来源：Biochemical characterization and optimized production of Vigna angularis hemoglobin in Pichia pastoris（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
血红蛋白（HB）是提升植物基蛋白产品风味与色泽的关键添加剂。本研究从赤小豆（Vigna angularis）中鉴定出一种植物源血红蛋白VaHB，在毕赤酵母中实现异源表达，系统表征其结构、热稳定性及酶学特性，并通过多拷贝整合与血红素合成途径重构，将产量提升至117.7 mg/L。研究证实VaHB在多个维度上优于已批准使用的大豆血红蛋白（GmHB），具备成为食品级着色剂的潜力。
研究背景
全球人口增长与健康环保意识的提升推动了对肉类替代品的需求。植物基蛋白凭借高蛋白、低脂肪及环境友好的特点成为传统动物蛋白的有力替代——与传统畜牧业相比，植物基蛋白生产可减少75%用水、87%温室气体排放和95%土地占用。然而，如何在色泽、质构和风味上模拟真实肉类，仍是决定消费者接受度的关键难题。
血红蛋白作为含铁金属蛋白，由血红素和珠蛋白亚基组成，能有效改善植物基蛋白的肉色与风味。已有研究表明，添加血红蛋白可使植物基蛋白呈现接近熟牛肉的色泽，而不含血红蛋白的配方则色泽欠佳。目前，大豆血红蛋白（GmHB）已被批准作为植物基蛋白产品的着色剂，但寻找性能更优或可替代的新型血红蛋白来源，仍是领域内的研究热点。
研究方法
2.1 材料、菌株与培养条件
氯化血红素购自源叶生物科技有限公司（S19203，上海）。用于过氧化物酶活性测定的TMB辣根过氧化物酶显色液购自碧云天生物技术有限公司（P0206，上海）。牛血清血红蛋白（BsHB）购自阿拉丁生物技术有限公司（H195714，上海）。
毕赤酵母GS115（Invitrogen，北京）在YPD培养基或YPD琼脂平板上培养（20 g/L葡萄糖、20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物）。对于异源HB表达，将重组毕赤酵母GS115接种于1 mL YPD培养基中，30°C、250 rpm培养24 h，随后转接至20 mL BMGY培养基（10 g/L甘油、10 g/L酵母提取物、20 g/L胰蛋白胨、13.4 g/L YNB、4 × 10⁻⁴ g/L生物素、100 mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0），30°C、250 rpm培养。蛋白表达以1%（v/v）甲醇每24 h诱导一次，共诱导四轮。
大肠杆菌DH5α（擎科生物技术有限公司，北京）用于质粒扩增，在LB培养基（生工生物工程股份有限公司，上海）中37°C、250 rpm培养12 h。质粒提取使用质粒提取试剂盒（天根生物技术有限公司，北京）。
【数据】培养基：YPD/BMGY/LB；温度：30°C/37°C；转速：250 rpm；时间：24h/12h；甲醇诱导浓度：1%（v/v），每24h一次，共4轮
2.2 植物源HB的序列、结构与血红素结合分析
以GmHB（NCBI: NP_001235248.2）为参考，从各自全基因组序列中鉴定VaHB（NCBI: XP_017409386.1）、野生大豆HB（GsHB；NCBI: KAG4983851.1）和木豆HB（CcHB；NCBI: XP_020222796.1）的氨基酸序列。使用MEGA 7.0对VaHB及相关单体HB进行系统发育分析，并通过iTOL（https://itol.embl.de/）可视化。保守结构域通过InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）分析。多序列比对使用ClustalX 2.1进行，并用ESPript（http://espript.ibcp.fr/）可视化。
目标HB序列提交至AlphaFold2（https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb）进行三维结构预测，选取置信度最高的模型进行后续分析。从UniProt（https://www.uniprot.org/）获取血红素配体结构，使用Rosetta（https://rosie.rosettacommons.org/）将其对接至预测的HB结构。使用Discovery Studio 4.5分析血红素-珠蛋白相互作用及几何构象。此外，利用在线网站DoGSiteScorer（https://proteins.plus/）预测HB的结合口袋尺寸。
【数据】参考序列：GmHB（NP_001235248.2）；分析工具：MEGA 7.0、AlphaFold2、Rosetta、Discovery Studio 4.5、DoGSiteScorer
2.3 质粒构建
编码VaHB、GsHB、CcHB和GmHB珠蛋白的基因经密码子优化以在毕赤酵母中表达，由生工生物工程股份有限公司（上海）合成。每个携带C端His标签的优化基因片段经扩增后，使用ClonExpress Mix C115（诺唯赞生物技术有限公司，南京）连接至pPICZ载体。此外，参与血红素生物合成的HEM基因从毕赤酵母GS115的染色体DNA扩增，克隆至pUC19载体备用。本研究所用引物和质粒的详细信息见表S1和表S2。
【数据】载体：pPICZ、pUC19；引物及质粒信息：见表S1、表S2
2.4 菌株构建
通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，使用gRNA（CCTTGCCCGGTACAGGAATA）删除ku70位点，获得毕赤酵母GS115-Δku70菌株。
为实现异源HB基因在毕赤酵母中的高水平甲醇诱导表达，将VaHB、CcHB、GsHB和GmHB的编码序列分别克隆至pPICZ A载体，受强甲醇诱导型AOX1启动子控制。随后，质粒KanR-pPICZ-AOX1p-VaHB-AOX1t、KanR-pPICZ-AOX1p-CcHB-AOX1t、KanR-pPICZ-AOX1p-GsHB-AOX1t和KanR-pPICZ-AOX1p-GmHB-AOX1t经SacⅠ线性化，各取500 ng线性化质粒电转化至GS115-Δku70，构建过表达菌株VaHB、CcHB、GsHB和GmHB。
在第一轮PTVA中，质粒Amp-HygR-pPICZ-AOX1p-VaHB-AOX1t经线性化后，500 ng线性化质粒导入菌株VaHB，涂布于含500 μg/mL潮霉素（HygR）的平板，获得菌株VaHB-R2。
在第二轮PTVA中，以VaHB-R2为起始菌株进行五轮连续电转化，每轮转化后菌株在含递增HygR和G418浓度（分别为1000、1500、2000、2500和3000 μg/mL）的液体YPD中培养（30°C、24 h、220 rpm）。所得菌株涂布于含3500 μg/mL HygR和G418的琼脂平板。从HygR和G418平板中随机选取20个菌落评估VaHB表达水平。为定量HB产量，在甲醇诱导发酵4天后，测定这些菌株细胞裂解液上清在415 nm处的特征吸收。
为进一步提高VaHB产量，使用CRISPR/Cas9方法将HEM基因和额外的VaHB珠蛋白编码基因表达盒整合至VaHB-H7。此步骤中，为防止质粒构建过程中的同源重组和转化过程中的错误重组，采用组成型强启动子TEF1和异源终止子CYC1。具体而言，将线性同源臂（500 ng）AOX1p-HEM1-AOX1t、AOX1p-VaHB-AOX1t和TEF1p-VaHB-AOX1t，分别与携带引导RNA（GCAAGATGGTTAAAAGGTGA、TTTTAAGATTTCAATCTTGA和GCGGCAGTAATTGATATCGT）的Cas9质粒（500 ng）电转化至VaHB-H7，分别获得菌株VaHB-H7-pTEF1、VaHB-H7-pTEF1-pAOX1、VaHB-H7-H1和HEM1。
接下来，将TEF1p-HEM3-CYC1t（采用不同的启动子和终止子以避免同源重组）和AOX1p-HEM1-AOX1t使用引导RNA（GCAAGATGGTTAAAAGGTGA）整合至VaHB-H7-pTEF1-pAOX1，产生菌株HEM3-1。该顺序整合策略考虑了血红素生物合成酶的不同大小：第一步将大的HEM1基因与紧凑的HEM3基因配对，以最大化整合效率。
遵循相同原则，使用引导RNA CAACTCGAATTATAGTGGCG将TEF1p-HEM2-CYC1t和AOX1p-HEM12-AOX1t导入HEM3-1，获得HEM3-1-2-12。继续顺序整合TEF1p-HEM4-CYC1t和AOX1p-HEM15-AOX1t（使用引导RNA TATTAAAAAAGACGATCCCG）以生成HEM3-1-2-12-4-15，随后整合TEF1p-HEM14-CYC1t和AOX1p-HEM13-AOX1t（使用引导RNA CAACGTTGGATGCGAAACAC）产生HEM-ALL。最后，使用引导RNA（TACATGGAATAGGGTCACGT）将TEF1p-VaHB-AOX1t整合至HEM-ALL，产生HEM-ALL-Int8。菌株构建细节和菌株信息见图S1和表S3。
【数据】gRNA序列：CCTTGCCCGGTACAGGAATA等；电转化质粒量：500 ng；潮霉素浓度：500–3500 μg/mL；G418浓度：1000–3000 μg/mL；培养条件：30°C、24h、220rpm；甲醇诱导时间：4天
2.5 HB的纯化与定量
取10 mL发酵液等分试样离心，细胞沉淀重悬后用超声波破碎仪（WM-650E，韦米科技，上海）在260 W下破碎25 min。上清液按照蛋白纯化试剂盒说明书（生工生物，上海）使用Ni-NTA树脂柱纯化。随后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）评估纯化效率，蛋白浓度通过Bradford法测定。纯化蛋白用Amicon Ultra 3K离心过滤器（Millipore，达姆施塔特，德国）脱盐以去除残留盐分和杂质。
【数据】发酵液体积：10 mL；超声功率：260 W；超声时间：25 min；纯化方法：Ni-NTA柱；定量方法：Bradford法；脱盐：Amicon Ultra 3K
2.6 UV-Vis吸收光谱分析纯化HB
取200 μL纯化蛋白溶液（50 mg/L水溶液），使用多功能酶标仪（Varioskan LUX，Thermo Scientific）在300–800 nm范围内分析吸收光谱。
【数据】蛋白浓度：50 mg/L；扫描范围：300–800 nm；样品量：200 μL
2.7 圆二色光谱分析
（原文此节内容未在节选中完整呈现，以下为可获得的翻译内容）圆二色光谱用于分析纯化HB的二级结构特征。
【数据】原文未详述
2.8 过氧化物酶活性测定
使用TMB辣根过氧化物酶显色液测定纯化HB的过氧化物酶活性。
【数据】检测试剂：TMB显色液
2.9 差示扫描量热分析
使用差示扫描量热法测定纯化HB的熔解温度（Tm）。
【数据】原文未详述
2.10 统计学分析
所有实验均设三次重复，数据以平均值±标准差表示。使用t检验评估组间差异的统计学显著性，p < 0.05视为有统计学意义。
【数据】重复次数：3；显著性水平：p < 0.05
研究结果
3.1 植物源HB的序列与结构分析
为鉴定可作为GmHB替代品的植物源HB，通过单体HB的序列比对构建了系统发育树。VaHB、CcHB和GsHB与GmHB紧密聚类，序列相似性分别为82.07%、84.83%和91.67%（图2a）。结构上，四种HB均呈现六个α-螺旋、三个η-螺旋和一个保守的血红素结合结构域，其中CcHB存在一个赖氨酸到天冬酰胺的替换（图2b）。
为阐明HB珠蛋白与血红素之间的相互作用，使用AlphaFold2预测了VaHB、CcHB和GsHB的三维蛋白结构（图2c–e）。血红素与HB珠蛋白的分子对接显示，血红素结合能分别为−13.579 kcal/mol（VaHB）、−8.131 kcal/mol（CcHB）、−5.565 kcal/mol（GsHB）和−13.486 kcal/mol（GmHB），表明VaHB和GmHB对血红素具有更强的亲和力。
血红素结合口袋的比较分析显示，VaHB拥有更大的口袋（体积：370.18 ų；表面积：622.85 Ų；深度：14.44 Å），而GmHB的口袋为（体积：245.25 ų；表面积：515.67 Ų；深度：14.62 Å）（图S2）。VaHB更大的结合空腔与其更有利的血红素结合能一致。
血红素与珠蛋白之间的关键分子相互作用包括氢键（如VaHB中的His62、CcHB中的His93和GsHB中的Ser123）和疏水接触（如Phe和Leu），这与先前研究证明半胱氨酸、组氨酸和苯丙氨酸（图2c–e中红色箭头标示）参与血红素结合的结论一致。GmHB与血红素之间的相互作用与三种植物源HB中观察到的结果相似（图2f）。
上述结果表明，这些HB共享保守的结构特征并具备结合血红素的能力。其中，VaHB表现出最低的血红素结合能（−13.579 kcal/mol），提示其有潜力作为GmHB的可行替代品。
【数据】序列相似性：VaHB 82.07%、CcHB 84.83%、GsHB 91.67%；结合能：VaHB −13.579 kcal/mol、CcHB −8.131 kcal/mol、GsHB −5.565 kcal/mol、GmHB −13.486 kcal/mol；VaHB口袋：370.18 ų/622.85 Ų/14.44 Å；GmHB口袋：245.25 ų/515.67 Ų/14.62 Å
3.2 三种植物源HB的表达与鉴定
为过表达植物源HB并比较其性质与产量，将受pAOX1控制的HB表达盒通过PTVA整合至毕赤酵母。带His标签的HB以1%甲醇诱导，并经Ni-NTA层析纯化（图3a）。
目视观察，纯化的VaHB呈现明显的红色，而CcHB和GsHB溶液透明无色，提示VaHB具有作为食品着色剂的潜力（图3b）。UV-Vis光谱分析进一步确认了特征吸收峰：VaHB在415 nm、CcHB在425 nm、GsHB在410 nm处有吸收峰（图3b）。基于酿酒酵母中HB在410 nm处有吸收峰的报道，推测不同HB显示出独特的UV-Vis吸收光谱特征，这可能与血红素结合有关。
SDS-PAGE分析确认了VaHB和CcHB的纯度，两种蛋白均迁移至约15 kDa处，与预测分子量一致。相比之下，GsHB条带较弱，可能因其产量较低（图3c）。
TMB实验显示，VaHB的过氧化物酶活性（123.6 U/mg）优于CcHB（22.3 U/mg）和GsHB（8.0 U/mg），这归因于其更强的血红素亲和力和增强的抗氧化特性。纯化的VaHB、CcHB和GsHB产量分别为33.7 mg/L、14.2 mg/L和5.9 mg/L，发酵过程中获得的OD600值相近（图3d和e）。
因此，具有独特红色、更高产量和更优过氧化物酶活性的VaHB被进一步通过UV-Vis光谱、CD、TMB实验和DSC进行分析，并将其性质与天然HB进行比较。
【数据】吸收峰：VaHB 415 nm、CcHB 425 nm、GsHB 410 nm；分子量：约15 kDa；过氧化物酶活性：VaHB 123.6 U/mg、CcHB 22.3 U/mg、GsHB 8.0 U/mg；产量：VaHB 33.7 mg/L、CcHB 14.2 mg/L、GsHB 5.9 mg/L
3.3 VaHB、GmHB与BsHB的比较分析：结构、功能与热性质
为系统比较VaHB与天然HB的差异并评估其在植物基蛋白产品中的应用潜力，使用UV-Vis光谱、CD、TMB实验和DSC进行了全面表征。由于缺乏商品化GmHB标准品，构建了能够产生GmHB的毕赤酵母菌株。
SDS-PAGE分析显示分子量相当（GmHB为15.5 kDa，VaHB为15.2 kDa，BsHB为15 kDa）（图4a）。纯化的VaHB、GmHB和BsHB溶液（200 mg/L）均呈现明显的红色，其中BsHB颜色最深，其次为VaHB和GmHB（图4c）。
UV-Vis光谱显示BsHB在405 nm处有吸收峰，VaHB和GmHB在415 nm处有吸收峰（图4b）。BsHB的吸收强度最高，其次为VaHB和GmHB，这可能归因于其含有四个血红素基团的四聚体结构；单体HB（VaHB和GmHB）峰强度的差异可能源于血红素结合的不同。
此外，VaHB和GmHB在540 nm处呈现次级吸收峰，表明存在还原态Fe²⁺。VaHB在此峰处的强度高于GmHB，提示VaHB中Fe²⁺含量更高，这与能延缓食品中脂质和蛋白质氧化的抗氧化特性相关。
TMB实验也证实了VaHB更优的过氧化物酶活性，反映其相比GmHB和BsHB具有更高的血红素亲和力和抗氧化能力（图4e）。
此外，为模拟其在植物基或培养肉产品等潜在应用中的着色效果，将不同培养时间（产生不同VaHB浓度）的VaHB生产菌株（HEM-ALL）进行加热和干燥处理。结果显示颜色随浓度增加而加深，表明VaHB具有可调控的着色能力（图S3）。
CD光谱显示，BsHB具有高α-螺旋含量（208 nm和220 nm处峰）和β-反平行结构（198 nm处峰）；而单体蛋白VaHB和GmHB在202 nm和220 nm处呈现明显的负峰，与经典α-螺旋结构略有不同，可能因其氨基酸序列中存在η-螺旋（图4d）。先前研究也表明这些峰的位置可能随pH变化——例如，GmHB的α-螺旋含量在pH 7时峰位于220 nm，但在pH 10时移至225 nm。CD结果表明VaHB和GmHB具有高度相似的结构特征，这可能归因于它们的单体性质。
DSC分析显示，VaHB、GmHB和BsHB的熔解温度（Tm）分别为79.6 ± 0.1°C、78.8 ± 0.1°C和67.0 ± 0.4°C（图4f–h）。VaHB与GmHB之间的Tm差异具有统计学显著性（p < 0.05）（图S4）。这一观察可归因于它们不同的结构构象——VaHB外周的血红素结合口袋可能促进紧密堆积的结构，而GmHB中口袋的中心位置可能导致更开放、松散堆积的构象，这可能降低其热稳定性。BsHB观察到的更尖锐的热转变反映了其四聚体结构的稳定性，解折叠发生在315至345 K之间。VaHB与GmHB相近的Tm值与先前关于GmHB的研究一致（在pH 7.25和8.5时Tm为79.0°C）。VaHB相比GmHB更高的热稳定性提示其在高温烹饪过程中抵抗变性和聚集的潜力，该特性可能增强消化性和吸收效率。
【数据】分子量：GmHB 15.5 kDa、VaHB 15.2 kDa、BsHB 15 kDa；蛋白浓度：200 mg/L；吸收峰：BsHB 405 nm、VaHB/GmHB 415 nm；次级峰：540 nm（Fe²⁺）；Tm：VaHB 79.6 ± 0.1°C、GmHB 78.8 ± 0.1°C、BsHB 67.0 ± 0.4°C；p < 0.05；BsHB解折叠温度：315–345 K
3.4 VaHB生产的综合工程策略
（此节对应原文多拷贝整合与血红素途径重构内容）
为进一步提高VaHB产量，实施了多拷贝整合与血红素生物合成途径重构的综合工程策略。首先通过CRISPR/Cas9介导的ku70位点删除生成GS115 Δku70宿主菌株，随后对该菌株进行两轮转化后载体扩增（PTVA）。
【数据】原文未详述
3.5 HEM基因整合及其对VaHB生产的影响
将HEM基因簇顺序整合至VaHB-H7-pTEF1-pAOX1菌株基因组中。第一轮整合涉及TEF1p-HEM3-CYC1t-AOX1p-HEM1-AOX1t表达盒，产生菌株HEM3-1。后续逐步整合HEM2/HEM12、HEM4/HEM15、HEM14/HEM13，最终获得包含完整血红素合成途径重构的菌株HEM-ALL。
经多拷贝整合与血红素途径重构后，最终工程菌株的VaHB产量达到117.7 mg/L，相比初始菌株提升了250%。
【数据】最终产量：117.7 mg/L；提升幅度：250%
讨论与解读
本研究证实VaHB在多个维度上优于GmHB，具备作为食品应用可持续替代品的潜力。结构分析确认了VaHB保守的血红素结合结构域，同时揭示了其相比GmHB更大的结合口袋和更强的血红素亲和力（−13.579 kcal/mol）。这些结构优势转化为功能性能的提升——VaHB表现出更高的热稳定性（Tm = 79.6°C）、显著更高的过氧化物酶活性（123.6 U/mg）以及更高效的血红素掺入能力（以415 nm特征吸收为证据）。通过多拷贝整合VaHB珠蛋白基因和重构完整血红素生物合成途径，工程化毕赤酵母菌株实现了117.7 mg/L的产量，较初始菌株提升250%。上述发现证明了VaHB作为食品着色剂的应用潜力以及所采用工程策略的有效性。
编译者解读：本研究在合成生物学应用层面提供了一个完整范例——从天然植物中发现候选蛋白、系统表征其理化性质、再通过代谢工程手段解决异源表达中的限速瓶颈。值得注意的是，研究者不仅关注蛋白本身的性能优化，还通过重构整个血红素合成途径而非仅增加目的基因拷贝数来实现产量跃升，体现了"全局思维"的工程策略。不过，VaHB从实验室规模走向工业化应用仍需面对发酵放大、纯化成本及食品安全审批等现实挑战。其与GmHB的差异化优势——尤其是更高的热稳定性——为植物基肉制品的加工工艺提供了新的可能性。
参考来源
Lu, Z. (2026). Biochemical characterization and optimized production of Vigna angularis hemoglobin in Pichia pastoris. Food Bioscience. DOI: 10.1016/j.fbio.2025.108110
DOI: 10.1016/j.fbio.2025.108110