来源：Precise biosynthesis of β-1,2-glucan from cellulosic materials by in vitro metabolic engineering（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微生物细胞工厂合成结构精准的多糖（可控聚合度、低分散性）长期受制于内源代谢网络的复杂性。本研究采用体外代谢工程策略，以纤维二糖为底物，构建四酶级联体系，在pH自中和条件下实现β-1,2-葡聚糖的高效合成——产量达31.9 ± 0.4 g/L，摩尔产率93.3 ± 1.3%，聚合度可在75–531范围内精准调控，分散系数低至1.2。该策略无需辅酶或外部能量输入，直接将β-1,4糖苷键重排为β-1,2键，为木质纤维素生物质利用开辟了新路径。
研究背景
β-1,2-葡聚糖广泛存在于革兰氏阴性共生菌和致病变形菌的周质空间中，主要作为渗透调节周质葡聚糖发挥作用，也存在于绿藻小球藻细胞壁及与植物互作的真菌中。这类多糖由线性或环状β-1,2-葡聚糖组成，不同物种具有多样的β-和α-糖苷键取代模式。它们在细菌运动、细胞分裂、抗生素敏感性和生物膜形成等发育过程中扮演多重角色，并通过间接控制毒力基因表达来维持动植物病原菌的完全毒力。近年研究还系统表征了环状β-1,2-葡聚糖的超分子结构及其衍生物，揭示了其在药物增溶与稳定、对映体分离、免疫调节活性及催化现象中的潜在应用价值。
微生物细胞工厂合成结构精准多糖面临内源代谢网络复杂、产物分子量分布宽等难题。体外代谢工程通过简化途径设计和便捷的过程优化，为精准多糖合成提供了新选择。
研究方法
2.1 化学品与试剂
所有化学品均为试剂级，购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）或国药集团（中国上海），除非另有说明。大肠杆菌细胞生长和重组蛋白表达使用Luria-Bertani（LB）培养基，并添加100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素。葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶购自宁夏夏盛实业有限公司。
【数据】培养基：LB；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素；试剂来源：Sigma-Aldrich、国药集团、夏盛（宁夏）
2.2 计算机挖掘、基因表达与酶纯化
GH94家族系统发育树使用MEGA软件以邻接法构建，随后使用tvBOT进行系统发育树的美化。包含13,494条蛋白质序列的蛋白质家族IPR052047使用酶相似性工具进行序列相似性网络聚类分析。BLAST计算序列相似性和边比对分数时应用默认e值阈值。SSN以比对分数阈值120和一致性截断值40%构建。上述分析获得含1093个SOGP的序列集，用于构建比对分数阈值200、一致性截断值100%的新SSN。蛋白质结构使用AlphaFold2预测，成对结构比对使用在线工具进行。溶解度分析使用SoluProt，信号肽鉴定使用SignalP-6.0。大肠杆菌Top10用于DNA操作，大肠杆菌BL21（DE3）用于重组蛋白表达。
来自Clostridium thermocellum的纤维二糖磷酸化酶（CBP，EC 2.4.1.20）如前所述。含有来自Thermodesulfobacteriota bacterium、Thermobacillus sp. ZCTH02-B1、Geobacillus thermoglucosidasius、Methylococcus geothermalis、Clostridium thermosuccinogenes或Geobacillus subterraneus的β-1,2-寡葡聚糖磷酸化酶（SOGP）表达盒的质粒pETsumo-SOGP，经密码子优化后由Azenta（中国江苏苏州）或Atantares（中国上海）基因合成获得。携带表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）在添加适当抗生素的LB培养基中于37°C培养，直至600 nm吸光度达到0.8–1.0。重组蛋白过表达用0.01–0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在18°C诱导额外16小时。细胞于4°C离心收集，用20 mM乙酸钠缓冲液（pH 6.0）洗涤一次。细胞沉淀重悬于相同缓冲液至最终OD600为75–100，并在4°C下高压均质破碎。离心后，上清液中的目标酶通过带电荷镍树脂亲和吸附纯化。向纯化酶中加入甘油至终浓度5%，于−20°C保存备用。
【数据】培养温度：37°C；诱导条件：0.01–0.5 mM IPTG，18°C，16 h；OD600：0.8–1.0（诱导前），75–100（重悬后）；缓冲液：20 mM乙酸钠（pH 6.0）；纯化方式：镍树脂亲和吸附；保存：5%甘油，−20°C
2.3 SOGP合成方向的表征
SOGP活性测定采用标准反应体系：200 μL反应混合物含20 mM通用缓冲液（pH 6.0）、25 mM α-G1P和0.01 g/L SOGP，于50°C孵育10分钟。反应通过冰浴快速冷却终止。释放的无机磷酸盐随后使用前述比色法测定。最适pH通过在20 mM通用缓冲液中测定pH梯度（4.0–9.0）下的酶活性来确定。通用缓冲液包含20 mM乙酸钠、20 mM HEPES和20 mM Tris-HCl。温度优化实验中，反应在pH 6.0条件下于30°C至65°C范围内进行。热稳定性通过将SOGP（0.1 g/L）在20 mM乙酸钠缓冲液（pH 6.0）中于不同温度孵育后测定残余合成活性来评估。受体特异性通过将标准反应体系中的槐糖替换为以下1 mM糖溶液来确定：昆布二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、木二糖、蔗糖、麦芽糖、壳二糖、纤维二糖、乳果糖、蜜二糖、曲二糖、松二糖、乳糖和葡萄糖。以1 mM槐糖为受体的合成反应动力学分析在最适条件（50°C，pH 6.0）下进行，使用0.01 g/L PtSOGP和不同浓度的α-G1P作为供体。动力学参数通过将实验数据拟合至Michaelis-Menten方程计算获得。
【数据】标准反应：200 μL体系，20 mM通用缓冲液（pH 6.0），25 mM α-G1P，0.01 g/L SOGP，50°C，10 min；pH范围：4.0–9.0；温度范围：30–65°C；热稳定性：0.1 g/L SOGP；受体特异性：1 mM各糖；动力学：0.01 g/L PtSOGP，50°C，pH 6.0
2.4 纤维二糖合成β-1,2-葡聚糖
以纤维二糖为底物生产β-1,2-葡聚糖的反应在1.0 mL体系中进行，含25 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）、50 mM乙酸钠缓冲液（pH 6.0）、200 mM纤维二糖和0.1 mM槐糖。比较三种酶系统：（1）含2.5 U/mL CtCBP和5 U/mL PtSOGP的双酶系统；（2）含2.5 U/mL CtCBP、5 U/mL PtSOGP、100 U/mL葡萄糖氧化酶和100 U/mL过氧化氢酶的四酶系统；（3）优化系统，四酶组合进一步添加200 mM CaCO₃以维持稳定pH。所有反应均在50°C thermo-shaker中持续搅拌（650 rpm）进行。
考察影响β-1,2-葡聚糖分子量因素的系列反应在相同条件下进行，单独调整特定变量。考察CBP与SOGP比例的影响时，PtSOGP浓度固定为5 U/mL，CtCBP从1至10 U/mL变化。评估GOX影响时，CtCBP和PtSOGP浓度分别固定为2.5 U/mL和5 U/mL，GOX从10至250 U/mL变化。评估槐糖作为引物影响时，CtCBP、PtSOGP和GOX浓度分别维持在2.5 U/mL、5 U/mL和100 U/mL，槐糖浓度从0至1.0 mM系统变化。
【数据】反应体系：1.0 mL；缓冲液：25 mM磷酸钠（pH 6.0）+ 50 mM乙酸钠（pH 6.0）；底物：200 mM纤维二糖；引物：0.1 mM槐糖；温度：50°C；转速：650 rpm；酶量：2.5 U/mL CtCBP + 5 U/mL PtSOGP ± 100 U/mL GOX ± 100 U/mL CAT；CaCO₃：200 mM
2.5 β-1,2-葡聚糖、纤维二糖、葡萄糖、葡糖酸和α-G1P的测定
所有反应除非另有说明，均通过100°C热处理5分钟终止。13000g离心5分钟后，取上清液分析底物、产物和中间体浓度。纤维二糖、β-1,2-葡聚糖（以分子量162 g/mol的葡萄糖当量计算）和葡萄糖浓度通过配备Bio-Rad HPX-42A柱和示差折光检测器的HPLC测定。色谱柱于80°C，以水为流动相，流速0.5 mL/min洗脱。葡糖酸浓度通过配备Bio-Rad HPX-87H柱和示差折光检测器的HPLC测定。色谱柱于60°C，以5 mM H₂SO₄为流动相，流速0.6 mL/min洗脱。α-G1P浓度基于磷酸葡糖变位酶-葡萄糖6-磷酸脱氢酶法测定。20 μL稀释样品与α-G1P测定溶液混合，该溶液含100 mM HEPES缓冲液（pH 7.0）、5 mM MgCl₂、2 mM NAD⁺，以及各0.1 g/L的Thermococcus kodakarensis磷酸葡糖变位酶和Zymomonas mobilis葡萄糖6-磷酸脱氢酶。37°C孵育20分钟后，测量340 nm处吸光度变化（ΔA340）。用已知α-G1P浓度（0–1.0 mM）生成标准曲线，通过将ΔA340值插值至该曲线确定测试样品中的α-G1P含量。
【数据】终止条件：100°C，5 min；离心：13000g，5 min；HPLC条件：HPX-42A柱，80°C，水相，0.5 mL/min；HPX-87H柱，60°C，5 mM H₂SO₄，0.6 mL/min；α-G1P测定：100 mM HEPES（pH 7.0），5 mM MgCl₂，2 mM NAD⁺，0.1 g/L TkPGM + 0.1 g/L ZmG6PDH，37°C，20 min，ΔA340
2.6 β-1,2-葡聚糖的DPw和DPn测定
合成的β-1,2-葡聚糖的重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）和聚合物分散指数（PDI）通过凝胶渗透色谱（GPC）测定。
【数据】GPC法测定Mw、Mn、PDI（具体色谱条件原文未详述）
研究结果
3.1 纤维素到β-1,2-葡聚糖酶促途径的设计
我们设计了一条用于β-1,4-键连纤维二糖体外生物合成β-1,2-葡聚糖的ivME途径，即糖苷键重排策略。β-1,2-葡聚糖通过偶联纤维二糖磷酸化酶（CBP，EC 2.4.1.20）和β-1,2-寡葡聚糖磷酸化酶（SOGP，EC 2.4.1.333）进行生物合成。在这些连续反应中，CBP在无机磷酸盐存在下催化纤维二糖磷酸解裂解为α-G1P和α-D-葡萄糖，SOGP将葡萄糖单元从α-G1P转移至β-1,2-葡聚糖末端，释放无机磷酸盐。添加痕量槐糖作为引物。
由于葡萄糖的积累具有双重不利效应——竞争性抑制CBP并作为SOGP合成短链β-1,2-葡聚糖的新引物，因此添加了两种补充酶——葡萄糖氧化酶（GOX，EC 1.1.3.4）和过氧化氢酶（CAT，EC 1.11.1.6）以去除葡萄糖。CBP产生的α-D-葡萄糖经自发变旋作用转为β-异头物，随后被GOX氧化为葡糖酸和H₂O₂，CAT将H₂O₂分解为水和氧气。
3.2 热稳定SOGP的发现与表征
来自嗜热细菌的热稳定酶在ivME中具有独特优势，包括延长寿命、增强热稳定性和易于热处理纯化。然而，此前报道的所有三种SOGP酶均来自非嗜热菌。系统挖掘热稳定SOGP酶的过程如下。已报道的SOGP属于GH94家族，该家族包含多种裂解β-糖苷键的磷酸化酶。
使用已表征的GH94蛋白序列构建系统发育树以展示该糖苷水解酶家族的架构多样性。构建了蛋白质家族IPR052047（对应GH94）的序列相似性网络，获得含1093条序列的数据集。检查这些序列的来源生物，优先考虑来自嗜热微生物的序列，因其可能编码热稳定酶。仅鉴定出六个来自嗜热物种的SOGP候选物。与实验表征的SOGP模板（来自Lachnoclostridium phytofermentans、Enterococcus italicus和Listeria innocua的SOGP）进行的结构比对显示，所有候选物均具有高度拓扑一致性，模板建模评分>0.9，原子级均方根偏差值<2.35 Å。这些分析共同支持选择六个代表性SOGP候选物进行后续表征。
此外，SignalP-6.0信号肽预测表明六个候选蛋白均不含分泌信号。SoluProt算法溶解度评估显示预测溶解度评分较差（0–1标度上<0.4），因此采用SUMO增溶标签融合策略。表达纯化后获得五个重组蛋白，而来自Thermodesulfobacteriota bacterium的TbSOGP因与亲和树脂结合无效而未能获得。
【数据】候选物：6个嗜热SOGP；TM-score：>0.9；RMSD：<2.35 Å；溶解度评分：<0.4；纯化蛋白：5个
3.3 SOGP在β-1,2-葡聚糖生物合成中的表征
在五个纯化的重组SOGP中，来自Clostridium thermosuccinogenes的PtSOGP表现出最高活性，因此被选作后续研究对象。PtSOGP在β-1,2-葡聚糖合成方向上于50°C和pH 6.0时表现出最大活性。受体特异性分析确定槐糖为优选糖基受体（100%活性），其次是昆布二糖（3.79%）、龙胆二糖（0.18%）和葡萄糖（0.14%），对其他糖的活性可忽略不计。
动力学分析显示α-G1P的K m值为5.3 mM，k cat值为207 s⁻¹，表明PtSOGP是迄今文献报道的所有SOGP中活性最高的。其表现出卓越的热稳定性，50°C下半衰期为109小时，而在60°C下活性迅速下降，半衰期仅0.8小时。
【数据】最适温度：50°C；最适pH：6.0；受体特异性：槐糖100%、昆布二糖3.79%、龙胆二糖0.18%、葡萄糖0.14%；K m：5.3 mM（α-G1P）；k cat：207 s⁻¹；半衰期：50°C下109 h，60°C下0.8 h
3.4 纤维二糖制备合成β-1,2-葡聚糖
概念验证实验以209.4 ± 0.6 mM纤维二糖为底物，使用CtCBP和PtSOGP进行。4小时后，β-1,2-葡聚糖滴度达到峰值浓度54.3 ± 0.9 mM，对应摩尔产率26.0 ± 0.5%（mol/mol）。8小时后，β-1,2-葡聚糖浓度略降至53.4 ± 0.3 mM。与此同时，葡萄糖在整个反应过程中持续积累。
为提高β-1,2-葡聚糖产率，向体系中添加葡萄糖氧化酶（GOX）和过氧化氢酶（CAT）。然而，8小时反应后β-1,2-葡聚糖浓度（30.0 ± 0.5 mM）未能提高，原因在于pH大幅下降（从5.8 ± 0.2降至4.1 ± 0.0），抑制了酶活性。支持这一结论的是，观察到α-G1P显著积累（24.9 ± 0.7 mM），且无葡萄糖积累。
进一步添加CaCO₃自动控制反应pH后，β-1,2-葡聚糖滴度显著提高至196.7 ± 2.6 mM（相当于31.9 ± 0.4 g/L），底物为210.8 ± 1.8 mM纤维二糖，产率达93.3 ± 1.3%（mol/mol）。β-1,2-葡聚糖的平均体积生产率为25.6 mM葡萄糖当量/小时（相当于4.0 ± 0.1 g葡聚糖/L/h）。这些结果表明，结合自动pH中和的拉动策略将反应平衡推向β-1,2-葡聚糖方向，实现了接近理论产率的β-1,2-葡聚糖合成。
同时考察了β-1,2-葡聚糖的DP和PDI。在仅含CtCBP和PtSOGP的双酶系统中，合成的β-1,2-葡聚糖表现出低DP和高PDI（DPw = 33，PDI = 1.55）。补充葡萄糖氧化酶（GOX）和过氧化氢酶（CAT）后，观察到PDI显著改善，同时DP增加（DPw = 70，PDI = 1.26）。添加CaCO₃进行原位pH自调节进一步显著提高了β-1,2-葡聚糖的DP并维持低PDI（DPw = 365，PDI = 1.11）。此外，在最适条件下，β-1,2-葡聚糖的DP随时间持续增加。PDI呈轻微上升趋势，但始终保持在1.11以下。
【数据】初始底物：209.4 ± 0.6 mM纤维二糖；4 h滴度：54.3 ± 0.9 mM（产率26.0 ± 0.5%）；8 h滴度：53.4 ± 0.3 mM；加GOX/CAT后8 h：30.0 ± 0.5 mM；pH变化：5.8 ± 0.2→4.1 ± 0.0；α-G1P积累：24.9 ± 0.7 mM；加CaCO₃后：196.7 ± 2.6 mM（31.9 ± 0.4 g/L），产率93.3 ± 1.3%；生产率：25.6 mM/h（4.0 ± 0.1 g/L/h）；双酶体系：DPw=33，PDI=1.55；四酶体系：DPw=70，PDI=1.26；加CaCO₃：DPw=365，PDI=1.11
3.5 β-1,2-葡聚糖DP的精准合成
在自动pH中和条件下，合成的β-1,2-葡聚糖的DP可通过调整实验参数精确控制，包括引物浓度和酶用量。评估了CtCBP:PtSOGP比例对DP的影响。在CtCBP:PtSOGP比例为1:2时获得最高DP和最低PDI，而增加CtCBP相对于PtSOGP的比例导致DP逐渐下降。
相反，β-1,2-葡聚糖的DP随GOX用量增加而增加，表明高效去除葡萄糖对合成超长β-1,2-葡聚糖链至关重要。此外，槐糖初始浓度影响β-1,2-葡聚糖的链长。随着槐糖浓度从0增加至1000 μM，DPw从531降至75，且分散性窄（PDI <1.2）。
【数据】最佳CBP:SOGP比：1:2；GOX效应：DP随GOX增加而增加；槐糖浓度范围：0–1000 μM；DPw范围：531→75；PDI：<1.2
3.6 β-1,2-葡聚糖的化学结构表征
β-1,2-葡聚糖的化学结构通过两种独立方法验证。第一种方法使用高度特异的糖苷水解酶水解所得葡聚糖。来自Chitinophaga pinensis的β-1,2-葡聚糖酶（CpSGL）和来自Parabacteroides distasonis的外切β-1,2-寡葡聚糖槐糖水解酶（非还原端）（PdSGL）选择性水解β-1,2-葡聚糖，对其他13种测试多糖无活性。
【数据】水解酶：CpSGL和PdSGL；特异性：仅水解β-1,2-葡聚糖；对其他13种多糖无活性
（注：原文3.6节后续结构表征数据——HPLC水解产物分析、¹H NMR谱图等——在提供的节选文本中未完整呈现，具体数值原文未详述。）
讨论与解读
本研究证明，ivME系统能够以高达93.3%的摩尔产率和4.0 ± 0.1 g/L/h的快速体积生产率，将β-1,2-键连的纤维二糖生物转化为β-1,2-葡聚糖。DPw和PDI值可分别从531调至75，PDI低至1.2。ivME系统通过智能途径设计、关键酶选择和反应条件优化实现了β-1,2-葡聚糖的精准生物合成。相比之下，微生物合成多糖受限于复杂的分解代谢、合成代谢、细胞复制以及培养条件等生理因素。
残留葡萄糖浓度是影响β-1,2-葡聚糖PDI和DP值的主要因素。葡萄糖积累不仅导致SOGP催化的可逆酶促反应中β-1,2-葡聚糖合成减慢，还作为引物合成短链β-1,2-葡聚糖。为减轻葡萄糖的负面影响，补充GOX和CAT对于获得低PDI的β-1,2-葡聚糖至关重要。SOGP的选择也是关键——PtSOGP的k cat值207 s⁻¹为迄今报道最高。
编译者解读：该研究展现了体外代谢工程在精准多糖合成中的独特优势——无需辅酶循环或能量输入即可实现糖苷键重排，且产物分子量分布可达合成生物学中罕见的窄分散度（PDI低至1.1）。pH自中和策略利用CaCO₃温和调节反应环境，避免了传统酸碱滴定的波动，是工艺放大的巧妙设计。局限在于当前底物为纤维二糖而非直接利用纤维素，且酶成本可能限制工业化应用。未来若能将纤维素酶系与CBP/SOGP级联整合，或开发酶固定化技术降低用量，将推动该策略向生物质精炼实际应用迈进。
参考来源
Li Y. Precise biosynthesis of β-1,2-glucan from cellulosic materials by in vitro metabolic engineering. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.01.004
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.01.004