来源：Programming a bacterial biosensor for directed evolution of tryptophan hydroxylase via high-throughput droplet sorting（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
5-羟基色氨酸（5-HTP）作为血清素合成前体，在情绪调节与睡眠改善方面具有重要应用价值。本研究构建了一套基于液滴的超高通量微流控筛选平台（DTSP），通过工程化改造L-色氨酸响应型细菌生物传感器，结合迭代饱和突变策略，成功获得了催化活性和热稳定性显著提升的色氨酸羟化酶突变体M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K），其催化活性较亲本CviPAH提高了4.25倍，45°C下半衰期延长3.2倍。
研究背景
5-HTP是色氨酸代谢途径中的关键中间产物，也是神经递质血清素的前体物质，在调节情绪、改善睡眠质量、调控食欲及体重管理等方面具有广泛认可的功效。与植物提取或化学合成相比，5-HTP的生物合成具有成本低、生产效率高等显著优势。色氨酸羟化酶（TPH）是5-HTP生物合成中的关键酶，然而天然酶在严苛工业条件下存在活性不足和稳定性差的问题，限制了其大规模工业化应用。早期研究主要集中于阐明TPH1的结构-功能关系，鉴定了关键催化残基（如His264、Asp139）、辅因子四氢生物蝶呤以及重要催化残基（如Ser58、Thr265）。Wang等人基于结构信息采用半理性设计获得了酶学性质改善的人源色氨酸羟化酶突变体MT10（H318E/H323E）。本研究旨在通过建立液滴微流控筛选平台，结合细菌生物传感器与迭代饱和突变策略，获得具有优良工业性能的TPH突变体。
研究方法
2.1 实验材料
表S1提供了本研究使用的所有菌株和载体信息。所有标准化学品（试剂级）均购自Sigma-Aldrich（中国上海）。限制性内切酶、T4 DNA连接酶和PrimeSTAR HS聚合酶由Takara Biotechnology Co., Ltd.（中国大连）提供。Stratagene GeneMorph II随机突变试剂盒购自New England BioLabs（美国马萨诸塞州贝弗利）。
2.2 产酶菌（EPB）与检测菌（DB）的构建
基于大肠杆菌色氨酸阻遏系统TrpR1(V58E)-PtrpO1(A4C)，在检测菌中构建了一系列L-色氨酸检测（TDx）生物传感器系统。具体而言，以绿色荧光蛋白mEmerald作为报告蛋白，将基于组成型启动子pJ23X的5种不同转录强度的启动子分别插入pET22b质粒中（https://parts.igem.org/Part:BBa_J23110）。
首先，合成pJ23x-TrpR1(V58E)基因片段并插入pET22b质粒的NdeI和HindIII限制性酶切位点之间，同时在TrpR1(V58E)的C末端插入转录终止子以避免转录噪声。同时，合成PtrpO1(A4C)启动子和mEmerald编码序列，并使用引物PtrpO-mEmerald-U和PtrpO-mEmerald-D通过重叠延伸PCR连接，获得PtrpO-mEmerald基因片段，插入pET22b质粒的HindIII和XhoI限制性酶切位点之间。
大肠杆菌MG1655 ΔtnaA ΔtrpR（MG01）作为本研究中靶酶文库和传感器系统的宿主菌。选择基于pJ23x的5个组成型启动子（pJ23100、pJ23104、pJ23111、pJ23106、pJ23107），其转录强度从强到弱不等，用于精确调控TrpR1的表达，由此获得5种生物传感器，分别命名为TD1-5（表S1）。随后，将质粒系统转化至MG01中，获得DB1-5菌株。
2.3 基于微孔板筛选策略的荧光分析
主要使用添加0.5 g/L酵母提取物的改良M9极限培养基（命名为M9-1）进行荧光测定。DB细胞在含100 μg/mL氨苄青霉素的培养基中于37°C过夜培养。加入L-色氨酸至终浓度0-500 mg/L。在37°C、600 rpm条件下孵育12小时后，测定荧光值和600 nm处的光密度值（OD600）。液滴图片使用配备Airyscan2的LSM 980显微镜分析仪（Zeiss，德国）拍摄。荧光强度使用Synergy™ HTX酶标仪（BioTek Instruments, Inc）在激发波长485 nm、发射波长528 nm条件下测定。OD600使用常规酶标仪（Neo2，BioTek）测定。荧光值以OD600进行归一化处理，所有实验均进行三次重复。
2.4 单细菌包封与液滴注射活性检测
微流控芯片采用聚二甲基硅氧烷（PDMS，Dow Corning）和SU8-3000负性光刻胶模具（MicroChem Corp.），按照标准光刻工艺制备。微流控通道在使用前用Aquapel™处理以使通道表面疏水。
EPB在含氨苄青霉素的M9-1培养基中培养6小时。用新鲜M9-1培养基洗涤后，将细菌稀释至OD600为0.05，随后包封于液滴中。为评估液滴中分泌的TPH活性，将DB3加入注射溶液中。DB3在M9-1培养基中培养12小时，用M9-1培养基洗涤后调整至OD600为10。使用注射器收集含已孵育EPB的液滴。流速设置为：油相8 μL/min，DB3为0.8 μL/min，已孵育EPB为1 μL/min。
分选前，收集液滴于37°C、220 rpm条件下孵育12小时。孵育后，将液滴重新注入分选芯片。使用485 nm激光通过物镜聚焦于微流控通道，检测528 nm处的单液滴荧光。设定阈值以分选最高荧光信号。当液滴荧光超过阈值时，电场将其导入分选通道。分选的液滴收集于含500 μL破乳剂（1H,1H,2H,2H-全氟辛醇）和500 μL LB培养基（Luria-Bertani）的Eppendorf管中。振荡后静置混合物，分离为油相和水相。随后从水相中回收细胞并涂布于LB琼脂平板。
2.5 随机突变文库的构建
转录调控因子TrpR1的随机突变文库通过使用Stratagene GeneMorph II随机突变试剂盒进行易错PCR生成，随后导入MG01菌株。使用我们前期研究建立的微孔板筛选策略筛选突变体。同样，CviPAH突变文库采用上述相同方法创建，并利用设计的DTSP筛选优势突变体。迭代饱和突变（ISM）方法用于靶向特定突变位点。
2.6 CviPAH及其变体动力学参数的测定
CviPAH活性在30°C条件下测定，反应体系为500 μL，含有不同浓度的L-色氨酸（1-21 mM）、2 mM四氢生物蝶呤（BH4）、0.1 mM FeSO4、5 mM二硫苏糖醇和50 mM HEPES缓冲液（pH 7.5）。通过分析不同L-色氨酸和BH4浓度下的酶活性计算稳态动力学参数。反应通过加入酶启动，在30°C下振荡反应10分钟。加入50%（v/v）甲醇终止反应，使用高效液相色谱（HPLC）测定合成的5-HTP量。一个酶活力单位定义为在30°C下每分钟催化L-色氨酸羟化产生1 μmol 5-HTP所需的酶量。
2.7 结构分析与分子动力学模拟
使用AlphaFold 2（https://github.com/deepmind/alphafold）预测WT CviPAH及其衍生突变体的三维结构。预测结构使用UCLA-DOE LAB-SAVES v6.0网络服务器（https://saves.mbi.ucla.edu/）进行评估。使用PyMOL软件（https://pymol.org/2/）进行可视化和结构分析。分子动力学（MD）模拟使用Gromacs软件和Amber99SB力场进行。通过最速下降法进行能量最小化以消除不利相互作用。系统在NVT和NPT系综下使用leapfrog积分器进行100 ps平衡，时间步长为2 fs。最后，对野生型和突变体酶在325 K下进行20 ns的MD模拟，记录均方根波动（RMSF）和均方根偏差（RMSD）值用于进一步分析。
【数据】菌株：MG1655 ΔtnaA ΔtrpR（MG01）；抗生素浓度：100 μg/mL氨苄青霉素；L-色氨酸浓度：0-500 mg/L；孵育条件：37°C、600 rpm、12h；荧光检测：激发485 nm/发射528 nm；包封OD600：0.05；DB3注射OD600：10；流速：油相8 μL/min、DB3 0.8 μL/min、EPB 1 μL/min；孵育条件：37°C、220 rpm、12h；酶活测定：30°C、L-Trp 1-21 mM、BH4 2 mM、FeSO4 0.1 mM、DTT 5 mM、HEPES 50 mM（pH 7.5）、反应10 min；MD模拟：325 K、20 ns、2-fs时间步长
研究结果
3.1 用于TPH的液滴超高通量微流控筛选平台（DTSP）设计
将传感器元件与靶酶突变文库整合到同一宿主细胞可能导致细胞过载和代谢干扰，进而影响细胞生长和荧光标记物表达。为提高生物传感器的准确性和效率，我们基于大肠杆菌MG1655 ΔtnaA ΔtrpR（MG01）设计了分离的产酶菌（EPB）和检测菌（DB）。具体而言，在产酶细胞中构建了用于表达各种TPH文库的即插即用基因盒，使L-色氨酸转化为5-HTP。同时，DB菌株被设计为通过产生相应强度的荧光信号来响应不同浓度的L-色氨酸，从而实现对EPB中酶活性的检测。由此，利用分离的靶酶文库宿主细胞和传感器信号转导细胞构建了液滴超高通量微流控筛选平台（DTSP）。
该平台的实施包括三个主要步骤（图1）：i）构建TPH突变文库，随后通过液滴制备装置将单细胞和底物共包封，进行细胞增殖和L-色氨酸的全细胞生物转化；ii）培养的DB细胞被注入并在液滴内孵育，响应剩余的L-色氨酸量产生荧光信号；iii）根据荧光信号通过分选装置分离阳性液滴，分离阳性突变体进行进一步验证。
3.2 L-色氨酸检测（TD）生物传感器系统的设计与优化
具有宽动态响应范围的灵敏生物传感器在高通量筛选中发挥关键作用。本研究基于大肠杆菌色氨酸阻遏系统TrpR1(V58E)-PtrpO1(A4C)设计了L-色氨酸检测（TD）生物传感器。对L-色氨酸具有特异性（而非5-HTP）的调控蛋白TrpR1作为传感元件，mEmerald绿色荧光蛋白作为输出信号。基于TrpR1的天然调控机制，它可以结合两个L-色氨酸分子形成活性复合物，占据PtrpO1操纵子位点，抑制下游mEmerald的表达。在缺乏L-色氨酸时，TrpR1不结合PtrpO1，从而释放mEmerald表达（图2A，S1）。
为建立验证阻遏系统的清晰背景菌株，首先敲除了大肠杆菌MG1655中的内源trpR基因。此外，删除了编码色氨酸降解酶——色氨酸酶的tnaA基因，生成菌株MG01。这确保了mEmerald的表达仅依赖于剩余的L-色氨酸。另外，使用添加0.5 g/L酵母提取物的M9Y-1培养基，在最大限度减少培养基中色氨酸影响的同时提供充足的营养以支持细胞增殖。
进一步对TrpR1进行调控因子工程以增强生物传感器系统的响应阈值。将编码随机TrpR1突变体的质粒文库导入MG01。以L-色氨酸添加作为输入，使用基于微孔板的筛选策略研究DB的剂量-响应行为（图2B）。TrpR2(L41M)突变体在色氨酸浓度为90 mg/L时给出最低荧光强度，降低了3倍（图2C）。结构建模分析显示，Gln17残基位于配体结合口袋中。活性口袋与配体L-色氨酸之间相互作用的减少与口袋内发生的构象变化相关（图2D）。
为提高生物传感器系统的灵敏度，我们筛选了驱动TrpR2表达的不同启动子。通过使用不同强度的组成型启动子pJ23X变体（pJ23100、pJ23104、pJ23111、pJ23106和pJ23107，从强到弱）控制TrpR2的转录水平，获得了5个候选传感器系统（图2E）。随后，将传感器系统导入MG01中，分别获得DB1-5菌株。
我们评估了这5种DB菌株对L-色氨酸的浓度响应。结果显示，DB3呈现的荧光信号随L-色氨酸浓度在0-500 mg/L范围内增加而降低，呈现强负相关性（图S2）。特异性是评估生物传感器性能的关键参数。当L-色氨酸浓度逐渐增加至500 mg/L时，DB3生物传感器细胞的动态荧光输出减弱约25倍。相比之下，产物5-HTP即使浓度达到500 mg/L也无法诱导mEmerald表达超过背景水平，表明该生物传感器对L-色氨酸具有优异特异性（图2F）。因此，我们设计了一种高灵敏度、高效的L-色氨酸检测生物传感器，可用于大规模TPH文库的高通量筛选。
3.3 液滴优化
DTSP平台由三个微流控单元组成，包括流动聚焦液滴生成、液滴显微注射和荧光激活液滴分选装置（图S3）。为确保99%的占据液滴含有单个大肠杆菌细胞，根据泊松分布（μ = 0.1）生成液滴。使用表达绿色荧光mEmerald蛋白的DB3细胞对此进行了经验确认（图3A）。在37°C孵育12小时后，共包封的液滴被细胞完全填充，证明液滴环境支持大肠杆菌的长期培养（图3B）。此外，荧光报告蛋白成功表达，液滴可根据荧光强度进行分类（图3C，视频S1）。
我们还检测了液滴在高温下的稳定性。结果发现，液滴在45°C孵育24小时后保持完整性（图3D）。这使得基于TPH活性和热稳定性的液滴分选成为可能。补充视频可在https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.117072获取。
3.4 DTSP的优化与评估
合适的底物浓度可以增大EPB中不同TPH突变体之间的活性差异，从而提高分离的效率和准确性。为确定最佳底物浓度，我们构建了EPB1-5菌株，每个菌株在不同组成型启动子控制下表达CviPAH基因，表达水平从高到低不等（图2E）。这些菌株对L-色氨酸的相对活性也从高到低（图4A）。
随后使用DB3评估EPB1-5在L-色氨酸浓度300-900 mg/L范围内的活性范围。结果显示，添加500 mg/L L-色氨酸时，不同相对活性的EPB菌株之间的荧光差异变得更加明显，有利于液滴分选（图4B）。
为评估DTSP的分离效率，我们通过按1:10:10:10:10的比例组合EPB1-5生成了混合CviPAH液滴文库（图4C）。将液滴注入分选芯片，根据荧光强度进一步分选，最高0.5%富集率，分选阈值为6（图4D）。在荧光显微镜下分别计数阳性和阴性液滴。结果表明，使用DTSP可以从高度复杂的混合文库中收集活性最高的前2.4% CviPAH细胞（分选前后p < 0.0001）（图4E）。令人欣慰的是，经过一轮DTSP分选后，EPB1细胞群体增加了约33倍。
【数据】TrpR2(L41M)突变体：90 mg/L色氨酸时荧光降低3倍；DB3动态荧光输出：L-Trp增至500 mg/L时减弱约25倍；液滴生成：泊松分布μ=0.1；液滴稳定性：45°C、24h保持完整；底物浓度优化：500 mg/L L-Trp；混合文库比例：1:10:10:10:10；分选阈值：6；富集率：最高0.5%；阳性收集率：前2.4%高活性细胞（p < 0.0001）；EPB1细胞群体富集：约33倍
讨论与解读
本研究成功构建了基于细菌生物传感器与液滴微流控的筛选平台（DTSP），并在TPH突变体筛选中展现出显著优势。采用产酶菌与检测菌分离的双菌株策略，有效避免了传感器元件与靶酶文库共宿主所导致的细胞过载和代谢干扰问题，提升了筛选过程的准确性和效率。利用DTSP结合迭代饱和突变策略，获得了具有改良工业相关特性的TPH突变体。所得M4-1变体（D129L/Q132M/P103A/T236K）在活性显著提高的同时兼具优异的热稳定性。结构分析和分子动力学模拟揭示，突变扩大了底物结合口袋并增强了结构刚性，在很大程度上解释了酶活性和热稳定性的提升。本研究为色氨酸羟化酶变体的筛选提供了实用工具，也为工业酶的筛选建立了新框架。未来，DTSP平台的通用性将进一步在工业催化剂的定向进化或以色氨酸为核心代谢物的代谢通路编程中得到展示。
编译者解读
本研究最值得关注的设计思路是将"产酶-检测"功能拆分至两个独立菌株，以液滴为微型反应器实现功能耦合——这种空间隔离策略有效规避了传感器与靶酶共表达时的代谢负担问题，对合成生物学中"感知-响应"回路的设计具有方法论参考价值。M4-1突变体在活性和热稳定性上的双重复合提升，也提示迭代饱和突变结合液滴筛选是获取多性状协同优化酶的有效路径。不过，本研究目前仍以模式菌株和单一靶酶为验证对象，DTSP在复杂工业底物环境中的适用性及放大可行性，原文尚未涉及，值得后续工作进一步探索。
参考来源
Li H. Programming a bacterial biosensor for directed evolution of tryptophan hydroxylase via high-throughput droplet sorting. Biosensors and Bioelectronics, 2025. DOI: 10.1016/j.bios.2024.117072
DOI: 10.1016/j.bios.2024.117072