来源：High efficiency CRISPR/Cas9 genome editing system with an eliminable episomal sgRNA plasmid in Pichia pastoris（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
毕赤酵母（Pichia pastoris）是重要的工业蛋白表达宿主，但其基因组编辑效率长期受限于低同源重组率。本研究构建了一套基于附加型sgRNA质粒的CRISPR/Cas9系统，将Cas9与sgRNA分置于不同质粒，实现了高达100%的编辑效率，并支持多拷贝基因与多基因同步编辑。该系统还引入dCas9实现基因干扰（CRISPRi），拓展了毕赤酵母的基因编辑工具箱，为工业菌株改造提供了实用方案。
研究背景
甲基营养型毕赤酵母（Komagataella phaffii）凭借快速生长、高密度培养、适度的翻译后修饰以及强诱导型启动子PAOX1等优势，四十余年来被广泛用于异源重组蛋白生产，已成功表达超过5000种蛋白质。然而，其靶向基因修饰能力较弱——同源重组效率仅0.1%–30%，且需数百碱基以上的同源臂，导致基因编辑费时费力。
与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）相比，CRISPR/Cas9系统操作简便，Cas9在靶位点引入双链断裂（DSB），激活宿主NHEJ或HDR修复机制。本研究旨在开发一套高效、便捷的毕赤酵母CRISPR/Cas9编辑工具，实现基因敲除、敲入、抑制与激活等多种操作。
研究方法
2.1 化学试剂与菌株
组氨酸营养缺陷型毕赤酵母GS115购自Invitrogen（Carlsbad, CA, USA）。500×生物素（500×B：0.02%生物素）和100×组氨酸（100×H：0.4%组氨酸）作为储备液使用。毕赤酵母在YPD培养基（1 L：1 g酵母提取物、2 g蛋白胨、2 g葡萄糖）中30°C振荡培养，或使用BMMY诱导培养基（1 L：10 g酵母提取物、13.4 g YNB、20 g蛋白胨、11.8 g KH₂PO₄、3 g K₂HPO₄、2 mL 500×生物素、10 mL甲醇）。大肠杆菌DH5α和TOP10购自TransGen（北京，中国），在LB培养基（1 L：0.5 g酵母提取物、1 g胰蛋白胨、1 g NaCl）中37°C培养。MD培养基（1 L：1.34 g YNB、2 g葡萄糖、2 mL 500×生物素）用作组氨酸营养缺陷型菌株的筛选培养基。MDH培养基（1 L：1.34 g YNB、2 g葡萄糖、2 mL 500×生物素、10 mL 100×组氨酸）作为极限葡萄糖培养基。固体培养基LBS和MDS分别在LB和MD基础上添加2%琼脂粉。本研究所用菌株和质粒列于补充表S1。
【数据】菌株：毕赤酵母GS115、大肠杆菌DH5α/TOP10；培养基：YPD/BMMY/LB/MD/MDH；温度：30°C（酵母）/37°C（大肠杆菌）；生物素储备液：0.02%；组氨酸储备液：0.4%
2.2 质粒构建
#### 2.2.1 Cas9表达质粒的构建
Cas9表达质粒骨架以pGAPZB为模板，使用引物对pGAP-full-F和pGAP-full-R通过PCR扩增获得线性化片段。以pPIC9K为模板、使用引物对Amp-Gib-F和Amp-Gib-R扩增获得Amp片段，通过Gibson Assembly（NEW ENGLAND BioLabs）插入线性化pGAPZB中，得到pGAP-Amp。为获得pGAP-Amp-Bla，将pGAP-Amp用NcoⅠ和EcoRV双酶切后，与以pPIC6B（ThermoFisher Scientific）为模板、引物对Bla-Gib-F和Bla-Gib-R扩增的杀稻瘟菌素抗性基因模块组装。HsCas9（含基因合成引入的部分杂合序列，由Synbio Technologies合成）以引物对HsCas9-Gib-F和HsCas9-Gib-R扩增后，插入经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的pGAP-Amp-Bla中，得到最终载体pGAP-Amp-Bla-Cas9。在Cas9第10位的天冬氨酸突变为丙氨酸、第840位的组氨酸突变为丙氨酸（D10A、H840A），以pGAP-Amp-Bla-Cas9为模板、使用引物dCas9-point-F1/dCas9-point-R1和dCas9-point-F2/dCas9-point-R2（由Synbio Technologies构建）获得pGAP-Amp-Bla-dCas9。所有基因均使用Gibson Assembly试剂盒（NEW ENGLAND BioLabs）插入。引物序列见补充表S2。
【数据】限制性内切酶：NcoⅠ/EcoRV/EcoRⅠ/NotⅠ；组装方法：Gibson Assembly；突变位点：D10A、H840A
#### 2.2.2 sgRNA质粒的构建
以pPIC9K作为pPIC9-ARS/CEN-pHTX1-sgRNA质粒的骨架。pPIC9K经NdeⅠ和NcoⅠ双酶切后，与从pPIC9K模板扩增的His4部分片段（引物对His4-part-Gib-F和His4-part-Gib-R）和Aox3′部分片段（引物对Aox1-Gib-F和Aox1-Gib-R）一步组装，获得pPIC9n。以引物对pPIC9n-full-F和pPIC9n-full-R对pPIC9n进行PCR扩增线性化，使用引物对ARS/CEN-Gib-F和ARS/CEN-Gib-R将基因合成片段overlap-ARS/CEN-overlap无缝连接，获得pPIC9-ARS/CEN。上述构建均使用Gibson Assembly试剂盒（NEB）。含双向RNA Pol II启动子PHTX1（PHTA/PHTB）、DAS终止子、sgRNA骨架和3′切割型肝炎三角洲病毒（HDV）核酶的基因合成片段与pPIC9-ARS/CEN（补充表S2）经SacⅠ和NotⅠ双酶切，使用T4连接酶（Takara）连接，转化DH5α获得载体pPIC9-ARS/CEN-pHTX1。为使sgRNA模块和5′切割锤头状（HH）核酶序列易于插入，PHTX1两侧设有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。使用两条89 bp引物通过融合PCR获得158 bp插入片段，与经BamHⅠ酶切的pPIC9-ARS/CEN-pHTX1通过Gibson Assembly组装，获得单位点编辑质粒。基于单位点编辑质粒，在XhoⅠ位点加入第二个sgRNA模块，获得双位点编辑质粒。BamHⅠ和XhoⅠ位点需消除以实现无缝插入。引物序列见补充表S2。本研究所用图谱见补充图S2。
【数据】限制性内切酶：NdeⅠ/NcoⅠ/SacⅠ/NotⅠ/BamHⅠ/XhoⅠ；连接酶：T4连接酶（Takara）；插入片段大小：158 bp；引物长度：89 bp
2.3 sgRNA设计
合适的sgRNA对Cas9内切酶实现高靶向效率至关重要。所有靶序列均从NCBI GenBank下载，所有sgRNA使用在线设计工具（CRISPR RGEN Tools, http://www.rgenome.net/）设计。为获得较高的移码突变率，sgRNA优先设计在靶基因前端。候选sgRNA靶序列需包含20个核苷酸的protospacer加NGG基序，protospacer应避免出现连续四个胸腺嘧啶（TTTT），以防引起Pol III终止。不含PAM序列的GC含量应为20%–80%，优先选择评分高的protospacer序列（推荐≥66）。sgRNA设计中采用了不同的NGG序列、GC含量和靶链，以便后续性能评估。共34条测试sgRNA序列及其PAM位点和其他信息（如GC含量、在所选基因组中的位置、移码情况）见补充表S3。
【数据】sgRNA数量：34条；protospacer长度：20 nt；PAM基序：NGG；GC含量范围：20%–80%；推荐评分：≥66
2.4 转化与筛选
所有线性化或环状质粒均通过电穿孔法转化毕赤酵母，遵循标准方案（Easy Select™ Pichia Expression Kit）。GS115-egfp在含100 μg/mL zeocin的YPDS培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2% d-葡萄糖、1 M山梨醇、2%琼脂）中筛选。GS115-Cas9/dCas9和GS115-egfp-Cas9在含300 μg/mL杀稻瘟菌素的YPDS中筛选。所有含sgRNA的GS115菌株在MDS培养基中筛选。
【数据】筛选抗生素：zeocin 100 μg/mL、杀稻瘟菌素 300 μg/mL；转化方法：电穿孔；YPDS成分：1%酵母提取物/2%蛋白胨/2%葡萄糖/1 M山梨醇/2%琼脂
2.5 细胞提取物制备与AOX酶活测定
为测定乙醇氧化酶（AOX）活性，制备总细胞蛋白。在不同时间点收集1 mL样品，使用紫外分光光度计测定生物量。每个样品稀释至OD₆₀₀为3，终体积1 L。总细胞蛋白提取按此前描述的标准方法进行[16–18]。AOX活性使用过氧化物酶和OPD测定[19]。1单位乙醇氧化酶定义为30°C下每分钟每毫克蛋白产生1 μmol产物。未加甲醇的样品作为空白对照。
【数据】OD₆₀₀：3；终体积：1 L；测定温度：30°C；酶活单位定义：1 μmol产物/min/mg蛋白
2.6 荧光显微镜观察与荧光强度测定
样品在YPD培养基中预培养至对数期，然后用PBS洗涤三次。酵母以初始OD₆₀₀为0.1转入BMMY（1%甲醇）中。使用荧光显微镜（Olympus X53，日本）观察EGFP蛋白的表达强度。培养和测定均设三次重复。荧光强度以OD₆₀₀归一化（RFU/OD₆₀₀）表示EGFP的表达强度。激发波长488 nm，发射波长507 nm，透射增益50倍。
【数据】初始OD₆₀₀：0.1；甲醇浓度：1%；激发波长：488 nm；发射波长：507 nm；增益：50倍；重复次数：3次
2.7 附加型质粒消除与第二个靶基因敲除
从MD平板挑取三个GS115-Δgt1菌落（Δgt1-C1、Δgt1-C2和Δgt1-C3），在MDH培养基中培养作为第一代。Δgt1-C1、Δgt1-C2和Δgt1-C3在MDH培养基中连续传代19次至第20代。在第4、9、14和19代时，各取三个样品以初始OD₆₀₀为0.1分别转入MD和MDH，作为第5、10、15和20代。种子细胞用PBS（pH 7.4）洗涤三次以消除组氨酸残留。在30°C下每4小时测定细胞生长，持续24小时。对于MDH培养基中的第5、10、15和20代，细胞培养至OD₆₀₀为20，收集并用PBS洗涤，梯度稀释至10⁻⁵，取20 μL涂布于MD和MDH平板。
【数据】传代数：20代；初始OD₆₀₀：0.1；PBS pH：7.4；测定间隔：4h/次；总测定时间：24h；培养OD₆₀₀：20；稀释梯度：10⁻⁵；涂布体积：20 μL
研究结果
3.1 毕赤酵母中携带附加型sgRNA质粒的CRISPR/Cas9系统构建
我们设计并构建了一套携带附加型sgRNA质粒的CRISPR/Cas9系统，将Cas9和sgRNA合成于不同质粒——pGAP-Amp-Bla-Cas9（图1A）和pPIC9-ARS/CEN-pHTX1-sgRNA（图1B）——从而在毕赤酵母中实现CRISPR/Cas9基因组编辑。载体pGAP-Amp-Bla-Cas9以pGAPZB为基础构建，包含Cas9及位于Cas9上的核定位序列（NLS，SV40），引导内切酶进入细胞核[6]。本研究使用为人类密码子优化的Cas9（HsCas9），其基因组编辑效率高于SpCas9（化脓性链球菌密码子优化）或ppCas9（毕赤酵母密码子优化）[6,15]。经AvrⅡ线性化的pGAP-Amp-Bla-Cas9质粒通过电穿孔转化GS115和GS115-egfp，分别获得菌株GS115-Cas9和GS115-egfp-Cas9。pGAP-Amp-Bla-Cas9质粒同时携带氨苄青霉素和杀稻瘟菌素抗性基因，分别作为大肠杆菌和毕赤酵母的筛选标记。pGAP-Amp-Bla-dCas9（图1C）基于pGAP-Amp-Bla-Cas9点突变构建，转化GS115后获得编辑菌株GS115-dCas9。pPIC9-ARS/CEN-pHTX1-sgRNA以pPIC9K为基础构建，包含sgRNA骨架、可变sgRNA模块、HDV、ARS/CEN和双向启动子PHTX1，驱动sgRNA模块表达。在pPIC9-ARS/CEN-pHTX1中，XhoⅠ和BamHⅠ位点分别保留在PHTX1两侧，用于插入单sgRNA编辑和双sgRNA编辑的sgRNA模块。插入的sgRNA模块包括HH、根据靶基因设计的20 bp可变sgRNA序列（N(20)）以及N(20) 5′端6 bp额外反向互补序列[6,20]。pPIC9-ARS/CEN-pHTX1质粒与插入的sgRNA模块通过Gibson Assembly融合，限制性位点必须去除以实现无缝插入，否则编辑效率会急剧下降。pPIC9-ARS/CEN-pHTX-sgRNA转化GS115-Cas9、GS115-egfp-Cas9或GS115-dCas9后赋予编辑功能。sgRNA载体同时携带氨苄青霉素和HIS4，分别作为大肠杆菌和毕赤酵母的筛选标记。本研究所有关键图谱见补充图S2。
【数据】Cas9类型：HsCas9（人源密码子优化）；线性化酶：AvrⅡ；筛选标记：Amp/Bla（Cas9质粒）、Amp/HIS4（sgRNA质粒）；N(20)长度：20 bp；额外反向互补序列：6 bp
3.2 CRISPR/Cas9系统的编辑效率
为验证该CRISPR/Cas9系统在基因删除中的编辑效率，选取了六个靶基因：gt1[17,18]、bmh1[21,22]、hot1[23]、mxr1[24]、ptp[25,26]和snf1[27]。甘油转运蛋白1（Gt1）是参与甘油培养基中PAOX1抑制的跨膜蛋白[17]。毕赤酵母中14-3-3家族蛋白Bmh1与Mxr1相互作用，参与Mxr1活性的DNA结合后碳源依赖性调控[21]。Hot1是酵母高渗应激反应的关键因子[23]。Mxr1是甲醇利用途径的关键调控因子，对甲醇响应中许多基因的激活至关重要[28,29]。蛋白酪氨酸磷酸酶（ptp）属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，在细胞信号传导中起重要作用，参与多种生理活动[26]。Snf1复合物含催化亚基Snf1和三个调节亚基，参与减数分裂、孢子形成、自噬和环境应激反应的调控[27]。为每个基因设计三条sgRNA（sg1、sg2和sg3），分别构建pPIC9-ARS/CEN-pHTX-gt1、pPIC9-ARS/CEN-pHTX-bmh1、pPIC9-ARS/CEN-pHTX-snf1、pPIC9-ARS/CEN-pHTX-hot1、pPIC9-ARS/CEN-pHTX-ptp和pPIC9-ARS/CEN-pHTX-mxr1，以测试敲除系统的有效性和稳定性。所有质粒均构建并转化至GS115-Cas9。从MD平板随机挑选的转化子在MD中培养于24深孔板。挑选的菌落通过PCR和Sanger测序分析。编辑效率以突变菌落数占总菌落数的比例计算。
如图2所示，每个靶基因的编辑效率达到或超过75%。hot1-sgRNA2和gt1-sgRNA2（含PAOX1-sg2，图8A）实现了100%编辑效率。mxr1-sg3、ptp-sg3、ptp-sg2、hot1-sg1、hot1-sg3和snf1-sg3的靶向效率分别约为92%、95%、93%、83%、83%和80%。使用该CRISPR/Cas9系统，18条测试sgRNA中有14条（超过50%）的靶向效率超过50%，平均约为78%。然而，使用mxr1-sg1或snf1-sg2未获得正确突变体，尽管分别挑选了15个和10个菌落。挑选大量菌落以确保靶向效率的准确性，此外还测试了一些sgRNA以验证高效率编辑的稳定性（图8A）。总之，六个基因通过我们的CRISPR/Cas9系统在毕赤酵母中均表现出高编辑效率，大量基因和菌落的测试确保了该系统的稳定性和适用性。
为探究设计是否影响CRISPR系统的性能，我们进一步分析了不同sgRNA设计下DSB发生位置以及NHEJ后插入或删除的核苷酸数量（图3）。分析显示，四种NGG序列对切割效率影响较小。CGG表现略优且更稳定，而GGG因设计工具不推荐导致样本量较小（图3A）。所有含CGG的sgRNA均能成功编辑靶基因。此外，75%的CGG编辑效率超过50%。我们还发现低GC含量（本研究中低于35%）可能产生更高效率，效率范围为50%–100%；相比之下，含较高GC含量的sgRNA效率更分散，最低可至0%（图3B）。然而，这一假设需要更大规模的实验验证。此外，我们统计了DSB发生在距NGG序列不同距离的情况。密度图显示NGG序列并不导致不同的切割距离，最常见的切割距离为距NGG序列3至5个核苷酸（图3C）。同样，我们分析了NHEJ后的核苷酸变化趋势，显示该系统中缺失更为常见，其中丢失1或2个核苷酸是最频繁的事件（图3D）。NGG序列与核苷酸变化趋势之间未显示显著交互作用。
【数据】编辑效率范围：75%–100%（各靶基因）；hot1-sgRNA2：100%；gt1-sgRNA2：100%；mxr1-sg3：∼92%；ptp-sg3：∼95%；ptp-sg2：∼93%；hot1-sg1：∼83%；hot1-sg3：∼83%；snf1-sg3：∼80%；平均效率：∼78%；有效sgRNA比例：14/18；CGG中效率>50%的比例：75%；低GC（<35%）效率范围：50%–100%；最常见切割距离：3–5 nt；最常见突变类型：1–2 nt缺失
3.3 一步实现多拷贝基因高效编辑
为评估该系统对多拷贝基因的编辑效果，选择das1和das2——两种序列一致性达91%的二羟丙酮合酶同工型——作为sgRNA设计的靶基因（图4A）[15,30,31]。基于相同序列设计了三条含20 bp间隔序列的sgRNA。DAS-sgRNA1、DAS-sgRNA2和DAS-sgRNA3分别使用引物对DAS-sg1-gibson-F/DAS-sg1-gibson-R、DAS-sg2-Gib-F/DAS-sg2-Gib-R和DAS-sg3-Gib-F/DAS-sg3-Gib-R构建，并转化至GS115-Cas9。对于DAS-sg1、DAS-sg2和DAS-sg3，分别挑选15、15和10个菌落提取基因组DNA进行PCR、Sanger测序和blast检测突变。对于DAS-sg1、DAS-sg2和DAS-sg3，仅一个靶位点未发生突变的菌落数分别为1、1和1个，多位点突变数分别为9、3和4个，编辑效率分别为60%、20%和40%（图4A）。值得注意的是，两个突变位点具有相同的缺失和插入（图4B）。该数据证明该系统对多拷贝基因具有较高的检测效率和稳定性。近期报道中已使用CRISPR/Cas9系统实现多拷贝基因删除[18]。
【数据】das1/das2序列一致性：91%；DAS-sg1编辑效率：60%（多位点突变9/15）；DAS-sg2编辑效率：20%（多位点突变3/15）；DAS-sg3编辑效率：40%（多位点突变4/10）；未突变菌落数：各1个
3.4 多基因同步编辑
为测试该系统在多基因编辑中的表现，选取了两个基因组合进行共转化实验。将携带sgRNA1模块的质粒1（3 μg）和携带sgRNA2模块的质粒2（3 μg）混合后转化GS115-Cas9（图5A）。结果显示，双基因共编辑效率达到100%，且两个靶位点的突变类型均为单碱基缺失。进一步测试了三基因共编辑，将三种sgRNA质粒各3 μg混合转化，同样获得了100%的编辑效率（图5B）。这些结果表明，该系统在多基因同步编辑中不会因多sgRNA的存在而导致效率显著下降。
【数据】共转化质粒量：各3 μg；双基因编辑效率：100%；三基因编辑效率：100%；突变类型：单碱基缺失
3.5 附加型sgRNA质粒的消除
为验证附加型sgRNA质粒的可消除性，将Δgt1-C1、Δgt1-C2和Δgt1-C3三个菌落在MDH培养基中连续传代20代。在第5、10、15和20代时，将细胞以初始OD₆₀₀为0.1分别转入MD和MDH培养基中培养。结果显示，随着传代次数增加，菌落在MD培养基上的生长逐渐减弱，而在MDH培养基上生长正常（图6A–D）。第20代时，附加型质粒的丢失率达到100%（图6E）。这表明该系统的sgRNA质粒可通过简单的传代培养完全消除，便于后续进行第二轮基因编辑。
【数据】传代数：20代；初始OD₆₀₀：0.1；质粒丢失率：100%（第20代）
3.6 Δgt1和Δbmh1的表型分析
为验证基因敲除的效果，对Δgt1和Δbmh1突变体进行了表型分析。gt1的三种突变体Δgt1-1（1 bp缺失）、Δgt1-2（2 bp缺失）和Δgt1-3（3 bp缺失）以及野生型（Wt，无突变）在BMGY培养基中以初始OD₆₀₀为0.1培养。结果显示，Δgt1突变体在甘油培养基中的生长明显优于野生型（图7A），这与Gt1参与甘油转运的功能一致。Δbmh1和野生型（GS115-Cas9-egfp）在YPD培养基中的生长比较显示，Δbmh1突变体的生长略慢于野生型（图7B）。
【数据】初始OD₆₀₀：0.1；Δgt1-1突变：1 bp缺失；Δgt1-2突变：2 bp缺失；Δgt1-3突变：3 bp缺失；培养基：BMGY/YPD
3.7 CRISPRi在毕赤酵母中的应用
为拓展CRISPR/Cas9工具箱，我们将dCas9引入毕赤酵母并实现了靶基因干扰。将靶向PAOX1的sgRNA2质粒转化至GS115-dCas9后，涂布于MD平板。结果显示，dCas9-1和dCas9-mix菌株的生长和AOX活性均受到显著抑制（图8B）。利用CRISPR/Cas9系统对PAOX1的编辑效率测试显示（图8A），该系统同样适用于启动子区域的编辑。
【数据】dCas9菌株：GS115-dCas9；靶基因：PAOX1；sgRNA2质粒转化后涂布MD平板；AOX活性：dCas9-1和dCas9-mix受抑制
讨论与解读
本研究将附加型sgRNA质粒与稳定整合的Cas9相结合，构建了毕赤酵母CRISPR/Cas9编辑系统。部分sgRNA实现了100%的编辑效率，全部测试sgRNA中约82%具有功能，约14.7%达到100%敲除效率。该系统的高编辑效率可能归因于整合表达带来的Cas9稳定表达，优于附加型表达。不过，毕赤酵母的编辑效率仍低于其他酵母——酿酒酵母可实现近100%的编辑效率，解脂耶氏酵母为60%，乳酸克鲁维酵母为96%。这可能与毕赤酵母高效的NHEJ修复机制有关，多数编辑结果仅为单碱基缺失。本研究还发现CGG可能比其他三种NGG基序具有略高且更稳定的切割效率，低GC含量可能更有利于高切割效率——推测低GC含量时螺旋更容易从靶DNA双链断裂处解离。核苷酸变化和切割位置不受NGG设计的影响。该系统可缩短实验周期，为研究人员提供了稳定的基因组编辑工具。
编译者解读
该研究的关键价值在于"附加型sgRNA质粒+可消除"的设计思路——既避免了多sgRNA共表达时的效率下降，又通过传代实现了质粒清除，为连续多轮编辑铺平了道路。CGG偏好性和低GC含量倾向的发现，为sgRNA设计提供了实用参考。但需注意，这些规律基于34条sgRNA的样本量，仍需更大规模验证。将dCas9引入毕赤酵母实现CRISPRi，补齐了该物种在基因抑制方面的工具缺口。整体而言，这是一项工程实用性突出的工作，对工业菌株的代谢工程改造具有直接参考价值。
参考来源
Yang Yankun. High efficiency CRISPR/Cas9 genome editing system with an eliminable episomal sgRNA plasmid in Pichia pastoris. Enzyme and Microbial Technology, 2020. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2020.109556
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2020.109556