来源：Enhancing multiple genome editing efficiency by employing CRISPR/Cas9 nickases in Erwinia billingiae QL-Z3（Results in Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微生物基因组编辑是研究酶功能与代谢网络的核心工具，但多位点染色体编辑长期面临效率瓶颈。本研究系统比较了两种Cas9切口酶（Cas9n）突变体（D10A与H840A）与野生型Cas9在菠萝泛菌QL-Z3中的编辑效率，发现pCas9n-D10A在单基因、双基因乃至三基因编辑中均达到100%效率，并成功应用于木质素降解酶基因的功能解析。该方法将编辑周期缩短至12小时，为细菌代谢工程提供了快速、精简的多基因编辑策略。
研究背景
基因编辑已成为现代生物学的基石技术，其核心依赖于两种DNA修复途径——同源重组（HR）与非同源末端连接（NHEJ）。同源重组是生物体固有的修复机制，通过DNA重组酶以同源DNA为模板修复损伤位点并解决DNA双链断裂（DSBs）。原核生物基因敲除技术涵盖多种策略：Red重组系统利用λ噬菌体编码的EXO、Beta、Gam三种蛋白，通过单链退火（SSA）修复DSB，介导外源DNA与大肠杆菌染色体DNA的同源重组；RecET系统则利用Rac前噬菌体来源的RecE和RecT重组酶，高效介导线性DNA分子间的同源重组，实现高达50 kb DNA片段的直接克隆；毒素-based负筛选系统则通过两步同源重组实现无缝敲除。然而，这些传统方法在多位点编辑效率和操作周期上仍存在显著局限。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究使用的所有细菌菌株和质粒列于表S1。质粒pDM4保存于大肠杆菌DH5α中。大肠杆菌S17-1作为pDM4克隆和质粒构建的宿主菌株。pTargetF和pCas9/9n质粒保存于大肠杆菌TG1中用于构建重组载体。大肠杆菌菌株在LB培养基中于37°C培养。菠萝泛菌QL-Z3菌株及其突变体在LB或木质素培养基中于30°C培养。根据需要向培养基中添加抗生素（卡那霉素、氯霉素、氨苄青霉素，50 mg/L）。
【数据】菌株：E. coli DH5α、S17-1、TG1、E. billingiae QL-Z3；培养基：LB；温度：37°C（大肠杆菌）/30°C（QL-Z3）；抗生素浓度：50 mg/L
2.2 质粒构建
自杀载体的构建方法和基因组编辑过程见本课题组前期文章[30]。在pTargetF的gRNA支架前设计BsaI限制性酶切位点，以方便sgRNA的替换。含有BsaI位点的新片段送公司合成，经双酶切后与pTargetF质粒连接形成环状质粒，生成pTargetF1。通过chopchop网站（http://chopchop.cbu.uib.no/）设计不同基因的gRNA。在此过程中，靶向基因复制子的gRNA序列作为引物合成，并分别引入pTargetF1骨架。为构建供体DNA，以QL-Z3基因组为模板，在靶基因区域两侧（上游或下游）各扩增约200–300 bp的同源臂。这些同源臂通过重叠延伸PCR融合获得线性供体DNA，或与重叠延伸PCR产物连接后引入pTargetF1骨架生成pTargetF2。采用点突变方法构建pCas9n（D10A或H840A点突变）和dCas9（同时含有D10A和H840A点突变）质粒。含有突变的特异性引物用于扩增pCas全长。由于pCas质粒较大，将其分为两个片段，通过剪接融合形成环状质粒，生成pCas9n-D10A、pCas9n-H840A和dCas9。
【数据】同源臂长度：200–300 bp；BsaI酶切位点；点突变：D10A、H840A；dCas9含双突变
2.3 多位点木质素降解酶基因编辑
将pCas9和pCas9n质粒电转化至菠萝泛菌QL-Z3中，构建菌株EBc9、EBc9n-D和EBc9n-H。这些重组菌株在10 mL含卡那霉素（50 μg/mL）和L-阿拉伯糖（60 mM）的LB培养基中，于30°C、200 rpm振荡培养。当生长至对数中期（OD₆₀₀ = 0.5）时，离心收集细胞，制备感受态受体细胞用于后续转化。随后根据需要将不同的pTargetF质粒和供体DNA（用于单基因或多基因缺失，或单基因插入）共转化至EBc9、EBc9n-D、EBc9n-H和EBc9n-DH菌株中。平板在30°C培养12–48小时，然后通过PCR扩增产物测序验证。
【数据】培养基：LB（10 mL）；卡那霉素：50 μg/mL；L-阿拉伯糖：60 mM；温度：30°C；转速：200 rpm；OD₆₀₀：0.5；培养时间：12–48 h
2.4 编辑效率测定
为测定自杀载体法的编辑效率，从蔗糖平板随机选取100个菌落进行PCR筛选和DNA测序。用于删除靶基因的引物为上下游同源臂扩增引物F1和R2。对于CRISPR/Cas介导的基因编辑，平板上生长的转化子数量不同，随机选取2–16个菌落进行PCR筛选和DNA测序确认。为节省时间，使用靶基因（<5000 bp）的上下游同源臂引物进行验证，或在靶基因内部（≥5000 bp）设计引物验证。编辑效率（%）=（成功编辑位点数/总编辑位点数）×100%。基因编辑效率以阳性菌落数占总选取菌落数的百分比计算。菌落形成单位（CFU）根据涂布在培养皿上的总液体体积计算每毫升的菌落数，方法参照Liu等[28]。所有实验均进行三次技术重复。
【数据】菌落选取数：100个（自杀载体法）/2–16个（CRISPR法）；引物：F1/R2；验证阈值：<5000 bp用同源臂引物，≥5000 bp用基因内部引物；重复次数：3次
2.5 质粒消除
为消除质粒，选取阳性克隆并在含0.5 mmol/L IPTG的LB液体培养基中过夜培养。随后将培养物适当稀释后涂布于两种不同的LB琼脂培养基：一种同时含氯霉素和卡那霉素，另一种仅含卡那霉素。如果菌株能在单抗性平板上生长但不能在双抗性平板上生长，则表明pTargetF1质粒已被消除。确认消除pTargetF1的菌株随后在含氨苄青霉素的LB液体培养基中于37°C培养，以诱导pCas质粒消除。PCR验证确认正确菌株即为敲除突变体。
【数据】IPTG浓度：0.5 mmol/L；温度：37°C；抗生素：氯霉素+卡那霉素/仅卡那霉素/氨苄青霉素
2.6 酶活性测定
单基因、双基因和三基因敲除突变体在LB培养基中过夜培养，8000 r/min离心5 min后用无菌去离子水洗涤三次，然后以1%接种量转接至木质素液体培养基（含1.5 g/L木质素；2 g/L K₂HPO₄；0.3 g/L MgSO₄·7H₂O；0.08 g/L CaCl₂；0.05 g/L FeSO₄·7H₂O；0.02 g/L MnCl₂；2 g/L (NH₄)₂SO₄）中。野生型菌株QL-Z3作为对照。在30°C培养72小时后收集培养液，8000 r/min离心5 min获得上清液。无细胞上清液作为酶源，测定漆酶、DyP型过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性。三种酶活性按照Ma和Lin等[31,32]描述的方法进行测定。
【数据】离心：8000 r/min，5 min；木质素培养基成分：1.5 g/L木质素、2 g/L K₂HPO₄、0.3 g/L MgSO₄·7H₂O、0.08 g/L CaCl₂、0.05 g/L FeSO₄·7H₂O、0.02 g/L MnCl₂、2 g/L (NH₄)₂SO₄；接种量：1%；温度：30°C；时间：72 h
2.7 FA降解率及HPLC产物分析
HPLC分析采用Shimadzu Prominence LC-20AD系统，配备Agilent InfinityLab Poroshell 120 ECC18色谱柱（150 × 4.6 mm，4 μm）和SPD-16A紫外检测器。流动相为10–70%甲醇水溶液（含0.1% TFA，三氟乙酸）梯度洗脱，流速0.65 mL/min，运行时间23 min。检测波长：256 nm（PCA，原儿茶酸）、250 nm（VA，香草酸）、327 nm（FA，阿魏酸），进样量5 μL。
【数据】色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 ECC18（150×4.6 mm，4 μm）；流速：0.65 mL/min；时间：23 min；检测波长：256 nm（PCA）/250 nm（VA）/327 nm（FA）；进样量：5 μL
2.8 统计分析
数据整理和可视化使用Graphpad Prism软件，所有结果以平均值±标准差表示。显著性分析使用SPSS软件，通过ANOVA分析和事后多重比较（Duncan）确定统计学显著性。
【数据】统计方法：ANOVA + Duncan事后多重比较；数据表示：平均值±标准差
研究结果
3.1 自杀质粒系统的建立
pDM4是携带sacB基因的自杀质粒，可在同源重组过程中实现反选择。具体而言，携带靶基因上下游同源臂的pDM4载体被转化至野生型QL-Z3菌株中。蔗糖激活sacB基因表达，产生果聚糖蔗糖酶。该酶催化转果糖基化反应，将蔗糖转化为高分子量果聚糖聚合物（左聚糖）。左聚糖的积累对大多数革兰氏阴性菌具有高度毒性，从而选择性地消除保留pDM4质粒的细胞（图1a）。因此，在蔗糖筛选压力下，可促进质粒载体与受体菌之间的双交换，实现质粒骨架的去除并获得敲除突变体。然而，pDM4自杀质粒系统在0.4–0.6 kb同源臂长度下的最大突变效率仅为4%（表1），且编辑周期至少需要13至17天才能完成（图1b）。
【数据】自杀质粒最大突变效率：4%；同源臂长度：0.4–0.6 kb；编辑周期：13–17天
3.2 CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas9n系统在QL-Z3中的构建与优化
本研究使用的CRISPR/Cas9基因编辑系统改编自Jiang等[33]并在本实验室进行了优化，由pCas9和pTargetF1两个质粒组成。pCas质粒含有λ-RED重组系统，pTargetF1携带sgRNA表达盒。我们在gRNA支架前引入BsaI酶切位点，以方便N20序列的引入。该设计允许N20序列通过双酶切自由替换（图2）。与传统的单酶切方法相比，这种优化方法实现了两个关键优势：（1）显著提高克隆效率，（2）缩短处理时间。供体DNA以片段形式提供，作为基因编辑模板，每个片段包含400–500 bp的序列，分别与靶基因上游和下游约200–250 bp区域具有同源性。
为确定Cas9切口酶（Cas9n）是否能提高转化细胞的存活频率和编辑效率，我们测试了两个突变版本：D10A和H840A。将pCas9n-D10A和pCas9n-H840A质粒转化至QL-Z3野生型菌株，获得的衍生菌株分别命名为EBc9n-D和EBc9n-H。检测了三个不同长度的基因/基因簇：ESOD_1236（633 bp）、chr_3856（3936 bp）和chr_1945–1948（7429 bp）。总CFU通过计数平板上相应菌落数计算。为评估Cas9蛋白介导的裂解对照功能，我们设置了三个平行对照：（1）野生型（WT）Cas9作为对照，（2）Δcas9/9n——仅转化同源臂和pTargetF质粒、缺乏Cas9/9n的WT菌株作为对照，（3）dCas9——在WT Cas9中同时含有D10A和H840A点突变作为额外对照。
结果显示，pCas9n-D10A显著提高了0.6–7.4 kb基因缺失的CFU数量；特别是pCas9n-D10A介导的0.6 kb基因敲除数量分别是Cas9和pCas9n-H840A的45倍和22倍（图3a）。然而，使用pCas9n-D10A作为编辑工具时，3.9 kb和7.4 kb基因缺失的CFU数量有所下降，尽管pCas9n-D10A和pCas9n-H840A的单基因敲除效率均保持在100%。在缺乏Cas9/9n蛋白的情况下虽然能形成菌落，但三个靶基因均未实现成功敲除，证明Cas9/9n是高效基因组编辑所必需的。与Δcas9/9n观察到的结果一致，dCas9突变株缺乏DNA切割活性，尽管能形成存活菌落，但无法实现靶基因敲除（图3a，图S1）。对于Cas9，chr_1945–1948基因簇因其较长的长度（图S2）而以0%的效率被删除。
类似地，我们比较了使用Cas9/9n系统敲入ELAC_205（729 bp）的效率，靶向QL-Z3基因组中的chr_468位点。chr_468基因编码氧化还原酶，我们此前已确定该基因不是QL-Z3基因组中生长和降解功能的关键基因[30]。令人惊讶的是，Cas9、pCas9n-D10A和pCas9n-H840A的敲入效率相似，分别为100%、100%和93.75%。与敲除尝试一致，缺乏Cas9/9n活性和dCas9完全消除了基因敲入效率（0%效率），强调了它们在CRISPR介导的基因组编辑中不可或缺的功能（图S3，补充信息2）。值得注意的是，Cas9n介导的基因编辑中的CFU数量显著高于Cas9（图3b）。
此外，我们计算了Cas9、pCas9n-D10A和pCas9n-H840A介导的基因编辑系统支持阳性克隆生长所需的时间。我们发现Cas9介导的阳性克隆需要2天才能支持生长，而pCas9n-D10A仅需12小时，节省了36小时（图3c）。总体而言，这些结果表明Cas9介导的单基因敲除效率低下且受靶基因长度限制。相比之下，pCas9n介导的单基因编辑效率提高到100%，特别是pCas9n-D10A编辑方法，减少了时间消耗并提高了便利性，使其更适合迭代或多重基因组编辑。
【数据】靶基因长度：633 bp（ESOD_1236）、3936 bp（chr_3856）、7429 bp（chr_1945–1948）；0.6 kb敲除CFU倍数：45倍（vs Cas9）、22倍（vs pCas9n-H840A）；单基因敲除效率：100%（两种Cas9n）；Cas9对7.4 kb基因簇效率：0%；敲入效率：100%（Cas9）、100%（pCas9n-D10A）、93.75%（pCas9n-H840A）；阳性克隆生长时间：2天（Cas9）vs 12小时（pCas9n-D10A）；时间节省：36 h
3.3 利用CRISPR/Cas9n系统在QL-Z3中进行多位点木质素降解酶基因编辑
pCas9/pTargetF介导的基因编辑系统最多可完成三个基因的删除以及基因删除和插入的混合操作。然而，随着供体DNA片段的增加，编辑效率急剧下降（从78%降至0%）[33]，这可能是由于dsDNA的低转化效率所致。为研究pCas9n/pTargetF1介导的系统在菠萝泛菌QL-Z3中的多基因编辑效率，我们同时靶向两个或三个位点：ESOD_1236、chr_1945–1948和chr_3856。然后将双基因或三基因供体DNA与pTargetF1质粒分别转入EBc9n-D和EBc9n-H。结果如图4所示。
与单基因编辑结果相似，诱导pCas9n-H840A的CFU计数比pCas9n-D10A介导的多位点编辑系统低5–15倍。有趣的是，CFU计数的减少并未影响编辑效率，因为pCas9n-H840A和pCas9n-D10A在双基因缺失中均实现了100%的效率（图S4，图S5，补充信息2）。然而，pCas9n-D10A同时调控三个位点的缺失效率保持在100%，而pCas9n-H840A则降至75%（图S6，图S7）。这些数据表明pCas9n-D10A比pCas9n-H840A具有更高的基因组切割效率。因此，我们在后续研究中采用了Cas9n-D10A切口酶介导的基因编辑系统。
成功确认基因敲除后，选取阳性克隆进行质粒消除。在含0.5 mM IPTG的LB培养基中过夜培养的菌液经梯度稀释后涂布以获取单菌落。随机选取菌落筛选pTargetF1质粒消除。PCR分析（图S8a）确认所有三个敲除突变体中的pTargetF1质粒均被完全去除，而对照菌株保留质粒。pTargetF消除后，确认菌株在37°C、200 rpm振荡的LB培养基中过夜培养。后续对单菌落的PCR分析（图S8b）确认所有目标菌株中的pCas9n质粒均被成功去除。在本研究中，我们开发了一种基于CRISPR/Cas9n的菠萝泛菌QL-Z3多位点基因组编辑系统。
为进一步验证该系统在代谢途径解析中的应用价值，我们利用pCas9n-D10A系统对三个木质素降解酶基因——EDYP_48（DyP型过氧化物酶）、ELAC_205（漆酶）和ESOD_1236（超氧化物歧化酶）进行了单基因、双基因和三基因敲除。酶活性测定结果显示，与野生型QL-Z3相比，单基因敲除突变体的DyP型过氧化物酶、漆酶和超氧化物歧化酶活性均显著降低。双基因和三基因敲除突变体的酶活性进一步下降，表明这三个基因在木质素降解过程中具有协同作用（图6）。
HPLC分析结果显示，EDYP_48和ELAC_205的缺失抑制了阿魏酸（FA）的消耗，同时香草酸（VA）和原儿茶酸（PCA）的积累表明这些酶与代谢途径组分之间存在协同相互作用（图7）。
【数据】双基因缺失效率：100%（两种Cas9n）；三基因缺失效率：100%（pCas9n-D10A）vs 75%（pCas9n-H840A）；CFU差异：5–15倍；IPTG浓度：0.5 mM；温度：37°C；转速：200 rpm；靶基因：EDYP_48、ELAC_205、ESOD_1236
讨论与解读
本研究揭示了传统自杀质粒介导的基因敲除技术不仅费时费力——每个周期需14至17天——且突变效率仅为4%。这种低效率和高假阳性率可归因于复杂的第二轮筛选过程和双交换事件的稀有性。为克服这些限制，Wang等[6]利用抗生素的强选择压力将验证过程从两步简化至一步，实现了20%的突变效率。尽管有所改进，但由于第二次重组事件后阳性率低，突变体筛选仍然耗时。我们推测同源臂长度可能导致这种低效率，当同源臂延长至0.4–0.6 kb时编辑效率提高了2%（表1）。然而，这一假设需要进一步的实证研究来验证。
近年来，CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术取得了显著进展，并已成功应用于某些细菌基因组的编辑，特别是大肠杆菌[34]。在我们的pCas9/pTargetF介导的基因编辑系统中，pCas质粒装载由L-阿拉伯糖诱导的ParaB启动子控制的λ-Red重组系统。pCas质粒含有温度敏感型复制子，可通过温度升高消除。
编译者解读
本研究最突出的价值在于将Cas9切口酶（特别是D10A突变体）的系统性优势转化为实际可用的多基因编辑流程——单基因100%、三基因100%的效率与12小时阳性克隆生长时间，使"设计-构建-验证"循环从数周压缩至数天。从合成生物学视角看，这种高效多位点编辑能力直接赋能菌株代谢途径的快速重构与细胞工厂的模块化组装。值得注意的是，D10A与H840A两种切口酶在CFU和多位点效率上的差异提示：切口酶的选择不应一刀切，需根据靶位点数目和长度进行优化。本研究的局限在于同源臂长度对效率的影响仍缺乏系统性解析，这为后续工作留下了空间。
参考来源
Zhao S. Enhancing multiple genome editing efficiency by employing CRISPR/Cas9 nickases in Erwinia billingiae QL-Z3. Results in Engineering, 2025. DOI: 10.1016/j.rineng.2025.107024
DOI: 10.1016/j.rineng.2025.107024