来源：Metabolic engineering of Pseudomonas putida for mineralization of 1,2-dichloroethane and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and its application in wastewater bioremediation（Journal of Environmental Chemical Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
1,2-二氯乙烷（DCA）和2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）是两类广泛使用的工业化学品和除草剂，其废水污染治理需求迫切。本研究以生物安全菌株恶臭假单胞菌KT2440为底盘，通过无痕基因组编辑整合DCA与2,4-D矿化途径、绿色荧光蛋白（GFP）和玻璃酸血红蛋白（VHb），构建了多功能工程菌KTU-DDGV。该菌株能完全矿化DCA和2,4-D为CO₂，在限氧条件下仍保持高效降解能力，并可通过肉眼观察绿色荧光实现实时监测，为含氯有机污染物废水的原位生物修复提供了新方案。
研究背景
DCA是全球年消耗量超过2000万吨的工业化学品，其生物降解抗性强、迁移性高，易污染地下水。除草剂2,4-D在全球农业中广泛用于防除阔叶杂草。DCA、2,4-D及其代谢中间产物对非靶标生物具有神经毒性、内分泌干扰、基因毒性和致癌风险。每年全球产生大量含DCA和2,4-D的废水，这些污染物可能通过废水排放进入自然环境。生物修复被认为是清除持久性有机污染物（POPs）的高效、低成本和可持续方法。为避免有毒中间体积累，可行的策略是通过微生物分解代谢将POPs转化为CO₂和生物量。目前，DCA和2,4-D的好氧生物降解途径已在多种细菌中被发现，如Xanthobacter autotrophicus GJ10和Ralstonia eutropha等。
研究方法
2.1 试剂、菌株与培养条件
DCA和乙醇酸购自中国上海阿拉丁公司。2,4-D、2,4-二氯苯酚（2,4-DCP）、3,5-二氯邻苯二酚（3,5-DCC）和氯乙酸购自中国上海Sigma-Aldrich公司。稳定同位素¹³C标记底物¹³C₆-2,4-D和¹³C₂-DCA分别购自中国上海Merck公司和Sigma-Aldrich公司。其他化学品和有机溶剂购自中国天津鼎国公司。分子生物学试剂盒购自中国南京Vazyme公司。大肠杆菌DH5α用作基因敲入载体的构建宿主菌。大肠杆菌在LB培养基中于37°C培养。恶臭假单胞菌菌株在补充4 g/L葡萄糖和微量元素溶液的矿物盐培养基（pH = 7.3）（MMG）中于30°C培养。为筛选恶臭假单胞菌突变体，LB培养基中添加卡那霉素（Kan，50 μg/mL）或5-氟尿嘧啶（5-FU，20 μg/mL）。恶臭假单胞菌KTU（KT2440 ∆upp）用作外源基因敲入的原始菌株。
【数据】培养基：LB/MMG；温度：37°C（大肠杆菌）/30°C（假单胞菌）；pH：7.3；葡萄糖：4 g/L；卡那霉素：50 μg/mL；5-FU：20 μg/mL
2.2 恶臭假单胞菌突变体的构建
如表S1所示，dhlA、ald-dh、tfdABCDEF、gfp和vgb基因由南京Genscript公司合成。dhlB1/B2、glcD和aceB基因从Halomonas cupida J9中通过PCR扩增获得。外源基因与内源启动子P8KT和核糖体结合位点（RBS）偶联后，使用无痕基因组编辑方法整合到恶臭假单胞菌基因组的特定位点（图1B）。将upp基因和外源基因表达盒插入自杀质粒pK18mobsacB中，构建基因敲入载体，按照先前方案电转化至恶臭假单胞菌感受态细胞中。随后，通过Kan抗性筛选单交换突变体，再通过5-FU抗性筛选双交换突变体。最后，使用PCR检测和DNA测序验证所有基因敲入突变体。最终构建的菌株命名为KTU-DDGV。表S2列出了本研究使用的菌株、质粒和引物。
【数据】外源基因：dhlA、ald-dh、tfdABCDEF、gfp、vgb、dhlB1/B2、glcD、aceB（共14个）；启动子：P8KT；筛选标记：Kan（50 μg/mL）、5-FU（20 μg/mL）
2.3 RT-PCR检测
RT-PCR用于验证外源基因是否在KTU-DDGV中转录。首先，按照先前描述的方法提取细胞总RNA并评估RNA质量。随后，按照先前方案通过逆转录合成cDNA。最后，分别以cDNA、基因组DNA、mRNA和ddH₂O为模板进行PCR扩增。
【数据】模板：cDNA、基因组DNA、mRNA、ddH₂O（阴性对照）
2.4 DCA和2,4-D降解研究
将KTU-DDGV过夜培养物以5%比例接种到20 mL补充有99 mg/L DCA、2 mM氯乙酸或1 g/L乙醇酸的MMG中，在30°C、180 rpm摇床上培养。该接种量设计为使初始OD₆₀₀约为0.1。在不同时间点取出培养物，按照先前方案从培养物中提取DCA。DCA和氯乙酸通过GC定量分析。氯乙酸衍生化和GC定量按照先前方案进行。乙醇酸通过HPLC分析，柱温和流动相与先前研究相同。
将KTU-DDGV过夜培养物以5%比例接种到20 mL补充有25 mg/L 2,4-D、2,4-DCP或3,5-DCC的MMG中，在30°C、180 rpm摇床上培养。在不同时间点，使用乙腈从培养物中提取有机物。离心收集有机相后，在Agilent 1260 HPLC上分析2,4-D及其中间产物。HPLC检测的详细条件与Xiong等人描述的相同。
【数据】接种比例：5%；初始OD₆₀₀：约0.1；DCA浓度：99 mg/L；氯乙酸：2 mM；乙醇酸：1 g/L；2,4-D/2,4-DCP/3,5-DCC：25 mg/L；温度：30°C；转速：180 rpm；培养基：MMG（20 mL）
2.5 稳定同位素¹³C分析
为检测DCA和2,4-D降解产生的CO₂，本研究通过向KTU-DDGV供给¹³C标记的DCA和2,4-D进行降解实验。将KTU-DDGV过夜培养物接种到20 mL补充有99 mg/L ¹³C₂-DCA或25 mg/L ¹³C₆-2,4-D的MMG中。在30°C、180 rpm培养4天后，将培养物酸化至pH < 2并振荡7分钟。随后收集顶空气体，送至中国农业科学院ESI实验室，使用同位素质谱仪测定稳定同位素¹³C。δ¹³C和¹³C/(¹²C+¹³C)%的估算采用Zhao等人描述的标准公式。
【数据】¹³C₂-DCA：99 mg/L；¹³C₆-2,4-D：25 mg/L；温度：30°C；转速：180 rpm；时间：4天；pH：<2；振荡：7 min；检测：同位素质谱仪
2.6 低氧降解研究
将KTU-DDGV过夜培养物以5%接种比例接种到20 mL补充有99 mg/L DCA或25 mg/L 2,4-D的MMG中，在30°C、80 rpm摇床上培养。降低搅拌速度以减少培养基中的溶解氧水平。取出培养物（1 mL）测定DCA和2,4-D的降解效率。GC和HPLC定量DCA和2,4-D的详细步骤见2.4节。
【数据】接种比例：5%；DCA：99 mg/L；2,4-D：25 mg/L；温度：30°C；转速：80 rpm（低氧条件）；取样量：1 mL
2.7 共聚焦显微镜观察
将KTU-DDGV过夜培养物取出并离心获得细胞沉淀。随后，用PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤细胞沉淀两次并重悬于相同缓冲液中。然后，将细胞悬液（500 μL）与10 μL浓度为10 μM的荧光染料FM4–64/L在黑暗中孵育30分钟。随后，在载玻片上混合15 μL样品和1 μL抗淬灭封片剂。最后，使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，Leica TCS SP5）观察细胞。
【数据】PBS：pH 7.4；细胞悬液：500 μL；FM4–64/L：10 μL、10 μM；孵育：30 min（避光）；样品：15 μL；封片剂：1 μL；仪器：Leica TCS SP5
2.8 KTU-DDGV的稳定性研究和生长测定
将KTU-DDGV过夜培养物以5%接种比例接种到100 mL LB和MMG中，在30°C、180 rpm培养36小时。每3小时间隔取出培养物，使用UV-1900i分光光度计测定OD₆₀₀。
将KTU-DDGV过夜培养物以5%接种比例接种到5 mL LB和MMG中。在30°C、180 rpm培养12小时后，将培养物以5%接种比例接种到5 mL新鲜LB和MMG中。该过程重复十八次。通过PCR检测第十八代亚培养物中的十四个外源基因。
【数据】培养体积：100 mL（生长曲线）/5 mL（传代）；温度：30°C；转速：180 rpm；时间：36 h（生长曲线）/12 h（每代）；传代数：18次；检测：OD₆₀₀（UV-1900i分光光度计）
2.9 废水生物修复研究
废水样品采集自中国天津某市政污水处理厂。废水生物修复实验中，将KTU-DDGV过夜培养物以5%比例接种到20 mL补充有99 mg/L DCA或25 mg/L 2,4-D的废水中，在30°C、180 rpm摇床上培养。取出废水样品定量DCA和2,4-D。从废水中提取DCA和2,4-D及定量分析按先前描述的方法进行。在30°C、180 rpm培养4天后，顶空气体收集和稳定同位素¹³C分析按先前描述的方法进行。
【数据】废水来源：天津市政污水处理厂；接种比例：5%；DCA：99 mg/L；2,4-D：25 mg/L；温度：30°C；转速：180 rpm；时间：4天
2.10 统计分析
使用GraphPad Prism 10（GraphPad Software, San Diego, CA）中的Student's t检验确定统计显著性。生长动力学（OD₆₀₀）和污染物水平以三次独立测量的平均值±标准差表示。统计显著性标注如下：n.s.，不显著；，0.01 < p < 0.05；，p < 0.01；，p < 0.001；****，p < 0.0001。
【数据】统计方法：Student's t检验；软件：GraphPad Prism 10；重复次数：3次；显著性阈值：p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001
研究结果
3.1 恶臭假单胞菌KT2440中DCA和2,4-D生物降解途径的构建
为使单一菌株能够矿化DCA和2,4-D，本研究利用先前建立的基因组编辑方法，将gfp、vgb和DCA/2,4-D生物降解基因及表达调控元件整合到恶臭假单胞菌KT2440基因组的靶位点（图S1），构建了工程菌株KTU-DDGV。构建的异源DCA和2,4-D降解途径与天然代谢途径的组合如图1A所示。分解代谢酶、VHb和GFP的表达受内源强启动子P8和优化RBS的控制，构成独立模块化表达单元。工程化表达模块的基因组整合位点示意如图1B所示。
使用PCR和基因特异性引物从KTU-DDGV基因组中扩增出十四个特异性DNA片段，其大小与全部十四个外源基因匹配良好（图S2）。此外，DNA测序结果显示PCR扩增的DNA片段与十四个外源基因之间具有100%的序列同一性，证明全部十四个外源基因成功整合到恶臭假单胞菌KT2440基因组中。
【数据】外源基因数量：14个；序列同一性：100%；整合方法：无痕基因组编辑
3.2 KTU-DDGV中十四个外源基因的转录
为验证外源基因在KTU-DDGV中的转录活性，从指数生长期培养物中分离总RNA并进行逆转录生成cDNA。如图S3所示，以cDNA或基因组DNA为模板成功扩增出预期大小的特异性PCR条带。相比之下，以mRNA或ddH₂O为PCR模板时未检测到目标产物。这些证据确凿地证明了全部十四个外源基因在KTU-DDGV中成功转录。
【数据】模板：cDNA/基因组DNA（阳性）、mRNA/ddH₂O（阴性）；扩增结果：预期大小特异性条带
3.3 KTU-DDGV对DCA、2,4-D及其中间产物的降解
通过将KTU-DDGV与99 mg/L DCA、2 mM氯乙酸和1 g/L乙醇酸在MMG中共同培养，评估其降解DCA及其中间产物的能力。GC分析中，DCA和氯乙酸甲酯的特征峰分别出现在4.10 min和3.98 min的保留时间（RT）处。KTU-DDGV与99 mg/L DCA培养12小时、与2 mM氯乙酸培养24小时后，GC分析显示DCA和氯乙酸甲酯对应的特征峰完全消失（图S4A和S4B）。HPLC分析中，乙醇酸的特征峰出现在2.76 min的RT处。KTU-DDGV与1 g/L乙醇酸培养24小时后，HPLC分析显示乙醇酸对应的特征峰完全消失（图S4C）。
KTU-DDGV能在12小时内完全降解MMG中的99 mg/L DCA（图S6A）。此外，2 mM氯乙酸和1 g/L乙醇酸在24小时内被KTU-DDGV完全降解（图S6A）。KTU-DDGV降解DCA、氯乙酸和乙醇酸伴随着MMG中细胞密度的增加（图S6A），表明KTU-DDGV能以葡萄糖和DCA（氯乙酸或乙醇酸）作为碳源共利用支持细胞生长。相比之下，KTU接种的对照组中DCA、氯乙酸和乙醇酸浓度无明显下降。这些结果证实引入的DCA降解基因在KTU-DDGV中功能性表达，产生了具有活性的降解酶。
为验证KTU-DDGV中异源2,4-D分解代谢酶的功能，本研究将三个中间菌株KTU-dA、KTU-dAB和KTU-dABC（表S2）分别与各自底物2,4-D、2,4-DCP和3,5-DCC在MMG中培养，并通过HPLC分析中间产物。菌株KTU-dA（tfdA）能在12小时内将大部分25 mg/L的2,4-D转化为2,4-DCP（图S5A）。HPLC分析表明，菌株KTU-dAB（tfdAB）能在3小时内将25 mg/L的2,4-DCP完全转化为3,5-DCC（图S5B）。25 mg/L的3,5-DCC在3小时内被菌株KTU-dABC完全降解（图S5C）。相比之下，在相同条件下，菌株KTU对2,4-D的浓度仅有轻微下降。含有完整2,4-D降解途径的KTU-DDGV能在16小时内完全降解MMG中的25 mg/L 2,4-D（图S6B），但HPLC未检测到其他中间产物（2,4-DCP和3,5-DCC），表明中间产物在KTU-DDGV中被下游降解途径快速代谢。
【数据】DCA保留时间：4.10 min；氯乙酸甲酯保留时间：3.98 min；乙醇酸保留时间：2.76 min；DCA降解：99 mg/L、12 h完全降解；氯乙酸降解：2 mM、24 h完全降解；乙醇酸降解：1 g/L、24 h完全降解；2,4-D降解：25 mg/L、16 h完全降解；2,4-DCP转化：25 mg/L、3 h完全转化；3,5-DCC降解：25 mg/L、3 h完全降解
3.4 KTU-DDGV对DCA和2,4-D的矿化
CO₂是有机污染物生物降解的终产物，表明有机污染物的完全矿化。¹³C稳定同位素分析是揭示有机污染物生物降解途径和菌株矿化能力的有效工具。为测试KTU-DDGV是否能矿化DCA和2,4-D，本研究向KTU-DDGV供给¹³C标记的DCA和2,4-D，并通过同位素质谱仪检测产生的¹³CO₂。
在MMG中与99 mg/L ¹³C₂-DCA培养4天后，KTU-DDGV的δ¹³C值（925‰）显著高于菌株KTU。同时，KTU-DDGV的¹³C/(¹²C+¹³C)%比值是KTU的2倍（图2A）。这些结果表明KTU-DDGV能够将¹³C₂-DCA转化为¹³CO₂、细胞生物量和细胞组分。
当在MMG中与25 mg/L ¹³C₆-2,4-D培养时，KTU-DDGV在第4天的δ¹³C值与KTU相比显著提高。此外，KTU-DDGV的¹³C/(¹²C+¹³C)%比值较KTU显著升高（图2B）。这些结果表明¹³C₆-2,4-D被KTU-DDGV转化为CO₂、细胞生物量和细胞组分。
培养24小时后，培养基中未检测到DCA和2,4-D，证明99 mg/L DCA和25 mg/L 2,4-D在24小时内被KTU-DDGV完全降解。有趣的是，KTU-DDGV对DCA和2,4-D的矿化依赖于额外碳源葡萄糖的添加。共代谢模式可能更有利于含多种碳源废水的原位生物修复。未来需要进一步研究阐明其潜在机制。
【数据】δ¹³C（¹³C₂-DCA）：925‰（KTU-DDGV）；¹³C/(¹²C+¹³C)%比值：KTU的2倍；培养时间：4天；DCA完全降解：24 h；2,4-D完全降解：24 h
3.5 限氧条件下KTU-DDGV对DCA和2,4-D的降解
氧气是好氧微生物生长和分解代谢过程所必需的。已有研究表明，玻璃酸血红蛋白（VHb）能在多种细菌宿主中增加氧气同化并刺激好氧代谢。本研究将表达VHb的KTU-DDGV在80 rpm的低转速摇瓶培养条件下培养，评估其在限氧条件下的生物降解性能。
在限氧条件下，KTU-DDGV在24小时内完全降解了99 mg/L DCA或25 mg/L 2,4-D（图S6C）。相比之下，不表达VHb的菌株KTU-dABCDEF在低氧条件下摇瓶培养时，DCA和2,4-D浓度无明显降低。结果表明，在限氧胁迫条件下，KTU-DDGV仍保持DCA和2,4-D的高效共代谢降解过程，使其成为受污染地下水和废水系统等缺氧环境中含氯化合物生物修复的有前景的微生物候选菌株，为提高原位修复效率提供了新的解决方案。
【数据】转速：80 rpm（限氧）；DCA降解：99 mg/L、24 h完全降解；2,4-D降解：25 mg/L、24 h完全降解；对照菌株：KTU-dABCDEF（无VHb，无明显降解）
3.6 GFP标记菌株KTU-DDGV的实时监测
生物标志物绿色荧光蛋白（GFP）被广泛用于工程微生物的实时监测和基因表达的定量分析。本研究构建了增强GFP标记的菌株KTU-DDGV。
【数据】监测方法：GFP荧光；观察方式：共聚焦显微镜/肉眼
3.7 菌株KTU-DDGV的稳定性与生长特性
为评估工程菌株的遗传稳定性，将KTU-DDGV在LB和MMG中连续传代18次。PCR检测结果显示，第十八代亚培养物中全部十四个外源基因均稳定存在（原文未详述具体电泳图数据）。
生长动力学测定结果显示，KTU-DDGV在LB和MMG中的生长曲线与原始菌株KTU相比无显著差异（图4A）。最大比生长速率（μmax）的统计比较如图4B所示。
【数据】传代数：18次；检测方法：PCR；外源基因：14个全部稳定存在；培养条件：LB/MMG、30°C、180 rpm、36 h
3.8 废水生物修复应用
为评估KTU-DDGV在实际废水中的修复能力，将菌株接种至补充有99 mg/L DCA或25 mg/L 2,4-D的实际市政废水中。KTU-DDGV在废水中表现出对DCA和2,4-D的高效降解能力（图5A和5B）。稳定同位素分析进一步证实了KTU-DDGV在废水中对DCA和2,4-D的矿化能力（图5C和5D）。在废水修复过程中，KTU-DDGV保持了较高的存活率，并显示出对DCA和2,4-D的高矿化效率。
【数据】废水来源：市政污水处理厂；DCA降解：99 mg/L；2,4-D降解：25 mg/L；温度：30°C；转速：180 rpm；时间：4天
讨论与解读
本研究从合成生物学底盘恶臭假单胞菌KT2440出发，通过植入DCA和2,4-D矿化途径、增强氧摄取能力和引入荧光追踪系统，构建了能够将DCA和2,4-D矿化为CO₂并可在真实废水系统中被荧光追踪的工程菌株KTU-DDGV。该多功能工程菌株的应用实现了废水中多种污染物的高效修复，可作为有机污染物向环境释放的有效屏障。本研究证明了单一菌株对多种含氯有机污染物的矿化能力。未来，KTU-DDGV有望用于DCA和2,4-D污染废水的原位生物修复。合成生物学作为创造自然界中不存在的新型降解菌的强大工具，其与稳健细菌底盘相结合的策略为恶劣环境中含氯有机污染物的清除开辟了新途径。
【编译者解读】该研究的技术路线值得关注：将完整的DCA和2,4-D矿化途径拆分为模块化表达单元整合入基因组，保证了遗传稳定性；引入VHb应对限氧环境，体现了对实际修复场景的考量；GFP标记使菌株可视化追踪成为可能。但矿化依赖外加葡萄糖的共代谢模式，在实际开放环境中的碳源竞争和菌株存活仍是工程化应用需要直面的问题。该策略为多污染物复合降解菌株的构建提供了可复制的范式。
参考来源
Zhang, X. (2026). Metabolic engineering of Pseudomonas putida for mineralization of 1,2-dichloroethane and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and its application in wastewater bioremediation. Journal of Environmental Chemical Engineering. DOI: 10.1016/j.jece.2025.120844
DOI: 10.1016/j.jece.2025.120844