来源：Targeted genome editing in the rare actinomycete Actinoplanes sp. SE50/110 by using the CRISPR/Cas9 System（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
CRISPR/Cas9基因组编辑技术正逐步应用于工业微生物领域。本研究将该技术成功引入阿卡波糖生产菌株Actinoplanes sp. SE50/110，通过无痕敲除酪氨酸酶基因melC2，阻断了野生型菌株黑色素（优黑素）的合成通路。研究证实了基于pCRISPomyces-2的编辑系统在该菌株中的完整功能性，并通过温度敏感型复制起点实现了质粒的便捷消除，全基因组测序排除了脱靶效应。
研究背景
游动放线菌属（Actinoplanes）菌株可产生大量具有生物技术价值的次级代谢产物和酶类，其中包括120余种抗生素，如替考拉宁、阿克他宁、雷莫拉宁及夫里阿霉素等临床相关药物。阿卡波糖（acarviosyl-1,4-麦芽糖）是该属菌株产生的伪四糖化合物，由Actinoplanes sp. SE50菌株合成，用于II型糖尿病的治疗——通过竞争性抑制人肠道α-葡萄糖苷酶，减少单糖吸收，从而降低血糖水平。
CRISPR/Cas9技术相较于其他遗传操作方法，具有操作简便、耗时短的显著优势，尤其适用于遗传操作困难的菌株。本研究将该技术适配至阿卡波糖天然生产菌株Actinoplanes sp. SE50/110，以酪氨酸酶基因melC2为靶点验证编辑功能。该基因编码的多铜氧化酶催化野生型菌株产生深色色素优黑素，敲除后表型变化清晰可辨。
研究方法
2.1 菌株、培养基、培养条件与试剂
所有克隆步骤使用大肠杆菌DH5αMCR。E. coli ET12567/pUZ8002作为接合转移宿主，用于目标菌株Actinoplanes sp. SE50/110（ATCC 31044）。质粒pCRISPomyces-2由Huimin Zhao馈赠（Addgene质粒#61737）。
大肠杆菌培养使用LB培养基（液体或琼脂平板），培养条件为37°C、180rpm振荡（GFL 3032振荡培养箱）。Actinoplanes sp. SE50/110在豆粉培养基琼脂（SFM；20g/L豆粉、20g/L甘露醇、20g/L琼脂、pH 8、自来水配制）上培养，液体培养使用NBS培养基（10g/L葡萄糖、4g/L蛋白胨、4g/L酵母提取物、1g/L MgSO₄·7H₂O、2g/L KH₂PO₄、5.2g/L K₂HPO₄·3H₂O）。液体培养条件为28°C、140rpm，使用带挡板的聚碳酸酯摇瓶。
抗生素使用浓度：氯霉素25μg/mL、卡那霉素50μg/mL（大肠杆菌筛选），阿普拉霉素50μg/mL（大肠杆菌及Actinoplanes sp. SE50/110筛选）。豆粉（全脂）购自Sobo Naturkost，LB培养基购自Thermo Fisher Scientific，其余化学试剂分别购自VWR、Sigma-Aldrich和Merck。PCR使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，Golden Gate Assembly所用酶均购自NEB。Gibson assembly预混液由Phusion High-Fidelity DNA Polymerase、T5 Exonuclease和Taq DNA Ligase配制。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；转速：180rpm；Actinoplanes培养温度：28°C；转速：140rpm；氯霉素：25μg/mL；卡那霉素：50μg/mL；阿普拉霉素：50μg/mL；SFM配方：20g/L豆粉、20g/L甘露醇、20g/L琼脂、pH 8；NBS配方：10g/L葡萄糖、4g/L蛋白胨、4g/L酵母提取物、1g/L MgSO₄·7H₂O、2g/L KH₂PO₄、5.2g/L K₂HPO₄·3H₂O
2.2 CRISPR/Cas9载体构建
CRISPR/Cas9编辑质粒以pCRISPomyces-2为模板构建，组装方法参照Cobb等（2015）。所有大肠杆菌转化采用电转化法。前间隔序列（protospacer）选择标准为20bp序列且3′端PAM为NGG。敲除完整CDS时，优先选择符合Cobb等（2015）筛选标准、且双链断裂位点位于CDS中部的protospacer。将gRNA序列最后12nt与四种不同PAM组合，使用BLASTn（标准NCBI短序列输入参数）比对Actinoplanes sp. SE50/110已公开基因组（GenBank CP003170），确认序列唯一性。
针对melC2基因敲除，选择protospacer 5′-GGCGAAATAGTTCAGGTGGG-3′（对应CDS第119–138位核苷酸）。gRNA cassette以带overhang的寡核苷酸形式合成、退火后通过Golden Gate Assembly插入质粒。左右同源重组模板各1kb，设计用于删除完整开放阅读框（含起始和终止密码子）。重组模板以基因组DNA为模板PCR扩增，通过等温Gibson Assembly克隆至质粒。所有构建步骤经对照PCR和Sanger测序验证。
【数据】protospacer序列：5′-GGCGAAATAGTTCAGGTGGG-3′；靶向位置：CDS第119–138位；同源臂长度：各1kb；PAM类型：NGG
2.3 Actinoplanes sp. SE50/110的接合转移
以E. coli ET12567/pUZ8002为接合宿主。每次接合前，Actinoplanes sp. SE50/110在SFM琼脂平板上新鲜培养——取300μL甘油菌液涂布，28°C培养6–7天，目视检查产孢情况。孢子以2.5mL ddH₂O冲洗并用棉签轻轻刮取。多个平板的孢子液合并，每个平板对应约1mL孢子液，用于一次接合。
携带目标质粒的E. coli ET12567/pUZ8002在含阿普拉霉素、卡那霉素和氯霉素的LB培养基中过夜培养，次日转接新鲜培养基，培养至OD为0.4–0.6。取10mL菌液用40mL冰预冷LB培养基洗涤两次（5000g，5min，4°C）。取1mL新鲜制备的Actinoplanes孢子液，8000g短暂离心，弃上清，沉淀与0.5mL大肠杆菌菌液混合。短暂涡旋后，涂布于新鲜SFM琼脂平板。18–22h后，将1mL 500μg/mL阿普拉霉素（ddH₂O配制）均匀涂布于平板表面。10–14天后，将接合子转移至新鲜平板，培养6–7天后进行菌落PCR验证，PCR确认基因型后重新划线纯化。
为去除接合中使用的大肠杆菌，反复划线直至平板上无法检测到大肠杆菌。为验证克隆为单菌，挑取单菌落接种含阿普拉霉素的NBS液体培养基——若大肠杆菌仍存在，因其生长更快会覆盖Actinoplanes sp. SE50/110，可通过光学显微镜轻易检出。接合对照包括不含gRNA和HDR片段的pCRISPomyces-2空质粒以及整合型质粒pSET152。
【数据】孢子培养时间：6–7天；孢子冲洗体积：2.5mL ddH₂O；E. coli培养OD：0.4–0.6；洗涤条件：5000g、5min、4°C；孢子离心：8000g；阿普拉霉素涂布：500μg/mL、1mL；接合子出现时间：10–14天
2.4 菌落PCR筛选与质粒消除
Actinoplanes sp. SE50/110菌落PCR参照Tong等（2015）方法并作如下修改：单菌落稀释于10μL DMSO中，100°C强烈振荡孵育20min（恒温金属浴）。短暂离心后取1μL上清作为12.5μL PCR反应的模板。表型鉴定通过SFM琼脂和LB琼脂平板涂布及NBS液体培养基培养进行。
温度敏感型pCRISPomyces-2质粒消除：单菌落接种40mL NBS培养基，37°C、140rpm振荡培养。根据生长情况，4–5天后取1mL转接新鲜培养基，继续培养2–3天。取200μL通过稀释涂布法接种于SFM琼脂平板。质粒消除通过单菌落影印培养验证——分别接种于含阿普拉霉素平板和无抗性平板。阿普拉霉素敏感菌落再次于NBS培养基中培养，用于基因组DNA提取和甘油菌制备。
【数据】菌落PCR裂解：10μL DMSO、100°C、20min；PCR体系：12.5μL；质粒消除温度：37°C；转速：140rpm；转接时间：4–5天；终培养：2–3天；涂布体积：200μL
2.5 DNA分离、测序与序列分析
基因组DNA提取：取1.5mL Actinoplanes sp. SE50/110培养物离心收集菌体。沉淀用含10.3%蔗糖的缓冲液洗涤，重悬于0.3mL缓冲液（25mM Tris-HCl pH 7.2、25mM EDTA、5mg/mL溶菌酶）中。混合物37°C孵育2h，加入50μL 5M NaCl，颠倒混匀后加入120μL 10% SDS，65°C孵育30min。加入240μL冰预冷5M乙酸钾，颠倒混匀后−20°C孵育30min。随后20,000g、4°C离心15min，取上清转移至含600μL冰预冷异丙醇的新管中。涡旋后20,000g、4°C离心15min，弃上清。沉淀以500μL 70%乙醇洗涤，37°C干燥至乙醇完全挥发。随后进行RNase处理，并使用Genomic DNA Clean & Concentrator-10试剂盒进行纯化。
【数据】菌体量：1.5mL培养物；溶菌酶浓度：5mg/mL；Tris-HCl：25mM pH 7.2；EDTA：25mM；孵育：37°C、2h；NaCl：50μL 5M；SDS：120μL 10%；65°C、30min；乙酸钾：240μL 5M；−20°C、30min；离心：20,000g、4°C、15min；异丙醇：600μL；乙醇：500μL 70%
研究结果
3.1 基于CRISPR/Cas9的质粒编辑系统设计与构建
要在Actinoplanes sp. SE50/110中成功应用CRISPR/Cas9系统，需要一种可移动的复制型穿梭质粒。该质粒须包含：密码子优化的Cas9蛋白编码序列、靶向待修饰序列的特异性gRNA、以及用于双链断裂修复的同源序列。此外，还需要一套在突变成功后从Actinoplanes中消除质粒的系统——本研究采用温度敏感型复制起点pSG5。
首次基因敲除选用pCRISPomyces-2质粒，其携带针对链霉菌属密码子优化的cas9基因。为验证CRISPR/Cas9系统在Actinoplanes sp. SE50/110中的功能性，选择敲除完整822bp基因ACPL_5017（推定编码酪氨酸酶）。该基因最初注释为griF，本文命名为melC2。酪氨酸酶MelC是一种多铜氧化酶，催化深色色素优黑素形成的关键步骤。从基因组中删除该基因应产生与野生型清晰可辨的表型——野生型在复合培养基中培养时上清液会变深色。推测该深色色素为优黑素，因为这是放线菌的典型产物，且ACPL_5017在基因组中注释为酪氨酸酶。优黑素在放线菌中的具体功能尚未完全阐明，可能包括光保护效应或抵御辐射、干燥及金属离子等胁迫因素。
靶向melC2的sgRNA设计：在CDS内选择20bp序列且3′端含PAM基序。为降低脱靶和副作用，基于基因组内唯一性进行筛选——将protospacer最后12bp与四种PAM组合，使用Actinoplanes sp. SE50/110基因组序列进行BLASTn比对。优先选择非编码链上的protospacer，且3′端含多个嘌呤碱基。gRNA通过Golden Gate Assembly克隆至pCRISPomyces-2质粒。同时，将melC2基因上游和下游各1kb DNA组成的2kb同源重组模板通过Gibson Assembly克隆至载体。所有构建经Sanger测序验证。
【数据】靶基因：ACPL_5017（melC2）；基因长度：822bp；同源臂：上下游各1kb；protospacer筛选：最后12bp+4种PAM组合BLASTn比对
3.2 利用CRISPR/Cas9系统敲除酪氨酸酶基因melC2以阻断优黑素合成
含有cas9基因、特异性gRNA及同源臂的穿梭载体通过接合转移导入Actinoplanes sp. SE50/110，以ET12567/pUZ8002为接合宿主。对照组包括：不含gRNA和同源定向修复（HDR）片段的“空”pCRISPomyces-2质粒，以及整合型质粒pSET152。pSET152在前期实验中显示出与Actinoplanes sp. SE50/110的高效接合率，因此作为接合阳性对照。“空”pCRISPomyces-2质粒作为复制型质粒的接合对照——已知其效率低于整合型质粒。由于Cas9核酸内切酶没有靶点，预期不会产生基因组改变。
melC2敲除质粒接合转移后，共分离到20个具有阿普拉霉素抗性的接合子。这些接合子在含阿普拉霉素的新鲜SFM平板上划线，进一步通过菌落PCR分析。引物设计在 homology flanks 上下游外侧退火，确保以CRISPR质粒为模板无法产生PCR产物。20个克隆中有16个（80%）通过菌落PCR确认了melC2基因的删除。
表型鉴定及DNA分离需要液体培养。克隆须从接合使用的大肠杆菌中纯化——由于没有已知的选择性因子可以特异杀死大肠杆菌同时允许Actinoplanes sp. SE50/110存活，只能通过反复划线实现。基于菌落PCR结果，选择4个克隆进行进一步分析。在SFM培养基上确认克隆为单菌后，于28°C NBS培养基中培养用于后续DNA分离。以基因组DNA为模板进行PCR验证基因删除。PCR片段经Sanger测序分析，确认了melC2基因的精确删除。
质粒消除后（见3.3），4个克隆再次于液体培养基中培养，提取基因组DNA、合并后于Illumina MiSeq系统测序。将reads比对至野生型Actinoplanes sp. SE50/110基因组，使用ReadXplorer进行后续评估和可视化，确凿证明了4个突变株中melC2基因的无痕删除。
CRISPR/Cas9在Actinoplanes sp. SE50/110中成功应用的进一步证据来自突变株表型——ΔmelC2突变株的上清液不变深色，而野生型菌株则典型地产生深色。这证明melC2基因编码的酪氨酸酶在NBS复合培养基中对于催化深色色素优黑素的产生至关重要。
【数据】接合子总数：20个；PCR确认敲除：16/20（80%）；测序平台：Illumina MiSeq；分析软件：ReadXplorer；表型：ΔmelC2上清液不变深色
3.3 CRISPR/Cas9系统从Actinoplanes sp. SE50/110中的消除及脱靶效应分析
为最小化脱靶和副作用风险，同时确证CRISPR/Cas9系统在Actinoplanes属中的完整适用性，需要验证温度敏感型pSG5复制起点的功能性。将4个突变克隆于37°C液体培养，转接新鲜培养基一次，随后划线至琼脂平板。通过恢复ΔmelC2单菌落的阿普拉霉素敏感性，证明了含阿普拉霉素抗性基因质粒的丢失。4个克隆均获得了阿普拉霉素敏感菌落，效率在6%至61%之间不等。含Cas9蛋白编码基因的质粒从Actinoplanes sp. SE50/110中成功消除，为快速迭代基因组编辑提供了可能，是不可或缺的一步。
引入突变的精确性及可能的脱靶或副作用通过全基因组测序分析，使用ReadXplorer软件评估。对亲本野生型菌株及4个突变株的混合池进行测序。亲本野生型菌株亦被测序，用于分析与参考基因组（GenBank CP003170）的差异。野生型中98.88%的参考基因组覆盖率≥10 reads，突变株测序中该数值为99.36%。仅考虑覆盖度>10的SNP或插入/缺失。共鉴定到43个SNP同时存在于野生型和突变株中。
【数据】质粒消除效率：6%–61%；野生型基因组覆盖率（≥10 reads）：98.88%；突变株基因组覆盖率（≥10 reads）：99.36%；SNP总数：43个
讨论与解读
本研究成功建立了Actinoplanes sp. SE50/110的CRISPR/Cas9基因组编辑工具。此前该菌株缺乏有效的遗传操作方法。研究通过敲除酪氨酸酶基因melC2、阻断优黑素合成，证实了为链霉菌开发的pCRISPomyces-2质粒可在Actinoplanes sp. SE50/110中复制，且所有元件——启动子、阿普拉霉素抗性标记和Cas9蛋白——均表现功能。无需额外步骤即可实现无痕、无标记的遗传修饰，快速迭代编辑及多重编辑应可实现。这些优势结合无需黏粒或其他大片段插入载体的特点，大幅减少了时间和工作量。该技术有望用于创建靶向遗传变异，如特定点突变和插入、启动子交换或大片段基因组区域删除。
编译者解读
本研究的关键价值在于将成熟的链霉菌CRISPR/Cas9工具直接移植至稀有放线菌——阿卡波糖工业生产菌株，验证了跨属适用性。温度敏感型质粒消除策略（6%–61%效率）为后续迭代编辑扫清了障碍，全基因组测序确认无脱靶也增强了该工具的安全性信心。从合成生物学应用角度，该技术为阿卡波糖高产菌株的代谢工程改造提供了精准且高效的遗传操作平台。不过，80%的敲除效率与相对繁琐的接合流程仍留有优化空间——未来若能建立不依赖接合的直接转化法或开发组成型编辑系统，将进一步提升该菌株的工程化效率。
参考来源
Wolf T, et al. Targeted genome editing in the rare actinomycete Actinoplanes sp. SE50/110 by using the CRISPR/Cas9 System. Journal of Biotechnology, 2016. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2016.05.039
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2016.05.039