分含量、还原糖和残余淀粉无显著差异（表1和图2C）。值得注意的是，二倍体菌株的乙酸乙酯合成能力较单倍体菌株显著增强（图2D）。PGaα和PGAY白酒样品中乙酸乙酯含量分别达到352.05 mg/L和479.76 mg/L，分别是PGα的2.01倍和2.75倍（图2D）。杂合二倍体菌株PGAY的乙酸乙酯合成能力显著高于纯合二倍体PGaα。这可能是因为基因修饰影响了单倍体菌株的生长，而将基因修饰菌株与野生型菌株融合可以有效缓解其生长负担。
【数据】PGaα乙酸乙酯含量：352.05 mg/L（PGα的2.01倍）；PGAY乙酸乙酯含量：479.76 mg/L（PGα的2.75倍）；CO₂失重、水分含量、还原糖、残余淀粉：各实验组间无显著差异
3.2 高产乙酸乙酯非酿酒酵母与二倍体菌株PGAY的产酯及发酵性能比较
酵母是白酒发酵过程中乙酸乙酯的主要产生菌。白酒发酵中，高产乙酸乙酯的酵母菌株主要从酒曲中分离。本实验从不同酒曲中分离出24株酵母菌。根据形态特征和DNA测序结果，这24株酵母菌被鉴定为8株异常威克汉姆酵母、8株酿酒酵母和8株库德里阿兹威毕赤酵母（图S3）。以实验室保藏的高产乙酸乙酯菌株BJVI55003（库德里阿兹威毕赤酵母）和BJI48004（异常威克汉姆酵母）为对照。利用24孔板高粱水解液发酵考察从酒曲中分离的24株酵母菌合成乙酸乙酯的能力。结果显示，非酿酒酵母合成乙酸乙酯的能力显著优于酿酒酵母，在麸皮培养基中也观察到类似结果（图3A）。在三种非酿酒酵母中，BJQSD3（异常威克汉姆酵母）具有优异的乙酸乙酯合成能力，发酵结束时乙酸乙酯含量高达1115.24 mg/L。另外两株非酿酒酵母BJQXB054（库德里阿兹威毕赤酵母）和BJVI55003（库德里阿兹威毕赤酵母）在发酵结束时的乙酸乙酯含量分别为354.42 mg/L和409.36 mg/L（图3A）。
为研究高产乙酸乙酯菌株PGAY、BJQSD3（异常威克汉姆酵母）、BJQXB054（库德里阿兹威毕赤酵母）和BJVI55003（库德里阿兹威毕赤酵母）在厌氧条件下的生长和发酵性能，以高粱水解液为培养基进行纯培养厌氧发酵。结果显示，厌氧条件下PGAY与非酿酒酵母在生长和发酵性能方面存在显著差异（图3B–D）。PGAY在发酵前24 h内快速生长，而非酿酒酵母生长缓慢，整个发酵过程中PGAY的细胞数量是非酿酒酵母的6–24倍（图3B）。这是因为非酿酒酵母在厌氧阶段需要更长的适应期。发酵液中乙醇含量的变化趋势与乙酸乙酯含量相似（图3C和D）。PGAY在发酵早期快速合成乙醇和乙酸乙酯，而非酿酒酵母在厌氧发酵条件下合成乙醇和乙酸乙酯的速度要慢得多（图3C和D）。此外，与24孔板微氧发酵相比，非酿酒酵母在厌氧条件下乙酸乙酯产量显著下降（图3D）。这一现象是由于非酿酒酵母显著的产酯能力依赖于氧气，发酵过程中氧气的快速消耗削弱了非酿酒酵母的代谢能力，导致乙酸乙酯产量严重下降。
【数据】分离菌株数：24株（8株异常威克汉姆酵母、8株酿酒酵母、8株库德里阿兹威毕赤酵母）；BJQSD3乙酸乙酯含量：1115.24 mg/L；BJQXB054乙酸乙酯含量：354.42 mg/L；BJVI55003乙酸乙酯含量：409.36 mg/L；PGAY细胞数：非酿酒酵母的6–24倍
3.3 二倍体PGAY与非酿酒酵母在白酒模拟固态发酵中发酵性能的进一步比较
为进一步筛选适合白酒发酵环境的高产乙酸乙酯酵母，进行了固态发酵实验。将BJQSD3（异常威克汉姆酵母）、BJQXB054（库德里阿兹威毕赤酵母）、BJVI55003（库德里阿兹威毕赤酵母）和PGAY用于XQLAB模拟固态发酵。发酵初期，非酿酒酵母的发酵速率（CO₂失重）较慢，显著低于二倍体菌株PGAY（图4A）。在固态发酵中，糖化结束时非酿酒酵母的细胞数高于PGAY（图4B）。这表明非酿酒酵母在发酵初期发酵速率慢并非由于初始酵母细胞数不足，而是因为非酿酒酵母对低氧可用条件的耐受性低于酿酒酵母。发酵结束时，PGAY的细胞数高于三株非酿酒酵母（图4B）。
发酵结束后，不同样品之间的水分含量、还原糖、残余淀粉和乙醇含量无显著差异（表2）。值得注意的是，酿酒酵母PGAY白酒样品中的乙酸乙酯含量显著高于三株非酿酒酵母（图4C）。PGAY白酒样品中的乙酸乙酯含量分别比BJQXB054、BJQSD3和BJVI55003高30.24%、31.12%和46.91%（图4C）。此外，PGAY在其他酯类合成方面也表现出优势。PGAY白酒样品中乙酸异戊酯含量显著高于其他样品（图4D）。与BJQXB054、BJQSD3和BJVI55003相比，PGAY中乙酸异戊酯含量分别高89.28%、76.87%和146.99%（图4D）。PGAY中乙酸异戊酯含量的显著增加可能与醇酰基转移酶的过表达有关，该酶催化异戊醇（3-甲基-1-丁醇）与乙酰辅酶A反应生成乙酸异戊酯。这一推测得到检测到的较低异戊醇水平的进一步支持。更令人惊讶的是，几乎所有种类的高级醇含量……
【数据】PGAY乙酸乙酯含量比BJQXB054高：30.24%；比BJQSD3高：31.12%；比BJVI55003高：46.91%；乙酸异戊酯含量比BJQXB054高：89.28%；比BJQSD3高：76.87%；比BJVI55003高：146.99%；水分含量、还原糖、残余淀粉、乙醇含量：不同样品间无显著差异
讨论与解读
本研究以高产乙酸乙酯单倍体菌株PGα为基础，利用CRISPR/Cas9交配型转换方法构建了一系列二倍体和四倍体酿酒酵母。固态发酵中，杂合菌株PGAY的乙酸乙酯产量显著高于纯合菌株PGaα，表明基因修饰菌株与野生型菌株交配后可缓解基因修饰带来的代谢负担，进一步提升菌株发酵性能。与工业产酯酵母相比，PGAY在发酵过程中始终具有更高的酵母细胞数、更快的发酵速率和更高的乙酸乙酯产量。基于相同策略进一步构建了四倍体菌株，发现四倍体菌株对乙酸和乳酸的耐受性较PGα有所提高，使其更适合白酒发酵的高酸环境。在小曲清香型白酒发酵中试实验中，四倍体菌株白酒样品中的乙酸乙酯含量……
编译者解读
本研究提供了一条清晰的菌株工程路线：以CRISPR/Cas9交配型转换为工具，将实验室改造的高产单倍体与野生型菌株杂交，在保持遗传修饰优势的同时修复生长负担。这一策略巧妙之处在于利用倍性杂交"稀释"代谢工程带来的适应性代价——杂合二倍体PGAY的表现优于纯合二倍体即为直接证据。四倍体策略则进一步叠加了酸耐受性优势，直面白酒发酵的高酸环境。从应用角度看，该研究将菌株构建与模拟固态发酵评价紧密结合，筛选流程完整，数据支撑充分。局限在于多倍体菌株在实际大生产中的遗传稳定性及长期传代后的表型保持尚需考察。
参考来源
Sun, C. (2025). Construction of high ethyl acetate-producing diploid/tetraploid Saccharomyces cerevisiae through CRISPR/Cas9-mediated mating-type switching. Food Bioscience, 105965. DOI: 10.1016/j.fbio.2025.105965
DOI: 10.1016/j.fbio.2025.105965