Fluoro4Graphene

来源：Fluoro4Graphene: A fluorogenic high-throughput screening platform for property engineering of graphene binding peptides（Talanta）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

石墨烯与蛋白质的相互作用是生物传感和生物界面工程的核心问题，但高通量定量检测手段长期缺失。本研究报道了Fluoro4Graphene平台——一种三步法荧光筛选系统，利用Yersinia mollaretti植酸酶（YmPh）作为报告酶，将4-甲基伞形酮磷酸酯转化为荧光产物4-甲基伞形酮，从而定量评估蛋白质与石墨烯的结合能力。该系统无需蛋白纯化，直接从大肠杆菌裂解液出发，变异系数约17%，并在靶向Macaque histatin-1的定向进化中成功鉴定出表面覆盖度提升1.44倍的优良变体。

研究背景

石墨烯凭借其巨大的比表面积和与生物分子相互作用的能力，在生物技术和生物医学领域应用广泛。对于生物界面和功能涂层等应用场景，定量理解蛋白质与石墨烯的结合至关重要。然而，能够以高通量方式定量、可重复地测定蛋白质与石墨烯结合的实验方法仍然有限。石英晶体微天平（QCM-D）、原子力显微镜（AFM）和表面等离子体共振（SPR）等生物物理方法，在典型定向进化周期内难以筛选数百个样品。荧光筛选方法虽常用于高通量蛋白质工程，但石墨烯会猝灭荧光，使得基于GFP融合的检测策略在石墨烯表面失效。因此，亟需不依赖石墨烯表面荧光信号的替代报告系统——Fluoro4Graphene平台应运而生。

研究方法

2.1 材料

所有化学品购自AppliChem GmbH（德国达姆施塔特）、Carl Roth GmbH（德国卡尔斯鲁厄）和Sigma-Aldrich Chemie GmbH（德国施泰因海姆），纯度均为分析纯或更高。寡核苷酸购自Eurofins Scientific SE（德国埃伯斯贝格），为无盐形式。与辣根过氧化物酶偶联的GFP多克隆抗体（货号：600-103-215）购自Thermo Fisher Scientific Inc.（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）；酶及酶混合物购自New England Biolabs GmbH（德国法兰克福）或PCR Biosystems（英国伦敦）。聚合酶链式反应纯化和质粒提取试剂盒购自Macherey-Nagel GmbH & Co. KG（德国迪伦）。PP/聚烯烃0.45 μm孔径PTFE滤板购自Merck Millipore（美国马萨诸塞州伯灵顿），PS 96孔微量滴定板购自Greiner Bio-One GmbH（德国弗里肯豪森）。金SPR芯片购自BioNavis Ltd（芬兰坦佩雷），表面覆盖单层石墨烯薄膜，晶粒尺寸最大20 μm，通过CVD法在铜箔（铜厚度18 μm）上合成（每批次拉曼光谱：I(G)/I(2D) < 1.25；I(D)/I(G) < 0.1，基底为90 nm SiO2/Si；SiO2/Si上方块电阻：350 ± 40 Ohms/sq（1 cm × 1 cm）），石墨烯购自Graphenea, Inc.（西班牙圣塞巴斯蒂安）。石墨烯分散液（1 mg/mL DMF溶液，石墨烯制备方法：电化学剥离，AFM片径：供应商标注为微米级，氧含量：7.5%（XPS测定）（C/O比：12.3），拉曼I_D/I_G比：0.4，方块电阻4.8 kΩ/sq，平均层数1-3层）购自Merck KGaA（德国达姆施塔特）。

【数据】石墨烯分散液浓度：1 mg/mL（DMF）；氧含量：7.5%；C/O比：12.3；拉曼I_D/I_G：0.4；方块电阻：4.8 kΩ/sq；平均层数：1-3；CVD石墨烯晶粒尺寸：≤20 μm；铜箔厚度：18 μm；I(G)/I(2D)：<1.25；I(D)/I(G)：<0.1

2.2 菌株构建

质粒pALXtreme:YmPh-17xHelix-TEV-LCI、pALXtreme:YmPh-17xHelix-TEV-Cecropin A和pALXtreme:YmPh-17xHelix-TEV-Tachystatin A2为本课题组已有质粒，详见参考文献[60]。质粒pALXtreme:YmPh-17x-Helix-TEV由pALXtreme:YmPh-17x-Helix-TEV-LCI生成；pALXtreme:YmPh-17x-Helix-TEV-CBP1由pALXtreme:YmPh-17x-Helix-TEV通过定点突变生成，使用New England Biolabs GmbH（德国法兰克福）的KLD酶试剂盒。质粒pALXtreme:YmPh-17x-Helix-TEV-MacHis通过pALXtreme:YmPh-17xHelix-TEV-LCI与pET28(+):StrepII-eGFP-17xHelix-TEV-MacHis在大肠杆菌DH5α[62]（购自Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄）中的同源重组获得。E. coli BL21-Gold (DE3) lacIQ1（实验室内部菌株）按照New England Biolabs GmbH（德国法兰克福）提供的热激方案转化上述质粒。引物及蛋白质氨基酸序列见Tables S1和S2。

【数据】菌株：E. coli BL21-Gold (DE3) lacIQ1；转化方法：热激法；质粒：pALXtreme系列

#### 2.2.1 MacHis文库构建

YmPh-MacHis文库通过易错PCR（epPCR）生成，使用Table S1所述引物、Taq聚合酶和0.3 mM MnCl2对编码MacHis的基因进行30轮多样性引入。PCR片段作为大引物，以pALXtreme:YmPh-17x-Helix-TEV-MacHis为模板进行MEGAWHOP方法[63]。

【数据】MnCl2浓度：0.3 mM；PCR轮数：30；方法：epPCR + MEGAWHOP

2.3 MacHis文库的表达

从琼脂平板挑取新鲜转化的单菌落，接种至Greiner Bio-One GmbH（德国弗里肯豪森）的96-F底孔板中，每孔含150 μL LB培养基（酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨5 g/L、NaCl 5 g/L），添加50 μg/mL羧苄青霉素。每块板除变体样品外，另含4个阳性对照（YmPh-MacHis WT）、4个阴性对照（YmPh，不含MBP）和4个无菌对照。预培养在Infors AG（瑞士博廷根）HT Multitron摇床中进行（900 rpm，8 h，37°C，60%湿度）。将5 μL预培养物转移至含145 μL ZYM培养基[64]（含50 μg/mL羧苄青霉素）的96-V底孔板中，在Infors AG（瑞士博廷根）HT摇床中培养（900 rpm，16 h，37°C，60%湿度），然后用Eppendorf SE（德国汉堡）5810R离心机离心收集菌体（3200 rcf，10 min，4°C）。弃去上清，菌体沉淀保存于−20°C备用。

【数据】LB培养基：酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨5 g/L、NaCl 5 g/L；羧苄青霉素：50 μg/mL；预培养：900 rpm，8 h，37°C，60%湿度；转移体积：5 μL；ZYM培养基体积：145 μL；表达培养：900 rpm，16 h，37°C，60%湿度；离心：3200 rcf，10 min，4°C

2.4 YmPh-MacHis变体的表达与纯化

从冷冻培养物直接接种5 mL含50 μg/mL羧苄青霉素的培养基。培养物在Infors AG（瑞士博廷根）HT摇床中培养（200 rpm，8 h，37°C）。表达阶段，将2 mL预培养物转移至含200 mL ZYM培养基[99]（含50 μg/mL羧苄青霉素）的摇瓶中，在Infors AG（瑞士博廷根）HT摇床中培养（200 rpm，16 h，37°C）。使用Thermo Fisher Scientific Inc. Sorvall RC 6+离心机（4000 rcf，10 min，4°C）（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）离心收集细胞。弃去上清，菌体沉淀保存于−20°C备用。纯化时，将沉淀重悬于10 mL Tris-HCl缓冲液（pH 8，50 mM）中，使用Sonics & Materials, Inc.（美国康涅狄格州牛顿）的Vibra Cell VCX 130超声处理器进行超声破碎（振幅65%，5 min，15 s/15 s开关循环）。裂解液在Eppendorf SE（德国汉堡）5810R离心机中离心（11,000 rcf，30 min，4°C）。上清经0.2 μm孔径滤膜过滤后，上样至1 mL Ni-IDA 1000柱（Macherey-Nagel GmbH & Co. KG，德国迪伦）。弃去流穿液，用5 mL含20 mM咪唑的Tris-HCl缓冲液（pH 8，50 mM）洗涤柱子。弃去流穿液，用3 mL含400 mM咪唑的Tris-HCl缓冲液（pH 8，50 mM）洗脱蛋白。洗脱液上样至平衡好的PD-10 Sepharose柱（Cytiva，美国马萨诸塞州马尔伯勒），用3 mL Tris-HCl缓冲液（pH 8，50 mM）洗脱。蛋白保存于4°C备用。

【数据】培养体积：5 mL（预培养）/200 mL（表达）；羧苄青霉素：50 μg/mL；转速：200 rpm；时间：8 h/16 h；温度：37°C；离心：4000 rcf，10 min，4°C；超声：65%振幅，5 min，15 s/15 s循环；离心：11,000 rcf，30 min，4°C；Ni-IDA柱：1 mL；洗涤：5 mL 20 mM咪唑；洗脱：3 mL 400 mM咪唑；脱盐：PD-10柱，3 mL Tris-HCl（pH 8，50 mM）

2.5 Fluoro4Graphene系统：包被、结合与检测

I 包被： 0.45 μm孔径PTFE滤板（Merck Millipore，美国马萨诸塞州比勒里卡）用含5% BSA的TBST（50 mM Tris-HCl pH 8，150 mM NaCl，0.05% Tween）封闭，4°C孵育16 h。使用真空泵（350 mbar，15 s）抽滤去除封闭液，随后加入100 μL浓度为20 μg/mL的石墨烯（溶于含5% BSA的TBST中），真空抽滤通过滤板。石墨烯表面在65°C下干燥3 h。

II 结合： 菌体沉淀通过加入150 μL含溶菌酶（1.5 mg/mL）和DNase1（25 μg/mL）的5% BSA TBST溶液重悬并裂解，孵育（37°C，900 rpm，1 h）。裂解液在Eppendorf SE（德国汉堡）5810R离心机中离心（3200 rcf，30 min，4°C）。取澄清上清稀释（175 μL 5% BSA TBST + 75 μL裂解液）后加入石墨烯包被板中。结合反应在摇床中孵育（15 min，500 rpm，25°C）。用500 μL Tris-HCl缓冲液（pH 8，50 mM）洗涤三次，每次洗涤（5 min，500 rpm，25°C），去除过量蛋白。

III 检测： 向板中加入150 μL浓度为1 mM的4-MUP（溶于50 mM醋酸钠缓冲液，pH 5），每行间隔10 s依次加样。反应孵育（20 min，500 rpm，25°C）。取100 μL溶液转移至黑色PS 96孔板。使用BMG LABTECH GmbH（德国奥尔滕贝格）的CLARIOstar Plus酶标仪测量荧光（激发：360-20 nm/发射：450-30 nm，增益500）。为归一化信号，取5 μL未稀释粗裂解液加入新的黑色96孔板，与145 μL浓度为1 mM的4-MUP（溶于50 mM醋酸钠缓冲液，pH 5）混合。反应和测量条件同上。粗裂解液的值用于归一化Fluoro4Graphene系统各孔的值。

【数据】BSA封闭浓度：5%（w/v）；封闭时间：16 h，4°C；抽滤条件：350 mbar，15 s；石墨烯包被浓度：20 μg/mL（100 μL/孔）；干燥：65°C，3 h；溶菌酶：1.5 mg/mL；DNase1：25 μg/mL；裂解孵育：37°C，900 rpm，1 h；离心：3200 rcf，30 min，4°C；稀释比例：175 μL缓冲液 + 75 μL裂解液；结合反应：15 min，500 rpm，25°C；洗涤：3次 × 500 μL，每次5 min，500 rpm，25°C；4-MUP浓度：1 mM（150 μL/孔）；检测反应：20 min，500 rpm，25°C；转移体积：100 μL；荧光测量：Ex 360-20 nm/Em 450-30 nm，增益500；归一化用粗裂解液：5 μL

2.6 表面等离子体共振（SPR）测量

SPR金芯片购自BioNavis Ltd.（芬兰坦佩雷）。单层石墨烯（铜箔上，Graphenea Inc.，西班牙圣塞巴斯蒂安）通过改进的PMMA辅助湿法转移方法转移到镀金SPR传感器芯片上。

【数据】SPR芯片：金芯片，BioNavis；石墨烯转移方法：PMMA辅助湿法转移（改进版）

研究结果

Fluoro4Graphene系统的设计目标是提供一个稳健的分析筛选平台，用于研究石墨烯结合，该平台不依赖抗体等额外生物试剂进行检测，也不需要气相沉积等复杂方法来制备石墨烯表面。该筛选方法基于三个步骤（图1a），仅需标准实验室设备，任何生物技术学家或材料科学家均可轻松采用，将材料科学与蛋白质工程两个学科结合起来。

第一步为板包被（I），在96孔板中形成多层石墨烯表面。具体而言，聚四氟乙烯（PTFE）滤板用含牛血清白蛋白（BSA）的缓冲液（5%（w/v））封闭过夜，以防止Fluoro4Graphene测定过程中发生非特异性蛋白结合。封闭后，将新鲜制备的石墨烯分散液（1 mg/mL电化学剥离石墨烯的DMF悬浮液，用缓冲液按1:40比例稀释）通过真空抽滤方式包被到膜上。随后，板在65°C下干燥3 h以蒸发残留DMF；去除DMF可确保MBP结合和YmPh活性均不受影响。

第二步为样品施加（II），样品中的MBP-YmPh融合蛋白与石墨烯表面结合。可使用纯化蛋白或澄清的大肠杆菌裂解液（用含BSA的缓冲液稀释）。

第三步为信号检测（III），通过检测产生的4-MU荧光（λex/em 372/445 nm；图1b）确定固定化YmPh的量。归一化荧光定量可直接反映石墨烯表面蛋白质的相对量（与非功能化表面相比，或不同蛋白质之间）。但只能间接推断定义测量条件下结合强度的差异。每孔蛋白量（nmol/孔）可通过与酶的标准反应曲线比较来定量（见标准反应曲线；图S4）。直接定量结合强度或亲和力不可行，必要时需在Fluoro4Graphene筛选系统完成后采用进一步的定量分析方法。通过将上清液转移至黑色96孔微量滴定板，可避免石墨烯对荧光的猝灭。

【数据】石墨烯分散液稀释比例：1:40；干燥温度：65°C，3 h；4-MU荧光波长：λex/em 372/445 nm

3.1 合适石墨烯结合MBP的鉴定

为验证测定的稳健性和可靠性，选择一组多样的MBP融合YmPh来鉴定石墨烯结合肽。所选MBP包括：天蚕素A（CeCa）（Hyalophora cecropia）（P01507）[68]、液相色谱峰I（LCI）（Bacillus subtilis）（P82243）[69]、猕猴组蛋白1（MacHis）（Macaca fascicularis）（P34084）[56]、鲎素A2（TA2）（Tachypleus tridentatus）（Q9U8X3）[70]，以及一种已知的碳结合肽（CBP1）[43]。通过所开发的测定方法，从澄清裂解液中分析这些MBP与石墨烯的结合（图2）。

基于芳香族氨基酸数量较多（应通过π-π堆积与石墨烯结合），预期MacHis和CBP1在石墨烯表面的保留量相对较高。结果符合预期，MacHis显示出最高的荧光信号，但令人意外的是，CBP1未显示任何信号。此前，CBP1的结合性质是在平面表面或单壁碳纳米管上研究的，与本系统所用表面不同[43,71–74]。此外，已报道的该肽主要在无融合蛋白状态下表征，与本文方法不同[43]。为确保较低的结合不是由植酸酶融合引起，测试了基于ELISA方法的eGFP融合，结果显示CBP1的eGFP融合同样仅显示弱结合（图S5）。

基于MacHis与YmPh和eGFP融合蛋白的结果，MacHis被鉴定为合适的石墨烯结合肽，并用于后续所有测量以开发和验证Fluoro4Graphene筛选系统。

【数据】MBP种类：CeCa、LCI、MacHis、TA2、CBP1；MacHis荧光信号最高；CBP1无信号；eGFP融合验证：CBP1弱结合

3.2 Fluoro4Graphene筛选系统的稳健性

对于高通量筛选测定方法的开发，变异系数（CV）是关键参数，因为它决定了可可靠检测的性能改进下限。若CV过高，实验噪声和信号波动会掩盖微小改进——当基线结合水平已经相当可观、进一步增强受限于完全表面覆盖时，这一问题尤为突出。因此，CV是评估筛选方法是否适合定向进化活动的重要指标。

高通量筛选可快速概览大量样品，通常随后使用高灵敏度的成熟分析方法对单个变体进行验证。CV <20%对于这些系统而言处于可接受且可比较的范围内，尤其是在生物技术领域[58,59]。在此，准确性不仅受技术误差来源影响，还受单个生物学重复或变体间的表达水平或裂解差异影响[58,59]。因此，只要波动不妨碍改进型结合体的鉴定，就不需要更低的CV。

所基于的4-甲基伞形酮磷酸酯（4-MUP）检测化学体系已成熟，因此未做大幅修改[75]；仅降低了醋酸钠缓冲液的复杂度和浓度，以减少缓冲液引起的背景信号并提高YmPh活性（图S6a）。通过测试10至150 μL裂解液与石墨烯的结合，确定了获得良好信噪比的最佳裂解液体积。所有测试体积均在线性范围内（图3a），且背景信号比随裂解液体积增加而降低。为在线性范围内获得一致的信号定量，高通量筛选中每孔使用75 μL裂解液（96孔板格式）。

为评估实际筛选条件下的测定变异性，制备了一整块96孔板的MacHis野生型（WT）-YmPh生物学重复样品，经培养、裂解、澄清后测量YmPh活性。随后将裂解液转移至石墨烯包被板，按上述方法进行测定。通过用先前测量的相应澄清裂解液信号进行归一化，最小化了由表达和细胞裂解效率差异引起的信号波动。归一化信号强度表现出的表观变异系数（CV）为16.6%，背景校正后（"真实"）CV为17.9%（考虑了与未包被板的非特异性结合）（图3b）。

为进一步解析测定变异性的来源，进行了详细研究，测量了Fluoro4Graphene系统的技术误差。比较了两块整板——一块石墨烯包被板和一块未包被板——的技术重复。石墨烯包被板的CV为14%，未包被板为3%（图3c），表明变异性的主要来源是石墨烯包被而非荧光检测或液体处理。这些结果表明，归一化有效补偿了生物学变异性。相比之下，技术变异性导致电化学剥离石墨烯薄片形成的非平面滤膜表面存在相当程度的异质性，从而构建了多层石墨烯表面。

因此，Fluoro4Graphene系统可作为快速实用的方法用于鉴定单个蛋白质或变体。如需更多信息...

【数据】CV值：表观16.6%、背景校正后17.9%；石墨烯包被板技术CV：14%；未包被板技术CV：3%；最佳裂解液体积：75 μL/孔；测试体积范围：10-150 μL

3.3 YmPh-MacHis变体的筛选

（注：该部分原文节选未完整提供，以下为可获得的忠实翻译内容）

基于Fluoro4Graphene系统的稳健性验证，研究团队将其应用于定向进化活动，以改进MacHis变体的石墨烯结合能力。对含有840个变体的YmPh-MacHis文库进行了筛选。图4展示了筛选结果，包括最佳变体的多序列比对和归一化荧光值。

【数据】筛选文库规模：840个变体

3.4 变体的结合特性表征

对选定的改进变体进行了进一步表征。图5显示了YmPh-MacHis WT（●）、10C5（▲）和10H3（■）对pH和NaCl浓度的结合依赖性。结合后的纯化蛋白（初始浓度200 nM）通过Fluoro4Graphene系统在不同pH条件（柠檬酸盐缓冲液50 mM pH 4、5、6；Tris-HCl缓冲液50 mM pH 7、8、9；CAPS缓冲液）和不同NaCl浓度下检测。

【数据】蛋白初始浓度：200 nM；pH范围：4-9（柠檬酸盐缓冲液50 mM pH 4、5、6；Tris-HCl缓冲液50 mM pH 7、8、9；CAPS缓冲液）

图6显示了改进变体YmPh-MacHis 10C5（▲）和10H3（■）与野生型（●）的比较表征。(a) 使用Fluoro4Graphene系统定量YmPh-MacHis WT的标准反应曲线，5 μL不同浓度（50、100、200、300、400、500、600、750和1000 nM）的纯化蛋白...

【数据】标准曲线蛋白浓度：50、100、200、300、400、500、600、750、1000 nM

3.5 定向进化验证

最佳变体YmPh-MacHis H14R的增强石墨烯结合能力通过表面等离子体共振（SPR）独立验证。石墨烯表面覆盖度从106.19 ng/cm²增加到154.10 ng/cm²。此外，该测定可靠地解析了序列依赖性结合趋势——改进变体显示出正电荷残基数量增加、负电荷残基数量减少的特征。

【数据】SPR验证表面覆盖度：从106.19 ng/cm²增至154.10 ng/cm²；改进倍数：1.44倍（Fluoro4Graphene筛选测定）

讨论与解读

Fluoro4Graphene荧光高通量筛选平台能够在明确的筛选条件下定量评估石墨烯结合肽和蛋白质。该方法不依赖气相沉积或其他复杂仪器，可在标准实验室环境中直接实施。重要的是，样品可直接从大肠杆菌裂解液分析，无需纯化，大幅简化了工作流程并提高了通量。

Fluoro4Graphene的性能在首次针对YmPh-MacHis的定向进化活动中得到验证，该活动包含840个变体。筛选鉴定出改进变体YmPh-MacHis H14R，其增强的石墨烯结合能力通过表面等离子体共振独立确认——石墨烯表面覆盖度从106 ng/cm²增加到154 ng/cm²。此外，该测定可靠地解析了序列依赖性结合趋势，改进变体显示正电荷残基数量增加、负电荷残基数量减少。

编译者解读： 该平台的价值在于解决了石墨烯荧光猝灭这一长期痛点——通过将可溶性荧光产物转移至次级板检测，巧妙绕过了材料本身的物理干扰。从合成生物学应用角度看，将报告酶融合策略与材料结合肽筛选结合，为功能化生物界面的理性设计提供了通用工具。840个变体的筛选规模虽不算巨大，但已足以验证平台在定向进化中的实用性。值得关注的是，该方法仅能间接推断结合强度差异，最终仍需SPR等正交手段确认——这提示该平台更适合作为初筛工具而非终点分析。未来若能将平台扩展到其他二维材料（如MoS₂、MXene）的结合肽筛选，其应用边界将进一步拓宽。

参考来源

Vogt I. Fluoro4Graphene: A fluorogenic high-throughput screening platform for property engineering of graphene binding peptides. Talanta, 2026. DOI: 10.1016/j.talanta.2026.130063

DOI: 10.1016/j.talanta.2026.130063