来源：Inducible regulating homologous recombination enables precise genome editing in Pichia pastoris without perturbing cellular fitness（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
毕赤酵母（Pichia pastoris）是非传统甲基营养型酵母，在异源蛋白与化学品生产中应用广泛。然而，CRISPR-Cas9介导的精准基因组编辑长期受困于同源重组（HR）效率低、多基因整合困难等瓶颈。本研究构建了基于Tet-On诱导启动子文库的动态HR调控系统，在不影响细胞生长与脂肪酸醇产量的前提下，将单基因和多基因整合的阳性率提升至80%以上。该策略巧妙地将"编辑期高HR"与"生产期低HR"解耦，为工业菌株的精准工程改造提供了新范式。
研究背景
毕赤酵母作为非常规甲基营养型酵母，广泛用于异源蛋白及多种化学品、生物燃料和天然产物的生产。高效的微生物细胞工厂构建需要对生物合成途径进行全面优化并重塑细胞代谢，因而亟需高效精准的基因操作工具。尽管CRISPR-Cas9编辑工具在毕赤酵母中已有较好发展，但数百碱基对的同源臂使DNA表达盒构建耗时费力；多基因整合效率低、复杂片段组装困难也制约了精准基因组工程与合成途径优化的步伐。CRISPR-Cas9系统可高效切割基因组造成DNA双链断裂（DSB），进而激活DNA修复机制实现基因突变、敲除与整合。DSB修复可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）完成——NHEJ依赖Ku70/80二聚体结合游离DNA末端并招募DNA蛋白激酶进行快速非特异修复；HR则由Rad52介导、以同源序列为模板实现高保真修复。然而，组成型增强HR虽能提升编辑效率，却会扰动细胞代谢与产物合成，在大规模生产中效应会被放大。因此，如何在编辑效率与化学品生产之间取得平衡，是该领域亟待解决的核心问题。
研究方法
生长曲线测定 从YPD平板上挑取单菌落，接种于3 ml MM-G20培养基中。在30°C、220 rpm条件下（智城摇床ZQZY-CS8）过夜培养后，调整初始OD600——YPD和MM-G20接种至0.1，MM-M10和MM-M20接种至0.5——转接至20 ml培养基中。细胞在30°C、220 rpm条件下培养96 h，随后测定600 nm处光密度值。设置三个生物学独立平行样品以保证结果可重复性。
【数据】培养基：YPD、MM-G20、MM-M10、MM-M20；温度：30°C；转速：220 rpm；时间：96h；初始OD600：YPD/MM-G20为0.1，MM-M10/MM-M20为0.5
Tet-On启动子构建与筛选 本研究所用引物列于在线补充信息表S3。携带TetR基因序列的pTPGI_dCas9_VP64质粒购自Addgene（目录号49013）。TetR序列见在线补充信息表S4。以组成型启动子PGAP（甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子-1 bp至-486 bp区域）为骨架构建Tet-On启动子。为筛选PGAP被TetR结合的最佳激活位点，通过重叠延伸PCR在PGAP TATA盒下游8 bp（G1）、31 bp（G2）、52 bp（G3）、73 bp（G4）和94 bp（G5）处依次插入两个19 bp tetO2操纵子位点，以增强绿色荧光蛋白（eGFP）作为报告基因，由各含tetO2的启动子驱动表达。PADH2启动子、TDAS1终止子和TFBP1终止子从GS115基因组DNA扩增获得。表达盒PADH2-TetR-TDAS1-PGAP-2×tetO2-eGFP-TFBP1融合1000 bp上下游同源臂，经重叠延伸PCR构建后，通过CRISPR-Cas9基因编辑系统整合至PC110（RAD52过表达菌株）的PNSI-2中性位点。所用gRNA表达质粒均建立于前期工作。DNA转化采用浓缩电转方案。共转化500 ng Cas9-gRNA质粒和500 ng供体DNA进行基因组整合。转化子在含100 μg/ml Zeocin的YPD平板上30°C培养三至四天，随后随机挑取8-16个菌落进行PCR验证。Tet-On启动子激活位点筛选中，PCR验证阳性菌落分别以初始OD600 0.1和0.5接种至20 ml MM-G20或M10培养基。首先在细胞生长起始时加入200 ng/ml aTc作为诱导剂，30°C、220 rpm培养72 h，每24 h测定OD600，eGFP荧光由酶标仪（Tecan Spark 3）在激发波长485 nm、发射波长525 nm下测定。所有荧光结果均以OD600归一化。
【数据】aTc浓度：200 ng/ml；温度：30°C；转速：220 rpm；时间：72h；抗生素：100 μg/ml Zeocin；荧光波长：激发485nm/发射525nm；同源臂长度：1000bp
Tet-On启动子文库构建 为简化CRISPR-Cas9编辑的供体DNA，将PADH2-TetR-TDAS1表达盒融合上下游同源臂整合至PC110的PNSI-16位点，生成菌株QSJ040。以具有最优aTc诱导响应的工程组合启动子（G2）为模板构建Tet-On启动子文库。PGAP上tetO2插入位点上下游各20 bp原始序列（OS）被合成引物对BF067/BF068替换为非特异性核苷酸序列（N…N）。DNA片段PNSI-2up-PGAP-tetO2和PGAP-tetO2-eGFP-TFBP1-PNSI-2dn分别由引物对PNSI-2UP-F/BF068和BF067/PNSI-2DN-R扩增获得。两个片段经重叠延伸PCR融合，随后含PGAP-tetO2突变启动子的供体表达盒通过CRISPR-Cas9导入QSJ040的PNSI-2位点。文库转化子在含100 μg/ml Zeocin的YPD平板上30°C筛选三天。Tet-On启动子文库的筛选与组装分三步进行：第一步，随机挑取六十个菌落接种于600 μl YPD中，30°C过夜培养后取200 μl细胞悬液测定eGFP荧光，以Tet-On启动子G2的eGFP荧光为对照，滤除eGFP未被抑制的菌落；第二步，eGFP被抑制的菌落进一步接种至600 μl MM-G20或YPD培养基中培养20 h，以200 ng/ml aTc为诱导剂，保留eGFP被激活的菌落；第三步，从筛选菌落基因组DNA中PCR扩增PGAP-tetO2突变体DNA片段，通过Sanger测序（生工生物，上海）测定tetO2上下游各20 bp随机核苷酸序列，收集含精确tetO2操纵子插入位点且20 bp突变核苷酸序列完整的启动子。重复此筛选流程，直至最终组装成对aTc响应呈梯度强度的Tet-On启动子文库。
【数据】筛选菌落数：60个；aTc浓度：200 ng/ml；抗生素：100 μg/ml Zeocin；温度：30°C；时间：过夜/20h；tetO2插入位点：G2（TATA盒下游31bp）
单基因删除与整合 本研究所用gRNA质粒均构建于前期工作。GUT1（甘油激酶）无缝删除DNA盒通过重叠延伸PCR融合目标基因1000 bp上下游同源臂构建。FAA1（脂肪酰-CoA合成酶）无缝删除DNA盒分别融合50 bp、100 bp、200 bp和1000 bp上下游同源臂构建。基因整合表达盒由PGAP、mPlum和TFBP1融合PNSI-9位点上下游各100 bp同源臂序列经重叠延伸PCR构建。共转化500 ng Cas9-gRNA质粒和500 ng供体DNA（浓缩电转方案），转化子在含100 μg/ml Zeocin及aTc（根据实验为200 ng/ml或50 ng/ml）的YPD平板上筛选。挑取十六个菌落进行PCR验证，阳性菌落百分比按阳性菌落数与所选总菌落数之比计算。菌落形成单位（CFU）数以感受态细胞OD600归一化。每次转化设置三至四次重复。
【数据】同源臂长度：GUT1为1000bp；FAA1为50/100/200/1000bp；整合位点同源臂：100bp；Cas9-gRNA质粒：500ng；供体DNA：500ng；Zeocin：100 μg/ml；aTc：200或50 ng/ml；验证菌落数：16个
HR基因操作 ScSAE2、ScRAD51、ScRAD52、ScRAD54、ScRAD55、ScRAD57和ScRAD59基因从酿酒酵母CEN.PK 113-11C基因组扩增获得，内源基因RAD51、RAD52、RAD54和RAD59从GS115基因组扩增获得。上述所有基因分别由Tet-On启动子文库驱动表达，整合至菌株BB060的HIS4位点，或组合过表达整合至菌株BB062的PNSI-2位点。内源基因MUS81、MMS4、SLX1、SLX4和YEN1从GS115基因组克隆并由Tet-On启动子文库驱动表达，MUS81-MMS4、SLX1-SLX4和YEN1过表达盒融合上下游同源臂后导入菌株BB062的PNSI-9位点。由PGAP和PTEF1驱动的MUS81-MMS4复合物融合上下游同源臂后整合至菌株PC110的PNSI-9位点。
【数据】来源菌株：酿酒酵母CEN.PK 113-11C、毕赤酵母GS115；整合位点：HIS4、PNSI-2、PNSI-9；基因：ScSAE2、ScRAD51、ScRAD52、ScRAD54、ScRAD55、ScRAD57、ScRAD59、RAD51、RAD52、RAD54、RAD59、MUS81、MMS4、SLX1、SLX4、YEN1
多片段组装与整合 MmCAR、npgA和ScADH5的表达盒构建于前期工作，三个基因表达盒同时整合至FAA1位点。三个片段之间的同源区为500 bp，FAA1同源臂长度为1000 bp。共转化500 ng Cas9-gRNA质粒和1 μg供体DNA（三个片段摩尔比1:1:1），转化子在含100 μg/ml Zeocin的YPD平板上筛选。
【数据】片段间同源区：500bp；FAA1同源臂：1000bp；Cas9-gRNA质粒：500ng；供体DNA：1μg；摩尔比：1:1:1；Zeocin：100 μg/ml
研究结果
建立TetR/tetO2诱导系统 首先在毕赤酵母中建立TetR/tetO2诱导系统。为构建aTc诱导型启动子，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子PGAP为骨架，在TATA盒下游五个位点插入两个拷贝的tetO2操纵子序列，生成重组启动子G1–G5。引入eGFP作为报告基因以测定G1–G5驱动的激活强度。TetR由PADH2表达，通过结合tetO2操纵子位点抑制eGFP表达。在含20 g/l葡萄糖或10 g/l甲醇为碳源的基本培养基（MM）中，即使经aTc诱导，工程组合启动子的表达对细胞生长也仅有微弱影响。在葡萄糖培养基中，G1、G2、G3和G5启动子在24 h后被aTc激活；其中G2和G3的激活强度最高，分别比野生型PGAP高17%和20%。此外，在无aTc条件下，G2受TetR的抑制远强于G3，其值仅为PGAP的17%。在甲醇培养基（M10）中培养时，仅G2表现出aTc的严密调控，24 h时抑制和激活强度分别约为PGAP的11%和95%。这些数据表明，在PGAP TATA盒下游31 bp处插入tetO2操纵子序列是aTc调控的最佳位置；因此，选择工程启动子G2用于后续aTc激活（Tet-On）启动子文库的构建。
【数据】碳源：20 g/l葡萄糖或10 g/l甲醇；激活强度：G2和G3分别比野生型PGAP高17%和20%；G2无aTc时仅为PGAP的17%；M10中G2抑制/激活强度约为PGAP的11%/95%；tetO2最佳插入位置：TATA盒下游31bp
Tet-On启动子文库构建 为建立宽表达范围的Tet-On启动子文库，以重组启动子G2为骨架，使用含20个未指定核苷酸（Ns）的合成引物构建文库——扩增过程中核苷酸随机连接未指定的Ns，最终产物中产生多样的核苷酸序列。转化后共挑取126个菌落进行eGFP荧光测定，以启动子G2为阳性对照。第一轮筛选中，78个菌落的相对荧光单位（Rfu）/细胞OD600低于G2（无aTc诱导），保留这些启动子以筛选经aTc诱导的严密调控启动子。第二轮筛选中，向葡萄糖基本培养基（G20）或YPD培养基中添加200 ng/ml aTc，选择31个具有不同aTc诱导水平的菌落进行启动子测序。最终，15个含精确tetO2操纵子插入位点且20 bp突变核苷酸序列完整的测序启动子用于构建对aTc呈梯度响应的Tet-On启动子文库；aTc诱导下启动子强度为野生型PGAP的5%至78%。所用启动子序列全部列于在线补充信息表S1。该Tet-On启动子文库用于HR相关基因的动态调控，通过增强HR过程实现精准基因组工程。
【数据】筛选菌落总数：126个；第一轮保留：78个；第二轮保留：31个；最终文库：15个启动子；aTc浓度：200 ng/ml；启动子强度范围：野生型PGAP的5%-78%
通过Tet-On启动子动态调控RAD52 在酵母中，Rad52作为重组介导因子，通过促进单链DNA（ssDNA）结合复制蛋白A（RPA）与Rad51重组酶在ssDNA上的交换来提高HR效率。前期工作中曾使用强组成型启动子PGAP过表达RAD52以改善无缝基因删除和靶向基因组整合。然而，RAD52的组成型过表达（菌株PC110）在不同培养基中均减缓细胞生长，不适合工业应用。因此，尝试在基因组工程过程中通过Tet-On启动子以aTc诱导RAD52过表达；不添加aTc时，细胞发酵过程中RAD52不表达。将PADH2-TetR-TDAS1表达盒整合至GS115的PNSI-16位点生成BB060，再将含强Tet-On启动子G2的RAD52过表达盒整合至BB060的HIS4位点生成菌株BB062。与原始GS115菌株相比，Tet-On启动子G2过表达RAD52（菌株BB062）在四种培养基中均不影响细胞生长。随后通过四步优化CRISPR-Cas9基因编辑过程中RAD52的aTc诱导：细胞培养；感受态细胞制备；含供体DNA和gRNA的感受态细胞孵育；转化子筛选。在摇瓶培养和/或平板筛选阶段添加200 ng/ml aTc以诱导RAD52转录，以GUT1无缝删除评价HR效率。菌株BB062中RAD52的诱导过表达显著提高了gut1Δ阳性率，仅在转化子筛选阶段进行aTc诱导即获得最高阳性率（81%），与RAD52组成型过表达菌株PC110相当。与此一致，aTc的添加显著降低了选择平板上的菌落形成单位数（CFU/OD600）。在CRISPR-Cas9基因组编辑流程中，摇瓶培养（用于制备感受态细胞）和平板筛选阶段（用于转化子生长）均耗时较长，两个步骤均添加aTc可增强Tet-On启动子激活。在转化子平板筛选过程中，Tet-On启动子G2被aTc完全激活，通过直接利用感受态细胞中的gRNA和供体盒增强HR修复。在摇瓶培养阶段，细胞以初始OD600 0.2接种，培养4-5 h至OD600 0.8用于感受态细胞制备。Tet-On启动子G2的强度在4 h时仅被激活至其一半强度，不足以增强RAD52表达，因此与仅平板筛选相比阳性率略有下降。故后续CRISPR-Cas9编辑采用平板筛选阶段诱导RAD52的策略。
【数据】aTc浓度：200 ng/ml；gut1Δ最高阳性率：81%（仅平板筛选阶段诱导）；初始OD600：0.2；感受态制备OD600：0.8（培养4-5h）；4h时G2激活强度：约50%
随后评价了平板筛选阶段不同浓度aTc对RAD52诱导的影响。50–200 ng/ml aTc产生相似的gut1Δ阳性率（86–87%），CFU/OD600随aTc浓度升高逐渐降低，500 ng/ml aTc诱导的gut1Δ阳性率最低，为73%。因此，后续实验选用50 ng/ml aTc作为诱导浓度。为进一步优化RAD52表达，从Tet-On启动子文库中选取四个具有不同aTc诱导水平的启动子（No. 5、No. 9、No. 10和No. 15）驱动RAD52表达。gut1Δ阳性细胞百分比与RAD52启动子强度呈正相关，启动子G2记录到最高阳性率（61%）。为进一步探索菌株BB062的HR能力，使用短同源臂（50 bp、100 bp和200 bp）进行FAA1无缝删除。菌株BB062使用200 bp同源臂时faa1Δ阳性率为42%，使用50 bp同源臂时为33%；这些百分比均高于GS115，且BB062的CFU/OD600与GS115相当。
【数据】aTc浓度梯度：50/200/500 ng/ml；50-200 ng/ml阳性率：86-87%；500 ng/ml阳性率：73%；后续诱导浓度：50 ng/ml；G2驱动RAD52阳性率：61%；200bp同源臂faa1Δ阳性率：42%；50bp同源臂阳性率：33%
HR调控实现高效基因编辑 利用该Tet-On系统，进一步评价了HR相关基因的过表达效果。将酿酒酵母来源的ScSAE2、ScRAD51、ScRAD52、ScRAD54、ScRAD55、ScRAD57和ScRAD59以及毕赤酵母内源的RAD51、RAD52、RAD54和RAD59分别由Tet-On启动子文库驱动表达，整合至菌株BB060的HIS4位点或组合过表达整合至菌株BB062的PNSI-2位点。以GUT1无缝删除为评价体系，比较各HR基因过表达对编辑效率的影响。在单基因整合方面，将PGAP-mPlum-TFBP1表达盒（含100 bp同源臂）整合至PNSI-9位点，评价不同HR基因组合对整合效率的影响。结果显示，特定HR基因的组合过表达可显著提高单基因整合的阳性率。
【数据】整合位点：PNSI-9；同源臂：100bp；HR基因：ScSAE2、ScRAD51、ScRAD52、ScRAD54、ScRAD55、ScRAD57、ScRAD59、RAD51、RAD52、RAD54、RAD59
多片段整合的适应性调控 为评价Tet-On系统在多片段整合中的应用潜力，将MmCAR、npgA和ScADH5三个基因表达盒同时整合至FAA1位点，三个片段间同源区为500 bp，FAA1同源臂长度为1000 bp。通过Tet-On启动子文库对MUS81-MMS4和SLX1-SLX4复合物进行过表达调控，以增强多片段整合过程中的多入侵重组过程。结果显示，在aTc诱导条件下，含MUS81-MMS4和SLX1-SLX4诱导过表达的菌株表现出更高的多片段整合阳性率。
【数据】片段数：3个；片段间同源区：500bp；FAA1同源臂：1000bp；供体DNA：1μg；摩尔比：1:1:1
Tet-On启动子增强HR对脂肪酸醇生产的影响 为验证诱导型HR调控策略在生产阶段的优势，构建了含MmFAR和ScADH5的脂肪酸醇生物合成途径菌株（GS115、PC110、BB062和BB097），在MM-M20培养基中评价细胞生长、甲醇消耗和脂肪酸醇积累。结果显示，组成型过表达RAD52的菌株PC110在MM-M20培养基中生长明显受损，脂肪酸醇产量显著降低。而经Tet-On启动子诱导RAD52表达的菌株BB062在不添加aTc的生产阶段，细胞生长与原始菌株GS115相当，脂肪酸醇积累量也未见明显下降。BB097菌株（含Tet-On调控的HR增强系统）在MM-M20培养基中生长曲线与GS115基本一致，甲醇消耗速率相当，脂肪酸醇产量与GS115无明显差异。
【数据】培养基：MM-M20；菌株：GS115、PC110、BB062、BB097；基因：MmFAR、ScADH5；脂肪酸醇产量：PC110显著降低，BB062/BB097与GS115相当
讨论与解读
非传统酵母因其独特性能正越来越多地被开发为潜在底盘细胞工厂。毕赤酵母因能以甲醇为碳源生产高价值产品而备受关注。近年来，CRISPR-Cas9基因编辑平台、基因组整合位点和启动子等遗传工具已被开发用于毕赤酵母的广泛代谢工程。其中，增强HR过程有助于精准基因组工程——包括无缝基因删除和基因组整合——这些对于毕赤酵母的广泛代谢重排至关重要。然而，组成型过表达HR相关基因会抑制细胞生长和染色体稳定性，限制了其在构建稳健工业型毕赤酵母细胞工厂中的应用。为克服这一挑战，可采用HR相关基因的诱导表达来防止毕赤酵母的细胞应激。换言之，通过在菌株构建过程中添加诱导剂实现HR相关基因的高表达以完成精准遗传工程；生产阶段不添加诱导剂时，HR相关基因表达维持在正常水平。Tet-On诱导启动子可被aTc激活，核心启动子区的随机突变进一步促进了该系统的开发。当前该技术的技术就绪水平（TRL）介于4至5之间。
编译者解读 该研究的方法论亮点在于将"编辑效率"与"生产性能"这对矛盾通过时间维度解耦——编辑期高HR、生产期低HR，巧妙规避了组成型HR增强带来的代谢负担。从合成生物学应用角度看，Tet-On启动子文库的构建策略具有通用性，不仅限于HR基因调控，还可推广至其他代谢通路基因的动态表达控制。然而，该系统的验证目前仅限于摇瓶发酵规模，aTc作为诱导剂的成本及其在放大生产中的残留问题仍需考量。此外，文库筛选流程较为繁琐，未来若能结合流式细胞术等高通量筛选手段，将进一步提升该平台的可及性与推广价值。
参考来源
Bai F. Inducible regulating homologous recombination enables precise genome editing in Pichia pastoris without perturbing cellular fitness. Trends in Biotechnology, 2025. DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.02.005
DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.02.005