来源：A coupled fluorescence assay for high-throughput screening of polyurethane-degrading enzymes（Journal of Hazardous Materials）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
聚氨酯（PU）塑料废弃物的全球性累积亟待解决方案，酶法解聚为PU废弃物资源化提供了可行路径，但缺乏可靠的高通量筛选（HTS）方法长期制约该领域发展。本研究开发了一种整合化学定义型聚己二酸乙二醇酯-PU（PEA-PU）底物与灵敏荧光检测级联的HTS分析方法。酶解后PEA-PU释放乙二醇（EG），经双酶系统转化为试卤灵荧光信号，实现了PU降解的快速定量与分子水平监测。利用已知PU降解酶ICCM和BaCut1验证了方法的准确性，并成功从BaCut1突变体文库中筛选出高效降解突变株。
研究背景
塑料污染对生态系统和人类健康构成严峻挑战。聚氨酯广泛应用于泡沫（床垫、保温材料）、弹性体（鞋底、医疗器械）和耐用消费品（汽车部件、合成革），但其回收率极低，环境持久性强。酶法解聚作为PU废弃物资源化的新兴策略受到关注，然而该领域进展有限——主要瓶颈在于缺乏能在工业条件下高效降解PU的酶，而现有酶筛选方法在预测准确性和实用性方面存在明显缺陷。使用低分子量模型底物（如对硝基苯酯或氨基甲酸酯）的常规方法往往无法预测酶对真实聚合态PU的活性，导致假阳性误导酶发掘方向；以工业PU材料（泡沫、薄膜、弹性体）为底物虽更具实际相关性，但其异质性和缓慢的降解动力学使其不适合高通量筛选。因此，开发一种兼具材料相关性与高通量兼容性的筛选方法成为当务之急。
研究方法
2.1 材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯并按原样使用。羟基封端的聚己二酸乙二醇酯（PEA，Mn ≈ 1000 g/mol，CAS No. 24938–37–2）、4,4′-亚甲基双（苯基异氰酸酯）（MDI，CAS No. 101–68–8）和无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF，CAS No. 68–12–2）购自阿拉丁工业公司（中国上海）。聚酯PU泡沫购自大工泡沫有限公司（中国南通）。刃天青（≥98%，CAS No. 550–82–3）和来自克氏梭菌的黄递酶（3.0–20.0 units/mg蛋白，CAS No. 9001–18–7）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺，>98%，CAS No. 53–84–9）购自Roche Diagnostics GmbH（德国曼海姆）。聚氨酯降解酶ICCM和BaCut1按前述方法制备。BaCut1基于Blastobotrys sp. G-9的报道序列（DOI:10.1016/j.jhazmat.2024.134493），经密码子优化、合成（北京擎科生物科技有限公司）后克隆至pET28a表达载体。ICCM（工程化LCC变体；F243I/D238C/S283C/N246M；DOI:10.1038/s41586–022–04599-z）和来自产气肠杆菌的甘油脱氢酶（GldA）取自实验室库存；GldA的表达与纯化按5.2.4节所述流程进行。所有其他常规化学品、缓冲液组分（如Tris碱、NaCl、咪唑）和耗材均购自Sigma-Aldrich。超纯水（18.2 MΩ·cm）使用Milli-Q® Integral水纯化系统（Merck Millipore，美国）制备。黑色平底低容积96孔板购自Corning®（美国纽约州康宁），用于荧光测量。
【数据】PEA分子量：Mn ≈ 1000 g/mol；MDI：CAS No. 101–68–8；黄递酶：3.0–20.0 units/mg蛋白；刃天青纯度：≥98%；NAD⁺纯度：>98%；超纯水电阻率：18.2 MΩ·cm
2.2 方法
#### 2.2.1 PEA-PU薄膜的合成
PEA在使用前于120 °C真空干燥1 h。在氮气吹扫的三颈烧瓶中，PEA和MDI以NCO:OH当量比1:1溶解于无水DMF（10% w/v）中。反应混合物在干燥氮气气氛下于70 °C搅拌1 h。将所得粘稠预聚物浇铸到PTFE模具中，于60 °C真空干燥24 h，得到厚度约0.2 mm的均匀透明薄膜。薄膜在使用前储存于干燥器中。
【数据】干燥温度：120 °C；时间：1 h；NCO:OH当量比：1:1；DMF浓度：10% w/v；反应温度：70 °C；反应时间：1 h；成膜干燥温度：60 °C；时间：24 h；膜厚：约0.2 mm
#### 2.2.2 冷冻研磨PEA-PU粉末的制备
为实现微孔板中快速可重复的酶-底物接触，通过低温加工将PEA-PU薄膜转化为粉末状底物。简要步骤如下：将PEA-PU薄膜切成小片，在液氮中预冷冻3 h，然后立即在低温条件下使用研磨机进行冷冻研磨，以防止热软化和颗粒融合。所得粉末保持干燥，在密闭容器中升温至室温以尽量减少水分凝结，并在使用前储存于干燥器中。
【数据】液氮预冷冻时间：3 h；研磨条件：低温
#### 2.2.3 结构与热性能表征
¹H NMR谱使用Bruker Avance III 400 MHz波谱仪记录，以DMSO-d₆为溶剂。化学位移参照残留溶剂峰δ 2.50 ppm。ATR-FTIR光谱使用配备Hyperion II显微镜的Bruker Vertex 70 V FTIR光谱仪（Bruker，德国）获得，分辨率为4 cm⁻¹，每样品扫描32次。差示扫描量热（DSC）测量在DSC 2500（TA Instruments，美国特拉华州纽卡斯尔）上进行。约5 mg PEA-PU薄膜密封在带匹配盖的铝制Tzero™坩埚中。样品在–50 °C平衡1 min，以10 °C min⁻¹升温至200 °C，保持1 min，以相同速率冷却至–50 °C，然后再次升温至200 °C。使用第二次加热扫描的热谱图进行分析以消除热历史效应。玻璃化转变温度由第二次加热迹线中热容台阶的中点确定。SEM分析用于评估酶解前后的表面形态。样品溅射镀铂薄层以确保导电性。使用Hitachi SU3900扫描电子显微镜在10.0 kV加速电压、5.4 mm工作距离、×500放大倍数、二次电子（SE）模式下成像。比例尺设置为100 μm。
【数据】¹H NMR频率：400 MHz；FTIR分辨率：4 cm⁻¹；扫描次数：32次；DSC样品量：约5 mg；DSC温度程序：–50 °C→200 °C（10 °C/min）；SEM加速电压：10.0 kV；工作距离：5.4 mm；放大倍数：×500
#### 2.2.4 蛋白表达与纯化
##### 2.2.4.1 常规His6标签表达与Ni亲和纯化
本研究重组表达并纯化了酶GldA、ICCM和BaCut1。每种酶的相应基因克隆至pET28a(+)表达载体，该载体带有C端His₆标签用于亲和纯化。所得质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞。蛋白表达时，培养物在含50 μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中于37 °C剧烈振荡培养，直至OD₆₀₀达到0.6–0.8。随后以终浓度0.2 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白合成，培养物继续在16 °C孵育16–20 h。孵育后，通过离心（4000 × g，30 min，4 °C）收集细胞，细胞沉淀重悬于裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl）中。细胞在冰上超声破碎，粗裂解液通过高速离心（30,000 × g，30 min，4 °C）澄清以去除细胞碎片。澄清上清液上样至预先用裂解缓冲液平衡的Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和柱（Cytiva）。用含20 mM咪唑的相同缓冲液洗涤柱以去除非特异性结合蛋白。目标His标签蛋白随后用含300 mM咪唑的缓冲液洗脱。洗脱级分使用Amicon® Ultra-15离心过滤器（10 kDa MWCO，Merck Millipore）脱盐并浓缩。最终蛋白样品的纯度通过SDS-PAGE确认，浓度使用NanoDrop™ 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）在280 nm处测定。
【数据】卡那霉素浓度：50 μg/mL；诱导温度：37 °C→16 °C；IPTG浓度：0.2 mM；诱导时间：16–20 h；离心：4000 × g，30 min，4 °C；裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl；高速离心：30,000 × g，30 min，4 °C；洗涤咪唑浓度：20 mM；洗脱咪唑浓度：300 mM
##### 2.2.4.2 基于cSAT2.0的无标签酶制备（用于高通量筛选）
为实现高通量筛选酶的快速制备，目标蛋白以N端cSAT2.0标签融合形式表达，其中cSAT2.0标签通过pH响应型intein与目标酶连接。对于96深孔板HTS规模制备，大肠杆菌BL21(DE3)培养物在每孔1 mL LB中于相同诱导条件下生长（5.2.4.1节）。通过离心（4000 × g，20 min，4 °C）收集细胞。沉淀使用BeyoLytic细菌活性蛋白提取试剂（Beyotime，P0013Q）裂解，该试剂可实现一步提取；按制造商说明裂解15 min。裂解液离心（4000 × g，20 min，4 °C）以压实不溶性物质。去除上清液，沉淀用Buffer B1（20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，1 mM EDTA，pH 8.5）洗涤两次。洗涤后的沉淀重悬于150 µL Buffer B2（40 mM Bis–Tris，2 mM EDTA，300 mM NaCl，pH 6.2）中，于25 °C孵育24 h以触发intein介导的切割并释放目标酶。
【数据】培养体积：1 mL/孔；离心：4000 × g，20 min，4 °C；裂解时间：15 min；Buffer B1：20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，1 mM EDTA，pH 8.5；Buffer B2体积：150 µL；Buffer B2组成：40 mM Bis–Tris，2 mM EDTA，300 mM NaCl，pH 6.2；切割温度：25 °C；切割时间：24 h
##### 2.2.4.3 摇瓶规模蛋白表达（用于cSAT处理：BaCut1及其变体）
为获得足够量纯化酶用于生化表征，BaCut1及其变体以N端cSAT2.0标签融合形式表达。大规模培养在含400 mL LB培养基（补充50 μg/mL卡那霉素）的摇瓶中进行。重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株最初在37 °C、200 rpm振荡培养。当OD₆₀₀达到0.6–0.8时，温度降至18 °C，加入IPTG至终浓度0.2 mM诱导蛋白表达。诱导24 h后，通过离心（4000 × g，20 min）收集细胞。
【数据】培养体积：400 mL LB；卡那霉素：50 μg/mL；培养温度：37 °C→18 °C；转速：200 rpm；IPTG浓度：0.2 mM；诱导时间：24 h；离心：4000 × g，20 min
研究结果
3.1 PEA-PU的合成与表征
为开发PU降解酶的定量分析方法，我们设计了一种化学定义明确且易于合成的新型聚合底物。该聚合物以PEA为软段。其酯键水解产生两种明确产物：乙二醇（EG）和己二酸（AA）。两者均可高可靠性地定量。具体而言，PEA-PU通过一步溶剂型逐步增长聚合合成（图1A）。所得聚合物溶液浇铸成具有高光学透明性和均匀性的薄膜（图1B）。这种光学质量反映了优异的宏观均匀性，有利于重复测定中酶-底物的一致相互作用。
为确认聚合物的化学组成，我们进行了¹H NMR分析。¹H NMR谱（图1C）显示三个诊断区域，明确确认了聚酯-氨酯主链结构：（i）氨基甲酸酯N–H质子位于δ 9.63 ppm；（ii）MDI硬段的芳香族和桥接亚甲基质子分别位于δ 7.07–7.35和3.78 ppm；（iii）乙二醇单元的O-连接亚甲基质子位于δ 4.18–4.29 ppm，己二酸酯段的脂肪族亚甲基质子位于δ ~2.3和~1.5 ppm。这些清晰可归属的信号证明聚合物结构中氨基甲酸酯键和酯键均成功形成，为精确分析酶促降解提供了结构基础。
通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）实现了互补的结构验证（图1D；图S1）。光谱显示所有预期特征吸收：（i）1725 cm⁻¹处的强酯C=O伸缩振动，（ii）3320 cm⁻¹处的宽氨基甲酸酯N–H伸缩振动，（iii）1530 cm⁻¹处的酰胺II带（C–N伸缩），以及（iv）1240 cm⁻¹处的酯C–O伸缩振动。这些特征与氨基甲酸酯和酯基的参考光谱高度一致，支持了聚合物的预期化学结构。
为进一步验证材料性能，我们使用差示扫描量热（DSC）表征了合成PEA-PU的热行为。DSC结果显示PEA-PU呈无定形热塑性行为，玻璃化转变温度约为–17.6 °C（半高法测定，图S2）。在200 °C以下未观察到熔融转变。该热学特征确认了无结晶域的存在，使该材料特别适用于酶促降解研究。
综合来看，这些结果表明PEA-PU是一种结构均匀、化学定义明确的聚合物，合成与表征简便。该材料光学透明且具有独特的波谱特征，便于分析追踪。更重要的是，PEA-PU密切复现了消费后PU废弃物的结构和化学特性，使其成为高度代表性的模型系统。这些性质确立了PEA-PU作为酶促降解研究的理想模型底物，同时也作为开发稳健PU降解分析的可重复标准化平台。
【数据】¹H NMR特征峰：δ 9.63 ppm（N–H）、δ 7.07–7.35和3.78 ppm（MDI）、δ 4.18–4.29 ppm（EG单元）、δ ~2.3和~1.5 ppm（己二酸酯段）；FTIR特征峰：1725 cm⁻¹（酯C=O）、3320 cm⁻¹（N–H）、1530 cm⁻¹（酰胺II）、1240 cm⁻¹（C–O）；玻璃化转变温度：约–17.6 °C；熔融转变：200 °C以下未观察到
3.2 PEA-PU的酶促降解
在全面表征PEA-PU的结构和理化性质后，我们使用两种充分表征的聚酯水解酶评估了其酶促可降解性：ICCM（工程化叶堆角质酶变体）和BaCut1（来自Blastobotrys sp. G-9的角质酶）。两种酶均具有PU降解能力，先前研究报道ICCM在其各自最佳条件下比BaCut1表现出更高的聚酯水解活性。因此，我们以PEA-PU为模型底物，考察这种已知活性差异能否被可靠复现，评估其作为标准化酶性能比较平台的潜力。
PEA-PU薄膜与每种酶在其最佳条件下（ICCM为70 °C，BaCut1为37 °C）孵育36 h。酶处理引起薄膜显著的形态变化，从初始透明状态转变为不透明和碎裂形态（图2A）。相比之下，对照样品未显示结构或光学变化，证明降解完全依赖酶的作用。
为考察表面水平的酶促降解，我们通过扫描电子显微镜（SEM）分析PEA-PU薄膜。未处理薄膜表面光滑均匀，而酶处理样品表现出显著的表面侵蚀（图2A）。ICCM处理诱导了明显的降解特征，包括深坑和多孔结构，而BaCut1处理引起的表面破坏较温和。这些不同的形态模式反映了两种酶之间催化效率的差异。
FTIR的进一步结构分析提供了额外信息（图2B）。与未处理PEA-PU相比，酶处理样品表现出：（i）O–H/N–H伸缩带（3200–3500 cm⁻¹）变宽且略有增强，与酯键水解产生的含羟基链端官能团贡献增加一致；（ii）酯羰基（~1725 cm⁻¹）和C–O–C伸缩（~1100 cm⁻¹）带强度显著降低，确认了聚酯链段的断裂。
为表征可溶性降解产物，我们对反应上清液进行了色谱分析。PU单体AA通过HPLC定量，EG通过气相色谱检测。两种单体仅存在于酶处理样品中，阴性对照中无可检测水平。值得注意的是，观察到的AA:EG摩尔比（约1:1）与PEA-PU水解的理论化学计量一致，其中每个酯键断裂产生等摩尔的AA和EG（表S1）。这种化学计量一致性确立了AA产生作为酶促降解过程中EG释放的稳健定量指标。
随后使用凝胶渗透色谱（GPC）定量酶处理后聚合物分子量的变化。未处理PEA-PU呈高分子量分布，主保留时间约8.5 min。酶促降解后，分布向更高保留时间移动。具体而言，ICCM处理后主峰移至约10.0 min，BaCut1处理后移至约9.2 min（图2C），与较低分子量片段的形成一致。ICCM处理导致数均分子量（Mn）降低67.9%，重均分子量（Mw）降低47.3%（图2D），表明大量碎裂为较小寡聚物。BaCut1引起相对较小但仍显著的Mn降低（约28.2%）和Mw降低（约48.5%）。相应的多分散指数（PDI）值见图S4。这些分子水平的变化与SEM观察到的不同表面侵蚀模式一致。
【数据】孵育时间：36 h；ICCM温度：70 °C；BaCut1温度：37 °C；FTIR变化：3200–3500 cm⁻¹增强、~1725 cm⁻¹和~1100 cm⁻¹降低；AA:EG摩尔比：约1:1；GPC主峰：未处理约8.5 min、ICCM约10.0 min、BaCut1约9.2 min；ICCM处理后Mn降低：67.9%；ICCM处理后Mw降低：47.3%；BaCut1处理后Mn降低：约28.2%；BaCut1处理后Mw降低：约48.5%
讨论与解读
本研究开发了一种整合化学定义型PEA-PU底物与酶促级联的HTS分析方法，将化学计量释放的EG转化为灵敏荧光信号。该分析与传统分析技术（如HPLC）显示出极佳的相关性，在可靠性相当的前提下具备高通量兼容性的显著优势，克服了传统劳动密集型方法的局限。本工作的关键创新在于底物设计——与Impranil DLN等专有底物（组成不明、降解途径模糊）不同，PEA-PU体系建立了清晰的结构-活性关系，将特定聚合物键直接与其降解产物（AA和EG）关联。这种机制明确性不仅支持对酶机制的深入探究，也确保了测量结果在不同酶和变体间的可解释性和可比性。凭借这一结构真实的筛选工具，研究团队有效表征了BaCut1饱和突变文库，成功鉴定出对合成PEA-PU和商业PU泡沫均具有增强水解活性的变体。
编译者解读：该研究精准回应了塑料降解酶工程中长期存在的"筛选通量与底物相关性不可兼得"困境。PEA-PU底物的化学定义性使产物定量与结构-活性关系解析成为可能，而荧光级联检测则赋予其微孔板高通量能力——这一组合策略在合成生物学酶挖掘领域具有范式意义。从应用角度看，以EG释放量作为通用定量指标的设计简洁而巧妙，为其他聚酯降解酶的定向进化提供了可迁移的筛选框架。值得关注的是，cSAT 2.0无标签蛋白表达系统与96深孔板流程的整合，使突变体文库的制备-筛选周期大幅缩短。局限在于，PEA-PU仍属模型底物，其降解速率与真实PU废弃物（含添加剂、交联结构）之间的差距需要更多案例数据来弥合；此外，荧光检测对有色或浑浊反应体系的耐受性也有待验证。
参考来源
Yang L. A coupled fluorescence assay for high-throughput screening of polyurethane-degrading enzymes. Journal of Hazardous Materials, 2026. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2026.141400
DOI: 10.1016/j.jhazmat.2026.141400