来源：Construction of a high-throughput cell-free system for screening thermostable laccase with redox-responsive hydrogel beads（Journal of Bioscience and Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
耐热酶在工业应用中价值巨大，传统热稳定性筛选依赖微孔板法，但文库规模随突变位点增加呈指数增长时，试剂消耗和成本难以承受。本研究将水凝胶微珠与无细胞蛋白合成（CFPS）整合，构建了一套高通量筛选系统，以两种热稳定性迥异的漆酶为模型，验证了该系统可基于热稳定性可靠区分酶种，为耐热酶的定向进化提供了低成本、可扩展的新方案。
研究背景
工业生物催化对耐热酶的需求持续增长，但传统微孔板筛选法在文库规模扩大时面临试剂消耗大、成本高的瓶颈。液滴微流控技术虽能降低试剂用量并实现规模化，但构建耐热兼容的筛选系统需在高温条件下精细优化反应条件。本研究将作者前期开发的水凝胶微珠—无细胞蛋白合成高通量筛选系统拓展至耐热酶筛选领域，利用两种热稳定性不同的漆酶评估该系统在热选择压力下区分酶种的能力。
研究方法
材料
PrimeSTAR Max DNA聚合酶购自Takara Bio Inc.（日本滋贺）。LB肉汤（Miller）购自Nacalai Tesque, Inc.（日本京都）。氯化铜、白蛋白、氨苄青霉素钠和过氧化氢购自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪）。L-半胱氨酸和乙酸购自Kishida Chemical Co., Ltd.（日本大阪）。HEPES购自Dojindo Molecular Technologies, Inc.（日本熊本）。酪酰胺信号放大底物PLUS Fluorescein检测试剂盒购自Akoya Bioscience（美国马萨诸塞州马尔伯勒）。1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇、008-FluoroSurfactant-5wtH、008-FluoroSurfactant-0.1wtH、On-chip T Buffer、On-chip Droplet Generator芯片（2D Chip-800DG）和On-chip Sort芯片（2D Chip-Z1001）购自On-chip Biotechnologies Co., Ltd.（日本东京）。定量实时PCR（qPCR）使用PowerUp SYBR Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。PUREfrex 2.0购自GeneFrontier Corporation（日本千叶）。Sunbright HGEO-200SH购自NOF Co., Ltd.（日本东京）。乙酸钠购自TCI（日本东京）。Agarose S购自Nippon Gene（日本富山）。DNA提取使用QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen，荷兰芬洛）。PCR引物由FASMAC Co., Ltd.（日本神奈川）合成。
【数据】试剂来源：Takara Bio、Nacalai Tesque、Fujifilm Wako、Kishida Chemical、Dojindo、Akoya Bioscience、On-chip Biotechnologies、Thermo Fisher Scientific、GeneFrontier、NOF、TCI、Nippon Gene、Qiagen、FASMAC；仪器/耗材：2D Chip-800DG、2D Chip-Z1001；试剂盒：PUREfrex 2.0、PowerUp SYBR Green Master Mix、QIAquick Gel Extraction Kit、PLUS Fluorescein检测试剂盒
重组漆酶的表达、活性及热稳定性评价
将编码TthL或NmaL的DNA片段与PUREfrex 2.0在20 mM HEPES（pH 7.4）中混合，终浓度分别为4 ng/μL和未经稀释。蛋白表达通过将混合物于37°C孵育过夜进行，各脱辅基漆酶的表达通过SDS-PAGE确认。随后加入1 mM CuCl₂，于25°C孵育1小时。全酶样品随后于25°C或60°C孵育10分钟。孵育后，反应混合物以5000 × g离心5分钟去除沉淀，收集上清液。最后，将CFPS产生的漆酶与9 mM 2,2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）溶液在20 mM乙酸盐缓冲液（pH 4.5）中反应，总体积100 μL，于37°C反应1小时。酶活性通过微板读数器测量420 nm处吸光度来评价。数据以三次独立实验的平均值±标准差表示（N = 3）。
【数据】缓冲液：20 mM HEPES（pH 7.4）；DNA终浓度：4 ng/μL；PUREfrex 2.0：未经稀释；表达温度/时间：37°C过夜；CuCl₂浓度：1 mM；铜孵育：25°C、1h；热处理：25或60°C、10 min；离心：5000 × g、5 min；底物：9 mM ABTS；反应缓冲液：20 mM乙酸盐缓冲液（pH 4.5）；反应体积：100 μL；反应条件：37°C、1h；检测波长：420 nm；实验重复：N = 3
含漆酶水凝胶微珠（HBs）的制备
水包油乳液按照作者前期报道（参考文献13）制备。将八臂PEG-SH、编码TthL或NmaL的DNA片段和PUREfrex 2.0溶解于20 mM HEPES（pH 7.4）中，终浓度分别为5 wt%、2.7 ng/μL和2/3稀释度。以样品溶液为水相制备W/O乳液，使用On-chip Droplet Generator生成，收集于管中，于37°C孵育16小时使CFPS进行。内水相通过向油相侧加入100 μL 10 mM过氧化氢并于37°C孵育1小时实现凝胶化。随后去除油相，加入400 μL 10 wt% PFO和缓冲液各一份，通过等离子体处理破乳制备HBs。所得HBs用缓冲液洗涤，然后分散于400 μL含5 mg/mL白蛋白的20 mM HEPES（pH 7.4）中。
【数据】PEG-SH浓度：5 wt%；DNA终浓度：2.7 ng/μL；PUREfrex 2.0稀释度：2/3；CFPS孵育：37°C、16h；凝胶化试剂：100 μL 10 mM过氧化氢；凝胶化条件：37°C、1h；PFO浓度/体积：10 wt%、400 μL；缓冲液体积：400 μL；分散液：400 μL 20 mM HEPES（pH 7.4）+ 5 mg/mL白蛋白
氧化还原响应HBs的荧光染色
向分散的HBs中加入1 mM CuCl₂，于25°C孵育1小时。随后HBs在管中于100 × g离心2分钟。取出200 μL上清液，替换为200 μL新鲜HEPES缓冲液洗涤HBs。此洗涤步骤重复两次。样品于25°C或60°C孵育1小时，随后HBs在管中于100 × g离心2分钟。取出200 μL上清液，替换为200 μL新鲜20 mM乙酸钠缓冲液（pH 4.5）洗涤HBs。此洗涤步骤重复两次。将荧光素工作液在扩增稀释液中稀释（1:50），取50 μL工作液加入HBs溶液。样品在旋转器上以100 rpm、37°C振荡60分钟，洗涤两次。最后，使用On-chip Sort筛选HBs以选择目标群体。
【数据】CuCl₂浓度：1 mM；铜孵育：25°C、1h；离心：100 × g、2 min；洗涤体积：200 μL替换；热处理：25或60°C、1h；缓冲液：20 mM乙酸钠（pH 4.5）；荧光素稀释比：1:50；工作液体积：50 μL；振荡：100 rpm、37°C、60 min；筛选设备：On-chip Sort
筛选含耐热漆酶的HBs
将NmaL和TthL基因片段按基于Nanodrop测量的摩尔比2.0:1、5.0:1、10.0:1、100:1和1000:1混合。后续qPCR定量显示实际摩尔比分别为2.3:1、5.0:1、9.9:1、136:1和1330:1。使用该混合DNA按照前述步骤进行基于酶活性和热稳定性的HBs荧光染色。使用宽流路和特定芯片分选器（2D Chip-Z1000-w150）通过On-Chip Sort筛选和选择目标HBs群体。
【数据】设计混合比：2.0:1、5.0:1、10.0:1、100:1、1000:1；实际混合比：2.3:1、5.0:1、9.9:1、136:1、1330:1；分选芯片：2D Chip-Z1000-w150
从选中的HBs中溶解和回收DNA片段
通过向样品中加入10 mM Cys溶液溶解选中的HBs。随后使用靶向T7启动子和T7终止子侧翼区域的引物组进行PCR扩增，该区域为NmaL和TthL基因片段共有。由于两个基因片段均位于这些共有序列之间，即使在混合样品中也能被同时扩增。扩增DNA片段的分布通过琼脂糖凝胶电泳验证，目标DNA使用DNA纯化试剂盒回收。
【数据】溶解试剂：10 mM Cys溶液；PCR靶标：T7启动子/终止子侧翼区域；验证方法：琼脂糖凝胶电泳；回收方法：DNA纯化试剂盒
通过定量PCR定量DNA浓度
使用qPCR评估回收DNA片段中TthL和NmaL的相对丰度。使用靶向TthL序列的特异性引物（正向引物5′-ATTTCCAGAACCAAAGGTGGTACGCTC-3′，反向引物5′-GAGCCCCCGTATGTTAAAAGTGTCG-3′）和靶向NmaL序列的引物（正向引物5′-TGCTTCAATCTCCCGAAATTCAAACGACC-3′，反向引物5′-TTCGGCATCCTGTGCGATAAGGG-3′）。通过计算回收样品中TthL与NmaL绝对量的比值来评估筛选的富集效率。
【数据】TthL正向引物：5′-ATTTCCAGAACCAAAGGTGGTACGCTC-3′；TthL反向引物：5′-GAGCCCCCGTATGTTAAAAGTGTCG-3′；NmaL正向引物：5′-TGCTTCAATCTCCCGAAATTCAAACGACC-3′；NmaL反向引物：5′-TTCGGCATCCTGTGCGATAAGGG-3′；评价指标：TthL/NmaL绝对量比值
研究结果
漆酶的无细胞表达与辅因子掺入
首先使用商品化CFPS试剂盒（PUREfrex）表达NmaL和TthL。将各漆酶基因片段与CFPS试剂混合，于37°C孵育过夜获得脱辅基漆酶。SDS-PAGE分析显示约55 kDa处出现对应各漆酶的蛋白条带，确认在无细胞系统中成功表达（图2A）。值得注意的是，NmaL条带的迁移位置略高于TthL条带，可能反映了影响电泳迁移率的等电点差异（表S1）。
接下来评估了CFPS表达的漆酶的活性和热稳定性。具体而言，在蛋白合成后将CuCl₂加入CFPS反应至终浓度1 mM，室温孵育1小时使铜配位进入酶中。这种合成后补铜策略此前已被证明能显著增强酶活性（参考文献17）。使用这些全酶，针对模型底物ABTS评估氧化活性和热稳定性（参考文献17,18）（图2B）。在37°C下，两种酶均催化ABTS氧化，确认CFPS产生的漆酶具有催化活性。未经热处理时NmaL的表观活性低于TthL，最可能的原因是蛋白表达水平低，如SDS-PAGE分析所示（图2A）。将全酶样品在60°C加热10分钟后，NmaL活性显著下降，而TthL保留活性（图2B）。结果表明，耐热的TthL在热胁迫下维持了结构完整性，而NmaL被去稳定化并丧失活性。TthL的耐热性与前期报道一致，即在60–85°C加热后仍保留活性（参考文献18）。因此，通过将CFPS表达与合成后铜掺入相结合，成功生产了两种具有不同热稳定性特征的活性漆酶——热不稳定的NmaL和耐热的TthL。
【数据】蛋白条带：约55 kDa；CuCl₂终浓度：1 mM；铜孵育：室温、1h；底物：ABTS；热处理：60°C、10 min；TthL耐温范围：60–85°C（参考文献18）；NmaL热稳定性：60°C加热10 min后活性显著下降；TthL热稳定性：60°C加热10 min后保留活性
HBs中漆酶活性的温度依赖性荧光检测
未经任何热处理的HBs首先使用基于活性漆酶的FADS检测进行测试（图3A，条件A）。含NmaL的HBs荧光标记比例为1.38%，含TthL的HBs为1.49%。两个值均高于不含漆酶的HBs观察到的比例（0.83%）。因此确认酪酰胺可根据包封漆酶的活性对HBs进行荧光标记。
接下来，在添加荧光标记底物之前，于铜离子存在下的折叠步骤中施加热处理（条件B）。结果显示，NmaL样品中荧光标记HBs的比例降至0.67%，而TthL样品中为1.41%，与未加热结果差异很小（图3B，条件B）。这一观察表明荧光标记结果与酶的热稳定性相对应。因此，通过在铜辅助折叠步骤后引入热处理，HBs可根据包封漆酶的热稳定性进行荧光标记。这些结果表明，酶的热失活行为在HBs内得以重现——热稳定性更高的酶在高温条件下保留活性以驱动荧光固定反应，而稳定性较差的酶在加热时丧失活性。因此，该检测系统可以报告漆酶活性的存在以及酶的相对热稳定性，表现为热处理后微珠中保留的荧光强度。
【数据】条件A荧光比例（NmaL）：1.38%；条件A荧光比例（TthL）：1.49%；无漆酶对照荧光比例：0.83%；条件B荧光比例（NmaL）：0.67%；条件B荧光比例（TthL）：1.41%；热处理：60°C、1h
基于热稳定性的漆酶基因高通量选择
使用上述基于HBs的荧光检测，进一步测试了HTCFS系统用于基于热稳定性进行酶基因高通量选择的兼容性。将NmaL和TthL基因以2.3:1比例混合，作为从W/O乳液到HB形成和荧光染色的一锅法流程的模板DNA。分选过程中，荧光强度超过设定阈值的HBs被选择性收集（图4）。为进行比较，进行了两次独立选择：一次在室温下（无热处理），另一次为热稳定性选择，即在添加铜补充后于60°C加热HBs。
从收集的HBs中回收的DNA片段经扩增后通过qPCR分析，定量所选群体中TthL和NmaL基因的量。结果显示，当未进行热处理的荧光选择时，TthL与NmaL的基因比（TthL/NmaL）约为1.66，与初始混合比约0.5相比，显示出对TthL的轻微偏向（表1）。相比之下，在热稳定性选择条件下，TthL/NmaL急剧上升至约10.97。因此，在分选过程中引入高温步骤强烈富集了耐热的TthL，而非热不稳定的NmaL。有趣的是，即使在对照条件下，TthL也有适度富集。这一现象可能反映了TthL固有的更高酶活性，使其即使在室温下也比NmaL具有竞争优势（图2B）。
通过在不同初始输入比（5.0:1、9.9:1、136:1和1330:1）下应用NmaL和TthL基因的混合文库，进一步评估了本筛选系统的性能（图5）。通过qPCR定量筛选前后各基因的相对丰度。结果显示，即使在初始比稀释至9.9:1时，单轮筛选也能有效富集TthL。在稀释文库（136:1和1330:1）的情况下，单轮筛选不足以实现TthL的大量富集。然而，在两个独立实验中，TthL的相对量均较初始文库有所增加（图5，插图）。这些观察表明，重复多轮筛选可进一步富集TthL，达到足以满足筛选目的的水平。总体而言，该混合文库实验证明HTCFS平台可以从异质群体中可靠富集耐热酶，突显了其在定向进化应用中的潜力。
【数据】初始混合比（TthL/NmaL）：约0.5（即NmaL:TthL = 2.3:1）；无热处理筛选后TthL/NmaL：约1.66；热稳定性筛选后TthL/NmaL：约10.97；测试初始比：5.0:1、9.9:1、136:1、1330:1；单轮筛选有效富集上限：9.9:1；稀释文库（136:1和1330:1）：单轮筛选后TthL相对量增加但富集不充分
讨论与解读
本研究成功建立了整合CFPS与HBs的漆酶活性及热稳定性选择系统。表达后补铜使催化活性且耐热的漆酶得以生产，FITC标记的酪酰胺在HBs内提供了可靠的荧光检测。使用混合DNA文库，证明了基于HBs的筛选在热选择条件下有效富集了编码耐热漆酶的基因，验证了基于热稳定性的酶选择的可行性。该平台将生物合成技术与材料工程相结合，有望进一步与机器学习辅助蛋白设计和基于下一代测序的分析等新兴策略整合，加速酶性能改进并拓展定向进化研究中功能层面的理解。
编译者解读
该研究的技术亮点在于将氧化还原响应水凝胶微珠与无细胞表达系统巧妙耦合——过氧化氢触发的PEG-SH交联使蛋白合成与固定化在同一微滴内完成，免去了传统筛选中的细胞培养和裂解步骤。以两种热稳定性差异明确的漆酶为模型，用荧光信号直观映射酶在热处理后的活性残留，逻辑清晰。不过，单轮筛选在极端稀比文库（136:1以上）中富集能力有限，需多轮迭代，通量优势可能被稀释；此外，荧光阈值设定依赖经验，未来若引入液滴数字PCR或NGS直接读取基因型，有望突破当前灵敏度瓶颈。
参考来源
Orita K. Construction of a high-throughput cell-free system for screening thermostable laccase with redox-responsive hydrogel beads. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2026.02.008
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2026.02.008