来源：CRISPR/Cas9-engineered thermotolerant Saccharomyces cerevisiae JAYET for enhanced 3G-ethanol production from Chlorella vulgaris biomass（Algal Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微藻基第三代乙醇生产需要经济高效的水解策略和健壮的发酵微生物。本研究利用CRISPR/Cas9系统将来源于黑曲霉（Aspergillus tubingensis）的α-淀粉酶基因（amyA）整合至耐热酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）JAYET菌株基因组中，构建了合成酵母菌株JAYCA。在富含碳水化合物的普通小球藻（Chlorella vulgaris）生物质发酵中，JAYCA在30°C下采用分步水解发酵（SHF）策略实现了92.1%的理论乙醇得率，在同步糖化发酵（SSF）中最高乙醇浓度达16.41 g·L⁻¹。这是工程化JAYCA菌株应用于微藻基整合生物加工（CBP）策略生产第三代乙醇的首次报道。
研究背景
全球能源需求持续增长与化石燃料枯竭推动了生物质能源和可再生生物燃料的探索。乙醇作为清洁燃料，产量高，有助于缓解能源危机并促进可持续发展。传统第一代（甘蔗、玉米）和第二代（木质纤维素）乙醇原料虽能同化大气CO₂，但存在耕地饱和与生物质顽抗性等突出问题。微藻作为第三代乙醇原料展现出独特优势：高CO₂固定效率、高光合效率、低土地需求、对食物链影响小，且其碳代谢通量可塑性高。微藻细胞中缺乏木质素、碳水化合物基质简单，是乙醇转化的可行候选原料。然而，将微藻碳水化合物转化为乙醇需要经济高效的水解策略和健壮的发酵微生物。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，将α-淀粉酶基因整合至已具备纤维素酶生产能力和耐热特性的工业酿酒酵母JAYET菌株基因组中，构建了兼具淀粉和纤维素水解能力的合成酵母菌株，并系统评估了其在不同发酵策略和温度下的第三代乙醇生产能力。
研究方法
2.1 基于CRISPR/Cas9的酵母基因工程
#### 2.1.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用酿酒酵母菌株见表1。酵母细胞在YPD培养基[酵母提取物10 g·L⁻¹，蛋白胨20 g·L⁻¹，葡萄糖20 g·L⁻¹，配制固体培养基时添加20 g·L⁻¹琼脂]中于30°C、200 rpm条件下培养。酵母转化筛选使用Geneticin（200 μg·mL⁻¹ G418），因质粒pGS_004.0携带KanMX标记。质粒构建、扩增与载体保藏使用大肠杆菌DH5α菌株，在Luria-Bertani（LB）培养基（胰蛋白胨10 g·L⁻¹，酵母提取物5 g·L⁻¹，NaCl 10 g·L⁻¹，必要时添加20 g·L⁻¹琼脂固化）中于37°C、200 rpm培养。细菌菌落筛选使用氨苄青霉素（100 mg·L⁻¹）。缺口修复（gap-repair）方法筛选使用不含尿嘧啶的合成完全（SC）培养基（Sigma-Aldrich®）。微生物保藏液用含25%甘油的培养基配制，于−80°C保存备用。本研究所用全部质粒和引物分别列于补充材料表S1和S2。
【数据】YPD培养基：酵母提取物10 g·L⁻¹，蛋白胨20 g·L⁻¹，葡萄糖20 g·L⁻¹，琼脂20 g·L⁻¹；培养条件：30°C、200 rpm；G418浓度：200 μg·mL⁻¹；LB培养基：胰蛋白胨10 g·L⁻¹，酵母提取物5 g·L⁻¹，NaCl 10 g·L⁻¹，琼脂20 g·L⁻¹；细菌培养：37°C、200 rpm；氨苄青霉素：100 mg·L⁻¹；保藏：25%甘油，−80°C
#### 2.1.2 常规分子生物学操作
gRNA设计、供体DNA合成和酵母转化的详细流程见补充材料（S1–S3节）。在大肠杆菌中扩增的质粒使用PureYield™质粒小提系统（Promega®）提取。从琼脂糖凝胶中回收的酶切质粒使用GenElute凝胶回收试剂盒（Sigma-Aldrich®）回收。载体转化大肠杆菌采用传统电穿孔法（2.1 kV，100 Ω，25 μF，New Englands Biolab®）。PCR扩增（Veriti™ Applied Biosystems®）使用Phusion高保真DNA聚合酶®（ThermoFisher®）进行供体扩增，使用GoTaq® DNA聚合酶（Promega®）进行验证扩增，均按照酶说明书操作。酵母基因组DNA采用Cheng和Jiang [34]描述的苯酚–氯仿法提取。
【数据】电穿孔参数：2.1 kV，100 Ω，25 μF；PCR聚合酶：Phusion高保真DNA聚合酶（供体扩增）、GoTaq DNA聚合酶（验证）；基因组DNA提取：苯酚–氯仿法
2.2 修饰菌株的动力学研究
携带α-淀粉酶编码基因的遗传修饰菌株——酿酒酵母JAYCA——通过在YP淀粉平板上生长测试其表达α-淀粉酶基因的能力。酿酒酵母JAY270和JAYET也同时接种作为对照。此外，定量检测了各菌株的胞外α-淀粉酶酶活。酵母接种于YPD培养基中，于30°C、180 rpm培养72 h，每日取样。样品离心后，取上清液检测其对0.1%（w/v）淀粉溶液的水解能力，参照Favaro等[35]的方法。酶解液释放的还原糖使用二硝基水杨酸试剂[36]测定。为评估菌株性能，酵母在不同碳源、浓度和温度条件下进行动力学评价。SC培养基分别添加葡萄糖（5 g·L⁻¹或20 g·L⁻¹）或淀粉（5 g·L⁻¹或20 g·L⁻¹），测试温度为30°C和40°C。各酵母菌株挑取单菌落于YPD培养基中30°C、200 rpm过夜培养。细胞离心（5000 rpm，5 min），用无菌蒸馏水洗涤并重悬于水中，使光密度（OD）为1（波长600 nm）。将细胞悬液加入含有不同培养基的96孔板中，使初始OD₆₀₀在0.1–0.2之间。培养板用PCR封板膜（676,040 Ampliseal，Greiner Bio-One®）密封，在酶标仪（Infinite® M200，TECAN，Männedorf，瑞士）上于30°C或40°C、200 rpm孵育24 h。每30 min测定各孔OD₆₀₀。发酵结束后回收样品进行色谱分析。最大比生长速率（μmax）动力学参数通过对数生长期的OD₆₀₀自然对数对时间（h）作图获得，μmax对应线性回归方程的斜率。
【数据】酶活测定：0.1%（w/v）淀粉溶液；还原糖测定：二硝基水杨酸法；动力学测试碳源：葡萄糖（5或20 g·L⁻¹）、淀粉（5或20 g·L⁻¹）；温度：30°C、40°C；初始OD₆₀₀：0.1–0.2；培养时间：24 h；转速：200 rpm；OD测定间隔：30 min；离心：5000 rpm、5 min
2.3 富含碳水化合物微藻中的乙醇生产
#### 2.3.1 微藻培养
普通小球藻由巴西圣卡洛斯联邦大学（UFSCar）植物学系藻类学实验室友情提供。菌株在BG-11培养基（pH 7.5）中于26°C、持续光照（100 μmol·m⁻²·s⁻¹）条件下维持。基于先前旨在增强碳水化合物积累的研究，通过将BG-11培养基改良为氮耗竭条件来优化培养条件。氮限制促进细胞代谢向碳水化合物合成方向重新定向。培养在2 L光生物反应器中进行14天，使用气泵提供通气。每日监测生物质浓度。每批次结束时，细胞通过离心（5000 rpm，10 min）收获，冻干（Enterprise，Terroni®），储存备用。
【数据】BG-11培养基pH 7.5；培养温度：26°C；光照：100 μmol·m⁻²·s⁻¹；光生物反应器体积：2 L；培养时间：14天；离心：5000 rpm、10 min
2.4 发酵策略
旨在利用高碳水化合物含量普通小球藻生物质最大化乙醇产量的发酵实验在三种工艺条件下进行：（i）分步水解发酵（SHF），（ii）同步糖化发酵（SSF），（iii）部分同步糖化发酵（pSSF）。所有情况下，所用生物质提供相当于10 g·L⁻¹碳水化合物的量。发酵在30°C和40°C下使用三种酵母菌株进行：酿酒酵母JAY270、JAYET和遗传修饰菌株JAYCA。JAY270和JAYET作为对照。接种前，菌株在YPD培养基中30°C过夜培养，然后收获，用无菌蒸馏水洗涤两次，重悬至初始OD为0.2。
SHF工艺中，微藻生物质用稀硫酸——H₂SO₄ 2.5%（w/v）水解。混合物在121°C、1.1 atm下高压灭菌30 min，冷却至室温，用CaCO₃中和至pH 5，离心（3000 rpm，8 min）后用于后续发酵。水解液中添加氨苄青霉素（100 mg·L⁻¹）。发酵在密封锥形管中进行，于200 rpm孵育72 h。
SSF和pSSF工艺中，使用α-淀粉酶（Termamyl，Novozymes®）和淀粉葡萄糖苷酶（AMG，Megazyme®）进行酶解，浓度分别为0.05 g酶·g底物⁻¹和0.2 g酶·g底物⁻¹，该浓度由先前饱和曲线实验确定。酶浓度基于初步优化实验（数据未显示）和藻类生物质水解的文献推荐[38]确定。这些酶在SSF应用中展现出良好前景。微藻底物用0.2 M醋酸钠缓冲液（pH 4.8）稀释。SSF中，酶与酵母同时加入底物中，添加氨苄青霉素（100 mg·L⁻¹），于200 rpm发酵72 h（30°C）和120 h（40°C）。pSSF工艺中，酶在接种前16 h加入，于50°C、600 rpm孵育。随后水解液冷却，添加氨苄青霉素（100 mg/L），接种水解液。定期取样进行OD监测和HPLC分析。
【数据】生物质碳水化合物当量：10 g·L⁻¹；SHF酸水解：H₂SO₄ 2.5%（w/v），121°C、1.1 atm、30 min，CaCO₃中和至pH 5，离心3000 rpm、8 min；氨苄青霉素：100 mg·L⁻¹；SHF发酵：72 h、200 rpm；SSF酶用量：α-淀粉酶0.05 g酶·g底物⁻¹、淀粉葡萄糖苷酶0.2 g酶·g底物⁻¹；缓冲液：0.2 M醋酸钠缓冲液pH 4.8；SSF发酵时间：72 h（30°C）、120 h（40°C）；pSSF预水解：50°C、600 rpm、16 h
2.5 分析测定
微藻细胞生长通过分光光度计（DU® 640，Beckman Coulter）在波长680 nm处测定OD每日监测。发酵样品使用Accela色谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国）进行HPLC分析，配备梯度泵（Accela 600泵）和折光指数检测器（RI检测器Accela）。分离通过Aminex HPX-87H离子交换柱在35°C下实现，以H₂SO₄（pH 2.6）为流动相，流速0.6 mL·min⁻¹。葡萄糖、甘油、乙酸和乙醇浓度通过HPLC测定。
【数据】微藻生长监测波长：680 nm；HPLC色谱柱：Aminex HPX-87H离子交换柱；柱温：35°C；流动相：H₂SO₄ pH 2.6；流速：0.6 mL·min⁻¹；检测器：折光指数检测器
研究结果
3.1 工程酵母：构建与验证
酿酒酵母JAY20菌株源自Pedra-2（PE-2）菌株，广泛用于巴西第一代乙醇生产。该菌株对工业环境表现出强适应性，具有理想的生长和乙醇生产特性[3,39]。在前期研究中，酿酒酵母AGY005菌株（即酿酒酵母JAYET）由JAY270衍生而来，基因组中整合了β-葡萄糖苷酶（AsGH3）和内切葡聚糖酶（AsGH74）基因，并经过耐热性进化。为开发能够同时水解富含碳水化合物微藻生物质中纤维素和淀粉的工业酵母菌株，选择酿酒酵母JAYET作为插入α-淀粉酶基因的基础菌株。该遗传修饰通过CRISPR/Cas9介导的黑曲霉amyA基因无标记整合实现，该基因编码α-淀粉酶。
由于待转化菌株已经历过CRISPR/Cas9编辑，选择HO位点的不同位置插入amyA基因。HO位点编码交配型转换核酸内切酶，失活后对酵母生长无影响，是基因修饰的中性位点。CRISPR/Cas9系统的gRNA通过将线性化的pGS_004.0质粒与杂交引物连接组装。转化和阳性菌落筛选后，进行初步测试以确定酿酒酵母JAYET基因组中Cas9作用的最佳位点。为构建工程化合成酵母，共转化靶标特异性CRISPR/Cas9质粒（pGS_004.19）和供体盒（GPDp-amyA-tCYC1）。使用1500 ng载体和1000 ng供体DNA时，转化效率达50%。
为确认基因成功插入JAYET背景基因组，进行了PCR检测（图1a和图1b）。首先确认了基因的一部分（图1a），随后扩增了整个表达盒（图1b）。转化成功后，将修饰酵母菌株JAYCA接种于淀粉琼脂平板，观察菌株间生长差异（图1c）。JAY270菌株无生长，JAYET在平板上仅有极少量细胞积累，可能归因于接种培养基中的残留葡萄糖。相比之下，酿酒酵母JAYCA表现出显著生长，表明基因组编辑成功且淀粉酶基因实现胞外表达。
除分子和生长验证外，还进行了淀粉酶酶活测定（图2）。在24 h时，酿酒酵母JAYCA与其他菌株之间存在统计学显著差异。在所有测定时间点，JAYCA菌株的胞外淀粉酶活性均高于其他菌株。因此，证实amyA基因已添加到酵母基因组中。结果表明，CRISPR/Cas9基因编辑技术对于淀粉酶基因整合而言准确、简单且高效。正如Cripwell [40]所述，此前尚无淀粉分解型CBP酵母平台的报道，CRISPR技术用于开发淀粉分解型酵母菌株只是时间问题。
【数据】转化效率：50%（1500 ng载体+1000 ng供体DNA）；PCR产物大小：890 bp；酶活测定时间点：24 h（统计学显著差异）
3.2 修饰菌株在不同碳源和温度下的动力学研究
对遗传修饰的酿酒酵母JAYCA在不同碳源和温度下的生长性能和代谢产物产生进行了评估，因其背景菌株曾经过耐热表型进化。选择葡萄糖作为菌株间比较的对照（补充图1）。
如预期所料，酵母细胞在20 g·L⁻¹葡萄糖存在下生长更好。然而，在相同葡萄糖浓度下，各菌株在40°C的整体性能与30°C相当。代谢物浓度在培养24 h后测定（表2），但这些值可能不能反映乙醇产量的峰值，因为此期间可能发生部分乙醇消耗。这一推断得到以下观察支持：酵母在发酵约7 h时已进入稳定期（补充图1）。
比较不同培养温度下的代谢物谱——考虑到JAY270是已知具有高氧化应激耐受性的健壮菌株[3]——观察到乙醇得率有所提高。就酿酒酵母JAYCA而言，在40°C、20 g·L⁻¹葡萄糖条件下培养时，乙醇浓度增加了14%。在相同温度下，甘油和乙酸水平均上升约1.7倍。这些化合物是典型的发酵副产物，与酵母代谢和应激反应密切相关。这些发现与Viktor等[1]的报道一致，他们报道了表达amyA基因的重组酿酒酵母Y294菌株产生了较高水平的乙酸和甘油。作者认为，实验室菌株Y294可能因原料淀粉转化效率低而经历代谢应激。
当碳源更换为淀粉时，观察到有趣的行为。在30°C下、5 g·L⁻¹和20 g·L⁻¹淀粉条件下（补充图2a和b），生长模式非常相似。尽管仅以淀粉为唯一底物时没有乙醇产生，但检测到对生长的影响。酿酒酵母JAYCA在40°C下的μmax高于同条件下的其他菌株。由于μmax随底物浓度增加而增加，推测在较高淀粉浓度下，淀粉酶更接近其最适温度，因此活性更高。
【数据】乙醇浓度增加：14%（40°C、20 g·L⁻¹葡萄糖）；甘油和乙酸水平上升：约1.7倍；进入稳定期：约7 h；μmax：JAYCA在40°C高于其他菌株
3.3 修饰工业菌株生产第三代乙醇
在确认遗传修饰成功并验证酿酒酵母在插入黑曲霉amyA基因后仍保持生长能力的基础上，评估了该菌株利用富含碳水化合物的普通小球藻生物质生产乙醇的效率。用于乙醇生产的生物质细胞组成中约含58.5%多糖，其中葡萄糖约占66.02%，此外还有甘露糖（12.34%）、半乳糖（数据未完整显示）。
【数据】生物质多糖含量：约58.5%；葡萄糖占比：约66.02%；甘露糖：12.34%
讨论与解读
本研究成功利用基于CRISPR/Cas9的高效工具构建了合成酵母菌株。将来源于黑曲霉的amyA基因插入工业重组酵母菌株酿酒酵母JAYET的HO位点，生成了兼具纤维素分解和淀粉分解能力的工业耐热酵母菌株——酿酒酵母JAYCA。除分子检测和胞外淀粉酶酶活验证外，修饰菌株还在不同碳源（葡萄糖和淀粉）和温度（30°C和40°C）下接受了动力学评价。酿酒酵母JAYCA在40°C葡萄糖条件下生长时，乙醇浓度较标准条件（30°C）提高了14%。当使用富含碳水化合物的普通小球藻生物质作为发酵底物时，修饰菌株表现优于其他酵母。采用SHF策略时，酿酒酵母JAYCA在6 h时呈现高乙醇理论得率（92.1%）。SSF在30°C下获得最高乙醇浓度（16.41 g·L⁻¹），表明其作为工业过程的稳健平台。本研究是巩固微藻生物质碳水化合物组分向乙醇转化生物过程的第一步，具有环境友好、成本效益高、技术可行性和显著的生物技术性能。
编译者解读：该研究展示了CRISPR/Cas9基因编辑在工业酵母菌株代谢工程中的精准应用——将异源α-淀粉酶基因无标记整合至中性HO位点，一步赋予菌株淀粉水解能力，避免了传统质粒表达系统的不稳定性。从合成生物学应用角度看，以耐热工业菌株为底盘、集成多种糖化酶基因的CBP策略代表了降低纤维素乙醇生产成本的重要方向。值得注意的是，JAYCA在仅以淀粉为唯一碳源时无乙醇产生，提示淀粉酶分泌量或淀粉水解效率仍有优化空间。未来可考虑启动子工程、基因拷贝数优化或共表达淀粉磷酸化酶等策略进一步提升微藻CBP效率。
参考来源
Silvello, M. A. C. (2025). CRISPR/Cas9-engineered thermotolerant Saccharomyces cerevisiae JAYET for enhanced 3G-ethanol production from Chlorella vulgaris biomass. Algal Research. DOI: 10.1016/j.algal.2025.104275
DOI: 10.1016/j.algal.2025.104275