来源：A haploid wild yeast resource for exploring the natural ecology of Saccharomyces cerevisiae（iScience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
酿酒酵母在自然界中主要以二倍体状态存在，限制了野生群体的遗传分析。本研究通过CRISPR-Cas9靶向敲除HO基因，从台湾32株野生酿酒酵母分离株中构建了单倍体资源库，覆盖亚洲野生谱系。系统配对杂交显示，尽管所有组合均能形成合子，但许多组合孢子活力显著降低，揭示了强烈的合子后生殖隔离。基因组分析将杂交不育与谱系特异性结构变异相关联——而非单纯的序列分歧。表型分析还发现了温度适应性分化、杂种优势以及麦芽糖代谢能力的人为选择痕迹。
研究背景
酿酒酵母是遗传学、生物技术和进化研究的重要模式生物，其基因组小、遗传工具丰富、生长快速，并在人类发酵史上占据重要地位。以S288C及其衍生菌株为代表的实验室菌株数十年来主导了功能基因组学研究，为细胞周期调控、DNA修复和代谢等基础生物学过程提供了关键见解。然而，这些驯化菌株源自适应人类相关环境的有限系统发育谱系，仅代表野生酵母群体中庞大遗传和表型多样性的一小部分。野生分离株有助于揭示在驯化菌株中被人类驱动选择和耐受性功能缺失突变所掩盖的自然变异。台湾地区的野生酿酒酵母群体为研究自然生态条件下的生殖隔离和代谢分化提供了独特窗口。
研究方法
菌株选择与稳定单倍体构建
酵母采样和富集方法由Lee等人报道。研究团队从各种底物中收集了2,461份环境样本，选取了33株具有代表性的非克隆野生酵母菌株（表1）。所有菌株均在YPD琼脂培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖（右旋糖）、2%琼脂）上维持，并于-80°C保存在25%甘油中。野生酿酒酵母分离株主要为纯合、同宗配合二倍体，平均全基因组杂合度为3.83×10⁻⁴。
稳定单倍体通过CRISPR-Cas9方法靶向敲除HO基因产生。简言之，携带卡那霉素抗性基因的pL88质粒用于在HO位点引入两次切割。HO位点的同源定向修复模板通过PCR生成，所用引物为HO_truncated_F和HO_truncated_R。转化后，至少保存5个阳性菌落并检查HO基因型。为确认靶向HO位点成功编辑，使用引物对HO_165F/HO_1702R进行PCR验证。成功编辑产生398-bp扩增子，未编辑菌落产生1,867-bp扩增子。每个菌株选取一个成功编辑的菌落进行产孢和四分体解剖以获得单倍体菌株。ho敲除二倍体的产孢在固体产孢培养基上诱导3-7天，培养基成分为1%醋酸钾、0.1%酵母提取物、0.05%葡萄糖、0.01% dropout粉末和2%琼脂。成熟子囊用zymolyase（Zymo Research, California, USA）消化，使用Singer MSM system series 300进行四分体解剖。优先保留具有四个可存活孢子的完整四分体用于常规遗传分析。
【数据】样本数：2,461份环境样本；菌株数：33株；培养基：YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂）；保存条件：25%甘油、-80°C；平均杂合度：3.83×10⁻⁴；PCR产物：成功编辑398-bp、未编辑1,867-bp；产孢时间：3-7天；产孢培养基：1%醋酸钾、0.1%酵母提取物、0.05%葡萄糖、0.01% dropout粉末、2%琼脂
交配型分析
孢子交配型使用酿酒酵母测试菌株bar1Δ和sst2Δ确定。bar1Δ菌株对α因子敏感，sst2Δ菌株对a因子敏感。每个测试菌株的单菌落重悬于200 μL ddH₂O中，涂布在补充了0.01%色氨酸和0.01%腺嘌呤的YPD琼脂上。对于sst2Δ测试菌株，培养基额外添加0.04% Triton X-100以增强晕圈形成。每个孢子的菌落重悬于5 μL ddH₂O中，取2 μL混合物点样到bar1Δ和sst2Δ测试菌苔上，30°C孵育2天。根据相应测试菌苔上生长抑制晕圈的存在推断交配型。仅保留产生两个MAT a和两个MATα孢子的四分体，单倍体在25%甘油中于-80°C保存用于后续分析。
【数据】测试菌株：bar1Δ（α因子敏感）、sst2Δ（a因子敏感）；重悬体积：200 μL ddH₂O；培养基添加物：0.01%色氨酸、0.01%腺嘌呤、0.04% Triton X-100（sst2Δ）；点样量：2 μL；孵育：30°C、2天
基因组测序
酿酒酵母菌株在YPD肉汤中于30°C、200 rpm振荡培养24小时，然后离心收集菌体。对于Illumina测序，使用Zymo Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep Kit（Zymo Research, California, USA）按照制造商说明提取gDNA。文库制备和测序外包给Biotools Co.，在NovaSeq 6000平台进行。对于Oxford Nanopore Technologies（ONT）测序，提取高分子量gDNA。简言之，酵母细胞壁用zymolyase消化制备原生质球，随后使用补充十二烷基硫酸钠（SDS）的裂解缓冲液裂解细胞。随后沉淀蛋白质，通过DNA沉淀回收gDNA。ONT文库通过连接测序试剂盒（SQK-LSK109）和native barcoding（EXP-NBD104）或native barcoding kit（SQK-NBD114.24）制备。Nanopore读段在R10.3（FLO-MIN111）或R10.4.1（FLO-MIN114）流动槽上测序，使用Guppy（v5.0.22）进行碱基识别。菌株S14、LY0215、PD15A、PD35A、PD38A和SR18的组装方法和组装结果源自先前发表的研究。
【数据】培养条件：YPD肉汤、30°C、24h、200 rpm；测序平台：NovaSeq 6000（Illumina）、R10.3/FLO-MIN111或R10.4.1/FLO-MIN114（ONT）；碱基识别：Guppy v5.0.22
酵母杂交、孢子活力与线粒体基因分型
在选定的MAT a和MATα单倍体菌株之间进行配对种内杂交以评估生殖兼容性。每个菌株的单菌落在YPD上划线，30°C过夜孵育。每对单倍体细胞混合在5 μL无菌ddH₂O中，然后将悬浮液转移到YPD平板上，30°C孵育3小时以允许交配。使用Singer MSM 300显微操作器基于其特征性的三叶状出芽形态（图1C）鉴定和分离二倍体合子——该形态指示第一次合子后分裂。二倍体菌落在30°C孵育2天，转移到1%醋酸钾琼脂上诱导产孢。产孢后，如前所述使用Singer MSM 300系统解剖四分体。每个杂交组合至少解剖28个四分体（112个潜在孢子），孢子活力计算为在YPD上萌发并形成可见菌落的孢子百分比。使用R包permuco中实现的Freedman-Lane方法进行置换检验，评估孢子活力、序列分歧和基因组结构变异之间的关系，进行10,000次置换。线粒体基因分型在27个独立的合子衍生克隆上进行，包括来自SR13 MATa × PD38A MATα杂交的17个克隆和来自反向PD38A MATa × SR13 MATα杂交的10个克隆。基因分型用于确定同质化后保留了哪个亲本线粒体基因组。线粒体区域使用引物对Sc_mt_40947_F和Sc_mt_41779_R扩增。
【数据】交配条件：5 μL ddH₂O混合、30°C、3h；二倍体孵育：30°C、2天；产孢培养基：1%醋酸钾琼脂；四分体数量：≥28个/杂交（112个孢子）；置换检验：10,000次置换；线粒体基因分型克隆数：27个（17个SR13 MATa × PD38A MATα + 10个PD38A MATa × SR13 MATα）
研究结果
台湾野生酿酒酵母单倍体菌株的生成
为建立台湾野生酿酒酵母的全面单倍体资源库，研究团队从先前广泛采样获得的121个分离株中选取了33个代表性菌株（图1A；表1）。这些菌株分离自地理上不同的位置和多样的生态位，包括树木相关底物（叶片、细枝、树皮、果实、果实脱落物和凋落物）和传统发酵产品（表1）。所选分离株共同代表了先前群体基因组分析中鉴定的主要谱系和镶嵌祖先背景。这些菌株的成对遗传分歧中位数为每千碱基17.6个SNP，同源染色体间的全基因组杂合度范围为1.59×10⁻⁴至2.32×10⁻³。尽管不同谱系共存，但未观察到遗传分歧与地理邻近性之间的明确关系（图1B）。
使用CRISPR-Cas9方法在不同台湾野生酿酒酵母菌株中进行HO核酸内切酶基因的靶向破坏（图1C）。使用基于质粒的卡那霉素抗性标记筛选阳性转化子，通过PCR分析验证成功编辑。每个菌株至少筛选5个菌落，所有菌株均表现出成功的HO基因破坏，反映了持续的高敲除效率，并强调了CRISPR-Cas9系统在野生酿酒酵母分离株中的稳健性。转化菌落诱导产孢并进行四分体解剖。在33株经CRISPR-Cas9处理的菌株中，27株适用于下游遗传分析，包括26株产生具有四个可存活孢子的四分体的菌株和1株仅形成二分体和三分体的菌株SR25。其余6株在产孢至孢子活力的不同阶段受限。PD25A（TW1谱系）、PD31A（TW2a）和XI07（TW_Mosaic）在HO破坏后形成成熟子囊/四分体，但大多数解剖的孢子未能萌发或形成可见菌落，自身孢子活力低于50%（表S2）。因此，PD25A、PD31A和XI07被归类为可形成四分体但自身孢子活力低的分离株，而非不产孢菌株。PD39A和RG10主要产生二分体或三分体，也表现出低孢子活力；RG09未能产孢并表现出假菌丝生长（图S1）。
后续分析聚焦于两个自身孢子活力低的非镶嵌野生分离株PD25A和PD31A，二者均有密切相关的高活力对照菌株可用。为确定PD25A和PD31A孢子活力降低是否可由经典产孢或减数分裂基因的明显缺陷解释，研究比较了251个精选的产孢和减数分裂相关基因的变异。相对于各自最接近的高活力对照菌株H413-8和SR18，这两个菌株在该基因集中均未携带预测的高影响编码损伤（表S3和S4）。对私有替换变异基因的Gene Ontology富集分析在Benjamini-Hochberg校正后，也未在任何一株中鉴定出与经典减数分裂重组、检查点、孢子壁或前孢子膜通路显著相关的富集术语（表S5）。相反，显著术语（尤其是PD25A中）属于更广泛的调控、染色体定位、端粒/核外周和细胞周期相关类别。这些结果共同否定了经典产孢或孢子壁生物发生的简单破坏，与影响孢子活力、萌发或四分体形成后早期菌落形成的菌株特异性缺陷一致。
【数据】菌株数：33株（选自121个分离株）；遗传分歧中位数：17.6 SNPs/kb；杂合度范围：1.59×10⁻⁴至2.32×10⁻³；筛选菌落数：≥5个/菌株；成功用于下游分析的菌株：27株；自身孢子活力<50%的菌株：PD25A、PD31A、XI07；分析基因数：251个产孢/减数分裂相关基因
台湾谱系间的孢子活力
为表征野生酿酒酵母分离株间的生殖兼容性，研究对13个代表性菌株的单倍体进行了系统配对杂交，并测量了所得孢子活力（图2A；表1）。菌株内杂交通常产生高活力（90%-100%），但SR25是例外，活力降低（59.7%），与清酒来源菌株中常见的产孢效率降低一致。菌株间孢子活力范围为21%至96%，中位数为78%。最低活力出现在SR25（MATa）与PD35A（MATα）的杂交中，最高出现在SR14（MATa）与SR18（MATα）之间，正反交结果相似。
遗传上不同谱系之间的杂交揭示了显著且谱系特异性的孢子活力变化。代表台湾最分化谱系（TW1，图2B）的菌株H413-8在其所有菌株间杂交中一致产生低孢子活力的杂种，范围为25%至49%（图2A）。类似地，PD35A（CHN-V谱系）尽管与某些台湾谱系（如TW2）有相对较近的全基因组相似性，但表现出降低的生育力（21%-66%），表明整体序列分歧本身并不能解释生殖隔离。相反，这两个菌株的特征在于极端结构变异。H413-8表现出最高比例的染色体内倒位（平均2.5%），其次是PD15A（2.2%），而PD35A相对于其他菌株表现出显著升高的染色体间重排水平（约17.9%）（图2C和2D）。与此观察一致，孢子活力与全基因组遗传距离无显著相关性（图S2），表明台湾酿酒酵母杂交生育力降低与主要基因组不相容性相关，而非仅与全基因组分歧相关。
与这些强隔离谱系形成对比的是，自然杂交种表现出相对较高的生育力。自然杂交种SR13显示出镶嵌祖先谱系特征，包含37.5% TW3、32.0% CHN-VI/VII.2和20.7% CHN-III祖先成分，孢子活力中等到高（52%-88%），进一步突显了野生酵母谱系间杂交的生态和进化相关性。
交配型组合的检查揭示了MATα-MATa与MATa-MATα杂交之间有趣的不对称性（图2A）。尽管大多数杂交无论交配方向如何都表现出相似的活力，但观察到少数例外。自然杂交种PD38A（TW_Mosaic）表现出显著的交互亲本构型效应：当作为MATα亲本时，孢子活力在不同伙伴间变化很大（31%-91%），而当作为MATa亲本时，所有杂交一致显示高活力（>77%）。这些模式表明杂交生育力可能依赖于交互亲本构型，可能反映MAT相关效应、单倍体亲本间的核背景差异、线粒体遗传和线粒体-核相互作用。
【数据】菌株内杂交活力：90%-100%（SR25例外：59.7%）；菌株间杂交活力范围：21%-96%；中位数：78%；最低活力组合：SR25 MATa × PD35A MATα；最高活力组合：SR14 MATa × SR18 MATα；H413-8杂交活力：25%-49%；PD35A杂交活力：21%-66%；H413-8染色体内倒位：平均2.5%；PD15A：2.2%；PD35A染色体间重排：约17.9%；SR13祖先组成：37.5% TW3、32.0% CHN-VI/VII.2、20.7% CHN-III；SR13孢子活力：52%-88%；PD38A作为MATα亲本活力范围：31%-91%；作为MATa亲本：>77%
热性能曲线与热性能宽度
（此部分原文未在节选中完整呈现）
不同碳源下的酵母菌株生长特征
（此部分原文未在节选中完整呈现）
MAL位点分歧与麦芽糖利用能力的关系
（此部分原文未在节选中完整呈现）
讨论与解读
本研究中构建的台湾野生酿酒酵母单倍体资源库，使得在遗传和生态上不同的谱系之间直接评估生殖兼容性和表型多样性成为可能——尽管这些菌株常常同域分布。系统比较揭示了杂交生育力的显著变异，即使在共享相同栖息地的菌株之间也是如此。菌株间杂交的孢子活力值与Bendixsen等人综述中报道的范围（2.5%-100%，平均值75%）大致一致。最分化的菌株H413-8（TW1）一致产生低活力杂种，表明存在强烈的谱系特异性生殖屏障。在所有测试的杂交组合中均观察到具有特征性三叶状形态的合子，表明交配和细胞融合成功发生——因此该面板中合子前隔离似乎极少或不存在，而生殖屏障主要在合子形成后起作用。这与先前研究一致，表明孢子活力降低是酵母属合子后隔离的主要形式。染色体重排、序列分歧和位点特异性不相容性是这类屏障的已知促成因素。
编译者解读
该研究将CRISPR-Cas9基因编辑技术成功应用于非模式野生酵母菌株，以约98%的效率（32/33成功破坏HO）构建了单倍体资源库——这一策略巧妙绕过了野生菌株固有的杂合性障碍，为合成生物学提供了宝贵的野生遗传背景底盘。将杂交不育与结构变异（而非SNP分歧）相关联的方法学思路值得借鉴：它提示在工业菌株设计时，染色体结构相容性可能与序列优化同等重要。TW1谱系偏好低温生长及自然杂交种的杂种优势表型，对耐热、耐寒工业酵母菌株的开发具有直接参考价值。局限在于部分菌株自身孢子活力低（<50%）或无法产孢，限制了这些遗传背景在杂交育种中的直接应用。
参考来源
期刊：iScience, 2026
DOI: 10.1016/j.isci.2026.117320
DOI: 10.1016/j.isci.2026.117320