来源：High-throughput screening coupled with laboratory adaptive evolution to enhance acid-tolerance and succinic acid production of Actinobacillus succinogenes（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
琥珀酸是C4平台化合物，全球年需求超270万吨，但2024年底全球产能仅13万吨/年，缺口巨大。本研究针对天然高产菌株产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）耐酸性差、产率受限的问题，开发了基于pH指示剂溴甲酚紫的高通量筛选方法，结合561天实验室适应性进化，获得耐酸高产菌株S5-79。该菌株在5 L发酵罐中、pH 5.8条件下产琥珀酸108 g/L，产率0.82 g/g，较野生型分别提升87.8%和74.5%，且41小时内产量即达100 g/L。
研究背景
琥珀酸作为C4平台化合物，是重要的有机和食品原料，被列为未来最具价值的12种生物精炼产品之一。目前超过70%的琥珀酸用于可生物降解塑料聚丁二酸丁二醇酯（PBS）的生产。全球琥珀酸年市场需求超过270万吨，但截至2024年底，全球年产能仅为13万吨，供需缺口巨大。以生物质为碳源、通过发酵固定CO₂合成琥珀酸，是当前最具环境优势的生产方式，但发酵产量和产率仍需提升，亟需开发高产菌株以降低成本、推动工业化生产。常用于代谢工程改造生产琥珀酸的模式微生物包括大肠杆菌、解脂耶氏酵母、酿酒酵母和谷氨酸棒杆菌，利用这些模式菌株通过代谢通量调控、跨膜运输工程和能量/氧化还原供给调控，已实现超过100 g/L的琥珀酸产量。与模式微生物相比，A. succinogenes作为天然高产菌株具有独特优势，但其耐酸性不足导致中和剂消耗量大，限制了代谢工程改造空间。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
将A. succinogenes接种于含3 mL TSB培养基（胰蛋白胨17 g/L、大豆蛋白胨3 g/L、葡萄糖2.5 g/L、NaCl 5 g/L、K₂HPO₄ 2.5 g/L，115 °C灭菌30 min）的5 mL试管中，37 °C培养36 h进行活化，制备一级种子液。以2%接种量转接至含100 mL TSB培养基的250 mL三角瓶中，37 °C、250 rpm培养12 h，获得二级种子液。琥珀酸发酵时，A. succinogenes培养于100 mL复合发酵培养基中（玉米浆10 g/L、酵母提取物10 g/L、NaH₂PO₄ 1.01 g/L、Na₂HPO₄ 0.31 g/L、NaCl 1.0 g/L、MgCl₂·6H₂O 0.2 g/L、CaCl₂·2H₂O 0.2 g/L、乙酸钠1.5 g/L、MgCO₃ 80 g/L、葡萄糖80–135 g/L、微量元素溶液100 μL/L）。微量元素溶液含生物素200 mg/L、叶酸200 mg/L、硫胺素500 mg/L、核黄素500 mg/L、烟酸500 mg/L、泛酸盐500 mg/L、对氨基苯甲酸500 mg/L、硫辛酸500 mg/L、VB₁₂ 10 mg/L和VB₆ 1 mg/L。厌氧摇瓶发酵时，灭菌前补加MgCO₃和2×浓缩复合培养基，灭菌后无菌加入葡萄糖储备液，用无菌水调至总体积。二级种子液以10%（v/v）接种量接入复合培养基，37 °C厌氧培养72 h。随后在5 L生物反应器中进行放大发酵。
【数据】培养基：TSB（胰蛋白胨17 g/L、大豆蛋白胨3 g/L、葡萄糖2.5 g/L、NaCl 5 g/L、K₂HPO₄ 2.5 g/L）；灭菌：115 °C、30 min；活化：37 °C、36 h；二级种子：37 °C、250 rpm、12 h、接种量2%；发酵培养基：玉米浆10 g/L、酵母提取物10 g/L、MgCO₃ 80 g/L、葡萄糖80–135 g/L；接种量10%（v/v）；厌氧发酵：37 °C、72 h
2.2 高通量筛选方法
将产琥珀酸A. succinogenes单菌落接种于96深孔板中培养24 h。随后，将200 μL种子培养液转移至含2 mL复合发酵培养基的48深孔板中，厌氧发酵48 h。发酵结束后，使用ST 16R冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific，中国）在3900 rpm离心10 min。取上清液20 μL，经10倍稀释后与2 μL pH指示剂（溴甲酚紫）混合，用酶标仪（Synergy H1多功能酶标仪，BioTek Instruments，美国）测定吸光度。高产琥珀酸菌株的初筛基于吸光度测定——在溴甲酚紫检测中，琥珀酸滴度越高，吸光度值越低。初筛入选菌株在含100 mL复合发酵培养基的250 mL厌氧瓶中进一步复筛，培养72 h。两个筛选阶段均监测600 nm处光密度（OD600），并以野生型菌株作为对照。由于MgCO₃沉淀会影响OD600测定，向样品中缓慢滴加稀硫酸并快速混匀，直至无沉淀可见，然后测定OD600。
【数据】96深孔板培养：24 h；48深孔板发酵：2 mL培养基、48 h；离心：3900 rpm、10 min；指示剂：溴甲酚紫；初筛样品：20 μL上清液10倍稀释+2 μL指示剂；复筛：250 mL厌氧瓶、100 mL培养基、72 h；OD600测定前处理：稀硫酸滴加至无沉淀
2.3 *A. succinogenes*的实验室适应性进化
适应性进化始于将A. succinogenes WT-K67单菌落接种于2 mL pH 6.3的TSB培养基中，37 °C厌氧培养24 h。随后以2%接种量转接至新鲜pH 6.3 TSB培养基中，在相同条件下培养。通过这种连续转接策略，细胞在pH 6.3条件下持续适应。适应过程中监测细菌生长，每轮传代结束时测定OD600值。当未观察到絮状聚集体且继续培养不再使OD600升高时，培养物进入下一较低pH阶段。完成pH 6.3适应后，选择pH 6.3条件下生长性能最佳的菌株作为后续pH 6.1适应的接种物，最终建立pH 5.8条件下的实验室适应。为监测培养物纯度，每10天进行16S rRNA测序，并制备甘油菌种保存。
【数据】起始pH：6.3；培养：37 °C、24 h；接种量：2%；适应阶段：pH 6.3→6.1→5.8；纯度监测：每10天16S rRNA测序
2.4 摇瓶及5 L生物反应器发酵优化
采用厌氧摇瓶培养优化发酵条件。按单因素逐一优化法依次进行：首先，葡萄糖浓度在25、50、75、100、125和150 g/L下测试；其次，pH调节剂MgCO₃在20、40、60、80和100 g/L下评估；第三，添加干玉米浆粉（总蛋白>40%；Macklin Biochemical Co., Ltd.）5、10和20 g/L考察氮源补充对琥珀酸产量的影响；最后，玉米浆（白利度20–24°Bé，总氮≥0.6%，乳酸≥5.0%；山东恒仁工贸集团有限公司）浓度在20、30、40、50、60、70和80 g/L下优化。补料分批发酵在5 L生物反应器中进行，使用摇瓶实验获得的最优培养基配方。初始工作体积为2 L。发酵在37 °C、搅拌速度150 rpm、10%（v/v）接种量条件下进行，整个发酵过程持续通入CO₂维持厌氧环境。pH通过补加碱液在线监测和控制。氨水控pH发酵中，初始补加50 g/L MgCO₃，通过补加氨水将A. succinogenes WT-K67的pH维持在6.8、A. succinogenes S2-109的pH维持在6.3。葡萄糖初始浓度设为50 g/L，通过间歇补加800 g/L葡萄糖储备液将葡萄糖维持在10–50 g/L范围内。NaOH控pH发酵中，以5 M NaOH替代氨水。
【数据】葡萄糖浓度测试：25、50、75、100、125、150 g/L；MgCO₃测试：20、40、60、80、100 g/L；干玉米浆粉：5、10、20 g/L；玉米浆：20–80 g/L；5 L反应器：37 °C、150 rpm、接种量10%、初始体积2 L；氨水控pH：WT-K67 pH 6.8、S2-109 pH 6.3，MgCO₃ 50 g/L；葡萄糖：初始50 g/L，流加800 g/L储备液维持10–50 g/L；NaOH控pH：5 M NaOH
2.5 代谢物检测
通过紫外可见分光光度计（UV-1800，Avanti Instruments）测定600 nm光密度（OD600）监测细菌生长。琥珀酸定量时，取1 mL发酵液在12,000 rpm离心3 min。上清液用10 mmol/L硫酸稀释，经0.22 μm滤膜过滤后，采用高效液相色谱（HPLC；Agilent 1260 Infinity II）分析。分离使用HPX-87H有机酸柱（Bio-Rad，美国），以5 mmol/L H₂SO₄为流动相，流速0.6 mL/min，柱温50 °C。采用示差折光检测器检测。
【数据】生长监测：OD600；样品处理：1 mL发酵液、12,000 rpm、3 min；稀释：10 mmol/L硫酸；过滤：0.22 μm滤膜；HPLC条件：HPX-87H柱、5 mmol/L H₂SO₄、流速0.6 mL/min、柱温50 °C、示差折光检测
研究结果
3.1 高通量筛选方法的建立
高浓度有机酸通常会降低溶液pH。作为A. succinogenes的主要发酵产物，琥珀酸显著降低发酵液pH，这为开发基于pH的筛选方法以获得高产菌株提供了理论依据。由于pH指示剂随pH变化呈现不同的颜色和吸光度变化，可利用这一原理建立高产琥珀酸菌株的高通量筛选策略。为模拟发酵后条件，在复合发酵培养基中制备了不同琥珀酸浓度的溶液。结果表明，当培养基中琥珀酸浓度从0 g/L增加至9 g/L时，pH从8.5逐渐降至5.6。相应地，评估了四种pH指示剂——百里酚蓝、溴甲酚绿、甲基红和溴甲酚紫——以确定颜色和吸光度变化最显著的一种，其pH转变范围介于8.5至5.6之间。结果显示，溴甲酚紫表现出最清晰的颜色变化，是最合适的候选指示剂。
为进一步验证，将2 µL（1/100，v/v）溴甲酚紫加入含0–9 g/L琥珀酸的培养基稀释液中，并制备pH 4–7缓冲液系列作为颜色参考。当琥珀酸浓度为6 g/L时，溶液颜色开始从紫色变为黄色。对测定板进行全波长扫描发现，溴甲酚紫的特征吸收峰位于590 nm。吸收峰随琥珀酸浓度增加而逐渐降低，且无波长偏移。因此，测定590 nm处吸光度，同时立即用HPLC定量同一溶液中的琥珀酸浓度。与HPLC数据比较，590 nm吸光度与琥珀酸浓度之间呈线性关系（R² = 0.96），确认了适用于后续高通量筛选的强线性相关性。基于这些结果，建立了一种简便的高通量筛选方法。该方法以溴甲酚紫为pH指示剂，在微孔板中与发酵样品反应，然后在590 nm处测定吸光度。它能够快速筛选大量样品，显著减少随机突变筛选的工作量，提高筛选效率并减少人工操作。
【数据】琥珀酸浓度：0–9 g/L；pH范围：8.5→5.6；指示剂筛选：百里酚蓝、溴甲酚绿、甲基红、溴甲酚紫；溴甲酚紫加入量：2 µL（1/100，v/v）；颜色转变点：6 g/L琥珀酸；特征吸收峰：590 nm；线性回归：R² = 0.96
3.2 高通量筛选获得高性能*A. succinogenes*起始菌株
由于代谢异质性——携带相同遗传信息的单个细胞可能表现不同表型——选择高产量A. succinogenes单菌落作为实验室适应性进化的起始菌株至关重要。为获得兼具高活力和琥珀酸生产能力的菌株，使用上述高通量方法对野生型A. succinogenes菌落进行初筛。共培养528个单菌落，在48深孔板中厌氧发酵48 h。向培养上清液中加入溴甲酚紫指示琥珀酸积累量，使用回归方程Y = –0.10344X + 1.15425估算滴度。选择9株颜色变化明显且OD590值较低的菌株进行进一步评估。
随后，分别通过HPLC和溴甲酚紫法对琥珀酸进行定量。两种方法比较显示，48深孔板中OD590读数与实际滴度之间存在强线性相关性（R² = 0.96907）。这9株候选菌株在含100 mL发酵培养基的250 mL血清瓶中进一步进行三天发酵评估。最终，菌株WT-K67获得最高滴度42.37 g/L且标准偏差最小，因此被选为后续旨在提高耐酸性的适应性进化的亲本菌株。
【数据】初筛菌落数：528个；发酵：48深孔板、48 h；回归方程：Y = –0.10344X + 1.15425；入选菌株：9株；HPLC与溴甲酚紫法相关性：R² = 0.96907；复筛：250 mL血清瓶、100 mL培养基、3天；WT-K67滴度：42.37 g/L
3.3 *A. succinogenes* WT-K67的实验室适应性进化
Guettler等人报道A. succinogenes对葡萄糖具有广泛耐受性且适应宽pH范围。高效的琥珀酸生产通常发生在pH 6.0至7.2之间，但pH低于5.5时生长和合成显著受抑制。本研究中观察到A. succinogenes在低pH条件下能在TSB培养基中生长。然而，细菌培养物中检测到大量漂浮碎片，推测是酸性环境导致细胞结构破坏进而引起聚集。针对这一现象，实验室适应性进化已被证明能提高菌株的耐酸性，从而促进低pH条件下有机酸合成。为确定合适的适应性进化起始点，将A. succinogenes WT-K67在pH 7.0、6.5和6.3的TSB培养基中培养。pH 7.0和6.5的培养物浊度正常，而pH 6.3时细胞破碎和漂浮聚集明显。基于此观察，A. succinogenes WT-K67菌株的适应性进化从pH 6.3开始。
具体操作中，每天进行连续传代，每次转接前记录OD600。在pH 6.3下连续进化194天后，不同代次间出现生长差异。前50代生长逐步改善，之后趋于稳定，在第135代达到峰值。早期代次可见明显絮凝，第135代后减少，表明已获得对pH 6.3的耐受性。选择生长最佳的培养物作为后续pH 6.1进化的起始菌株。pH 6.1进化持续146天。最初50代生长下降，随后在低水平波动，第105代后逐渐恢复，在第145代达到最大值。第145代菌株随后用于启动pH 5.8下的适应性进化，历时221天。适应前120天，菌株维持低生长OD600，增殖缓慢。约180代后，细胞生长开始逐渐增加，表明适应性进化有效改善。至第210代，菌株达到最高生长OD600。
低pH条件下的实验室适应性进化可产生耐酸群体，但进化培养物是异质的，需要筛选兼具高耐酸性和高琥珀酸产量的菌株。在关键代次——pH 6.3-55、pH 6.3-135、pH 6.1-65、pH 6.1-145和pH 5.8-210——中生长改善的菌株在微孔板中进行高通量筛选。初筛后，每个进化阶段选出的8–9株高产菌株进一步在厌氧摇瓶发酵中评估生物量生长、琥珀酸产量及其主要副产物乙酸，其他副产物未评估。原始WT-K67菌株产琥珀酸38.0 g/L，产率0.62 g/g葡萄糖。所有进化菌株的生长和生产力均优于对照。在41株筛选菌株中，17株的滴度和产率较WT-K67提高20%以上。值得注意的是，源自pH 5.8-210代次的菌株S5-79获得了最高琥珀酸滴度59.1 g/L，产率为0.82 g/g葡萄糖。
【数据】pH 6.3适应：194天；pH 6.1适应：146天；pH 5.8适应：221天；关键代次：pH 6.3-55、pH 6.3-135、pH 6.1-65、pH 6.1-145、pH 5.8-210；WT-K67：38.0 g/L、0.62 g/g葡萄糖；41株筛选菌株中17株滴度和产率提高>20%；S5-79：59.1 g/L、0.82 g/g葡萄糖；进化总时长：561天
讨论与解读
A. succinogenes是天然高产琥珀酸菌株，但其有限的耐酸性导致中和剂消耗量大，限制了代谢工程改造空间。本研究开发了基于pH指示剂的高通量筛选方法，并将其整合到561天的实验室适应性进化流程中，成功分离出具有低pH条件下稳健生长和高效琥珀酸合成能力的耐酸高产菌株。最优菌株S5-79在5 L发酵罐中、pH 5.8条件下达到108 g/L琥珀酸产量和0.82 g/g葡萄糖产率（分别为亲本菌株在pH 6.8条件下的187.8%和174.5%）。值得注意的是，S5-79在41 h内即达到100 g/L。总体而言，进化菌株为改善低pH生产、减少中和剂用量和提升工艺经济性提供了实用路径，且无需依赖遗传工具。
【数据】S5-79：108 g/L、0.82 g/g葡萄糖、pH 5.8、5 L发酵罐；为亲本pH 6.8条件下的187.8%（产量）和174.5%（产率）；100 g/L达成时间：41 h
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于将pH指示剂比色法转化为高通量筛选工具——以OD590吸光度线性关联琥珀酸浓度（R²=0.96），使大规模突变体筛选从"逐一测HPLC"变为"一块板读数"，大幅压缩筛选周期。561天的阶梯式降pH适应策略（6.3→6.1→5.8）也体现了耐心型进化的价值：非基因工程手段即可获得产量提升87.8%的菌株，对工业化菌株改良具有直接参考意义。值得注意的是，S5-79在pH 5.8条件下达到108 g/L，较野生型在pH 6.8下的产量更高，这意味着中和剂用量可显著降低——对PBS生物塑料的碳减排目标而言，这一进展具有实际经济价值。局限在于进化耗时长达561天，且未评估其他副产物，后续若结合基因组重测序解析耐酸突变位点，可望进一步缩短进化周期。
参考来源
Zhou S. High-throughput screening coupled with laboratory adaptive evolution to enhance acid-tolerance and succinic acid production of Actinobacillus succinogenes. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135603
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135603