来源：Efficient genome editing for Pseudomonas aeruginosa using CRISPR-Cas12a（Gene）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
铜绿假单胞菌是一种耐药性严重的条件致病菌，其基因组编辑工具尚不完善。本研究构建了基于FnCas12a的双质粒编辑系统，利用组成型启动子表达FnCas12a核酸酶、阿拉伯糖诱导表达λRed重组酶，在铜绿假单胞菌PAO1菌株中实现了基因删除、插入和替换，多数情况下编辑效率超过75%。该系统还支持长达15 kb大DNA片段的删除以及重复基因簇的连续删除，为铜绿假单胞菌的生物学与生理学研究提供了有力工具。
研究背景
铜绿假单胞菌是环境中广泛存在的条件致病菌，易感染老年人和免疫功能低下人群，引发严重炎症反应。该菌可通过内在、适应性和获得性等多种机制对抗生素产生耐药性。耐药性铜绿假单胞菌感染会延长住院时间、增加住院死亡率与医疗费用。仅2017年，美国住院患者中由耐药铜绿假单胞菌引起的感染估计达32,600例，死亡约2,700例。此外，铜绿假单胞菌也是研究革兰氏阴性菌群体感应、生物被膜和耐药性等特性的重要模式生物。截至2020年9月15日，假单胞菌基因组数据库已收录4,954条铜绿假单胞菌基因组序列。然而，即使是研究最充分的实验室菌株PAO1，其基因组编辑手段仍然有限。CRISPR-Cas12a系统已被证明是细菌基因组工程的有力工具，FnCas12a识别中等或低GC含量的PAM位点，与Cas9系统形成互补。本研究探索了FnCas12a在铜绿假单胞菌中的基因组编辑应用。
研究方法
2.1 菌株、培养条件与试剂
大肠杆菌DH5α用于质粒克隆，大肠杆菌S17-1作为接合供体菌株，大肠杆菌MG1655用于扩增lacZ基因。所有菌株均在LB培养基中、37°C条件下培养，除非另有说明。需要时，培养基中添加四环素或庆大霉素（大肠杆菌终浓度10 μg/mL，铜绿假单胞菌终浓度50 μg/mL）。质粒pCAS-RK2T、pCpf1-RK2K和pSEVA-cRL48为浙江大学吴坚平教授惠赠。KOD FX DNA聚合酶购自东洋纺生物技术（大连），用于所有克隆操作。限制性内切酶、T4多核苷酸激酶、T4 DNA连接酶及Gibson组装试剂购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州）。DNA marker购自Takara Bio（大连）。化学试剂均为分析纯，购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州）或生工生物工程（上海）。本研究所用质粒信息列于表S1，所用引物列于表S2。
【数据】培养基：LB；温度：37°C；四环素/庆大霉素浓度：大肠杆菌10 μg/mL，铜绿假单胞菌50 μg/mL；菌株：E. coli DH5α、E. coli S17-1、E. coli MG1655
2.2 质粒构建
pCas12a-CrRNA质粒系列构建。 含Fncas12a基因的DNA片段从质粒pCpf1-RK2K扩增获得；含广宿主范围质粒RK2的oriT、trfA、oriV以及tetA、tetR基因的DNA片段从质粒pCAS-RK2T扩增获得；含crRNA表达盒（间隔序列替换为两个反向Esp3I位点）的DNA片段从质粒pSEVA-cRL48扩增获得，所用引物列于表S2。两个II型Esp3I位点可通过Golden Gate克隆法实现crRNA间隔序列的一步插入（见下文）。随后，这些DNA片段通过Gibson组装连接，获得质粒pCas12a-CrRNA-V。在该质粒中，FnCas12a由组成型SpCas9启动子PCas控制表达，crRNA通过组成型启动子PJ23119表达为加工后的repeat-guide形式（19-nt handle加23-nt spacer）。随后，基于pCas12a-CrRNA-V构建了一系列用于检测FnCas12a活性的质粒（pCas12a-CrRNA-X和pCas12a-CrRNA-NC），通过Golden Gate克隆在两个Esp3I位点之间插入23-bp双链突出端间隔序列。间隔序列通过两条部分反向互补的引物退火并磷酸化生成（表S2）。pCas12a-CrRNA-NC上的间隔序列“5′-CACTCTTGAGGGCCACAAAGCTT-3′”不靶向PAO1基因组上的任何序列。质粒pCas12a-CrRNA-phzM-HA通过在pCas12a-CrRNA-phzM的间隔序列下游30 bp处插入相应的同源臂（各500 bp）构建。
pCpf1-RK2T构建。 含sacB、PrhaB-crRNA支架、oriT和trfA的DNA片段使用引物LH20002/006从pCpf1-RK2K扩增；含Fncas12a、λ噬菌体exo、bet和gam的DNA片段使用引物LH20003/007从pCpf1-RK2K扩增；含oriV、tetA和tetR的DNA片段使用引物LH20001/004从pCAS-RK2T扩增。pCpf1-RK2T通过Gibson组装融合这三个DNA片段生成。
pCas12a-λRed构建。 含Fncas12a、λ噬菌体exo、bet和gam基因的DNA片段使用引物TT18237/240从质粒pCpf1-RK2K扩增；含广宿主范围质粒RK2的oriT、trfA、oriV以及tetA、tetR的DNA片段使用引物TT18241/242从质粒pCAS-RK2T扩增。两个DNA片段通过Gibson组装连接，生成pCas12a-λRed（图1A）。pCas12a-λRed的序列已提交GenBank（登录号：MT861051）。
pCrRNA-V构建。 含两个反向BsaI位的双链寡核苷酸通过两条部分互补的单链寡核苷酸（引物LH19186/187）退火生成，随后按制造商说明书用T4多核苷酸激酶进行磷酸化。所得寡核苷酸与PacI/SacI消化的pSEVA-cRL48连接，生成pSEVA-cRL48-BsaI。sacB基因使用引物LH19127/122从质粒pCAS-RK2T扩增，含aacC3、oriT的DNA片段使用引物LH19123/124从pSEVA-cRL48-BsaI扩增，含pBR322复制起点、pRO1600 rep、pRO1600 oriV及crRNA表达盒的DNA片段使用引物LH19125/126从pSEVA-cRL48-BsaI扩增。pCrRNA-V（图1B）通过Gibson组装融合这三个DNA片段生成。pCrRNA-V的序列已提交GenBank（登录号：MT861052）。
pCrRNA-Y构建。 含4-nt粘性末端的23-bp双链靶标特异性间隔序列通过两条除粘性末端外反向互补的寡核苷酸退火并磷酸化生成（表S2）。所得间隔序列插入pCrRNA-V的BsaI位点之间，生成中间质粒。随后，融合同源臂从铜绿假单胞菌基因组DNA通过重叠延伸PCR扩增，插入上述中间质粒的多克隆位点，生成pCrRNA-Y。pCrRNA-Y通过组成型启动子J23119表达crRNA为加工后的repeat-guide形式（19-nt handle加23-nt spacer）。用于构建pCrRNA-Y的同源臂长度为500 bp，除非另有说明。构建pCrRNA-phzM-I-rfp和pCrRNA-phzM-R-rfp时，单体红色荧光蛋白（RFP）mCherry基因rfp从pT008（本实验室未发表的rfp表达质粒）扩增。构建pCrRNA-phzM-I-lacZ和pCrRNA-phzM-R-lacZ时，lacZ基因从大肠杆菌MG1655基因组扩增。本工作所用pCrRNA-Y质粒系列列于表S1。
【数据】同源臂长度：500 bp；间隔序列长度：23 bp；crRNA结构：19-nt handle + 23-nt spacer；GenBank登录号：MT861051（pCas12a-λRed）、MT861052（pCrRNA-V）
2.3 crRNA间隔序列设计
crRNA使用在线工具Cas-Designer（http://www.rgenome.net/cas-designer/）设计。间隔序列按以下标准筛选：1）移码评分>66（Cas-Designer推荐值）；2）错配数=0；3）GC含量在30%至70%之间。使用Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）搜索并避免潜在的脱靶位点，确保设计的crRNA与铜绿假单胞菌PAO1基因组没有相似序列（≤3个错配）。
【数据】间隔序列筛选标准：移码评分>66；错配数=0；GC含量30%-70%；脱靶筛选≤3个错配
2.4 铜绿假单胞菌PAO1感受态细胞制备
质粒pCas12a-λRed通过接合或电穿孔转入铜绿假单胞菌PAO1。接合操作简述如下：将pCas12a-λRed转化入大肠杆菌S17-1获得供体菌株，然后按前述方法进行双亲本接合。电穿孔按标准方案进行。含pCas12a-λRed的细胞通过菌落PCR和16S rDNA测序鉴定。细胞在含四环素（50 μg/mL）的LB培养基中37°C过夜培养，加入0.1%（w/v）L-阿拉伯糖溶液诱导λRed重组酶表达1小时，随后离心，细胞沉淀用300 mM蔗糖或1 mM MgSO4洗涤两次，约109个电转感受态细胞通过重悬于300 mM蔗糖或1 mM MgSO4中制备。
图1 | 图注：使用SnapGene 3.1 (GSL Biotech LLC)绘制的pCas12a-λRed和pCrRNA-V质粒图谱。(A) 质粒pCas12a-λRed携带Fncas12a基因（通过天然Cas9启动子PCas表达）以及由L-阿拉伯糖诱导型启动子驱动的λRed重组酶基因（gam、bet和exo）。
【数据】诱导剂：0.1%（w/v）L-阿拉伯糖；诱导时间：1h；洗涤液：300 mM蔗糖或1 mM MgSO4；感受态细胞量：约109；四环素浓度：50 μg/mL；温度：37°C
2.5 电穿孔与基因组编辑
电穿孔时，约1 μg pCrRNA-Y质粒系列（≤5 μL）加入50 μL电转感受态细胞中。混合物转移至2-mm电转杯（Bio-Rad），在3 kV、400 Ω、25 μF条件下电击。脉冲后，细胞在……
【数据】电转条件：3 kV、400 Ω、25 μF；电转杯间距：2 mm；质粒用量：约1 μg（≤5 μL）；感受态细胞体积：50 μL
研究结果
3.1 靶标特异性crRNA引导的FnCas12a在铜绿假单胞菌中具有高致死性
前期研究中的初步实验表明，FnCas12a双质粒系统pCpf1-RK2K/pSEVA-gcR3361T和pCpf1-RK2K/pSEVA-gcR5301T能够在恶臭假单胞菌中实现基因删除。在此基础上，本研究探索了构建基于FnCas12a的铜绿假单胞菌基因组编辑系统的可能性。首先检测了FnCas12a核酸内切酶在铜绿假单胞菌中的活性。为此，构建了一系列五个质粒pCas12a-CrRNA-X（见材料与方法），其中X表示物种特异性靶基因algD（PA3540）、gyrB（PA0004）、oprL（PA0973）、phzM（PA4209）或toxA（PA1148），这些基因常用于铜绿假单胞菌的检测；以及阴性对照质粒pCas12a-CrRNA-NC，其在铜绿假单胞菌基因组中无靶标（图S2和表S1）。将质粒分别通过电穿孔导入PAO1细胞（约109个感受态细胞涂板）并培养24小时后，阴性对照产生约103个菌落形成单位（CFU），而pCas12a-CrRNA-X转化子的平板上未观察到菌落（图S2A），表明在靶向crRNA引导下，FnCas12a特异性切割基因组导致细菌死亡，估算逃逸率<10⁻³，与谷氨酸棒状杆菌中获得的结果一致。结果还表明，非同源末端连接（NHEJ）相关蛋白的活性不足以修复FnCas12a造成的损伤，尽管在铜绿假单胞菌的进化和适应实验中已鉴定出若干此类蛋白。随后研究了铜绿假单胞菌中是否存在能与FnCas12a介导的DNA切割协同作用的内源重组酶活性——这是实现高编辑效率所必需的。将含有FnCas12a、靶向phzM的crRNA及用于删除的同源臂的质粒pCas12a-CrRNA-phzM-HA转入PAO1细胞。转化后24小时获得的单菌落不含目标基因型（菌落PCR证实，图S2B），表明必须向编辑系统引入外源重组酶。
【数据】转化后培养时间：24h；阴性对照CFU：约10³；逃逸率：<10⁻³；感受态细胞数：约10⁹
3.2 铜绿假单胞菌双质粒CRISPR-Cas12a基因组编辑系统的建立
双质粒CRISPR-Cas系统比单质粒系统更便于多轮基因组编辑的质粒构建。为开发高效的铜绿假单胞菌双质粒编辑系统，本研究从双质粒系统pCpf1-RK2K/pSEVA-cRL48出发，该系统与pCpf1-RK2K/pSEVA-gcR3361T和pCpf1-RK2K/pSEVA-gcR5301T基本一致，仅23-bp间隔序列和同源臂序列不同。进行了以下修改：1）在质粒pCpf1-RK2K中，移除了sacB基因——因为在制备高效铜绿假单胞菌电转感受态细胞所需的蔗糖存在条件下，sacB会导致细胞死亡；同时移除了原本用于消除第二个质粒pSEVA-cRL48的鼠李糖诱导型crRNA表达盒，因其低渗漏表达可能导致第二个质粒过早丢失。取而代之，采用蔗糖反选择法消除第二个质粒（见下文）。由此得到编辑系统的第一个质粒pCas12a-λRed（图1A）。2）在crRNA质粒pSEVA-cRL48中，将同源臂替换为sacB基因盒用于质粒消除，将间隔序列替换为含两个反向BsaI位点的片段用于后续克隆目标crRNA间隔序列。所得质粒pCrRNA-V（图1B）用于构建靶标特异性crRNA质粒pCrRNA-Y（Y表示靶基因及相应同源臂）。
首先测试了该双质粒系统的删除效率（图2A）。选择非必需基因phzM作为靶标。为进行比较，将pCpf1-RK2K中的kanR替换为tetA和tetR，获得pCpf1-RK2T。分别从pCrRNA-V和pSEVA-cRL48（作为对照）构建了两个phzM特异性crRNA质粒（pCrRNA-phzM-1-D500和pSEVA-crphzM），均携带500 bp同源臂（表1）。将pCas12a-λRed和pCpf1-RK2T分别电转入独立的铜绿假单胞菌PAO1细胞培养物中，然后用300 mM蔗糖制备电转感受态细胞。同时使用效果较差的MgSO4作为对比。随后将pCrRNA-phzM-1-D500和pSEVA-crphzM分别电转入含pCas12a-λRed或pCpf1-RK2T的经阿拉伯糖诱导的PAO1电转感受态细胞中。如表1所示，对于用蔗糖制备的含pCas12a-λRed的电转感受态细胞，活细胞数和每μg CFU分别为5.0×10⁸和284，比用MgSO4制备时高一个数量级（分别为5.4×10⁷和31）。这些数值也比在恶臭假单胞菌中使用pCpf1-RK2T/pSEVA-crphzM双质粒系统且用蔗糖制备时高一个数量级（分别为2.5×10⁷和19）。这些结果表明，上述质粒修饰对于在铜绿假单胞菌中进行高效的FnCas12a编辑是必要的。值得注意的是，未添加阿拉伯糖的平板上仅存活了5个菌落，突显了外源重组酶的必要性（图S3）。将pCas12a-λRed或pCas12a-λRed/pCrRNA-phzM-1-D500导入PAO1细胞导致细胞生长延迟（图S4），可能是由于FnCas12a的组成型表达。这与先前关于Cas12a表达可能对某些宿主细胞产生毒性的研究一致。
随后构建了两组额外的pCrRNA-Y质粒：（1）pCrRNA-phzM-2-D和pCrRNA-phzM-3-D，携带另外两个靶向phzM基因的crRNA（表S1）；（2）pCrRNA-MexA-D和pCrRNA-oprM-D，分别用于删除mexA基因（PA0425）和oprM基因（PA0427），这两个基因参与绿脓菌素产生的调控。删除效率分别为92%（11/12）、92%（11/12）、75%（9/12）、100%（12/12）（图S5B和表2）。总体而言，结果表明该双质粒系统可高效删除靶基因。
图2 | 图注：基于CRISPR-Cas12a的系统在铜绿假单胞菌PAO1菌株中实现高效基因删除、插入和替换。(A) 左图，双质粒编辑系统进行基因删除的示意图；右图，phzM删除的菌落PCR和测序结果。(B) 左图……
【数据】蔗糖制备感受态：活细胞数5.0×10⁸，CFU/μg 284；MgSO4制备感受态：活细胞数5.4×10⁷，CFU/μg 31；恶臭假单胞菌对照：2.5×10⁷和19；无阿拉伯糖存活菌落数：5；删除效率：phzM-2 92%（11/12）、phzM-3 92%（11/12）、mexA 75%（9/12）、oprM 100%（12/12）
3.3 CRISPR-Cas12a系统实现基因插入与替换
接下来测试了该系统对两种不同大小模型基因的插入和替换能力（即带PTac启动子的rfp基因，长度783 bp；以及带天然启动子的lacZ基因，长度3149 bp，图2B、图2C、图S6A和图S6B）。据此构建了一系列四个pCrRNA-Y质粒：pCrRNA-phzM-I-rfp和pCrRNA-phzM-I-lacZ携带用于插入的修复臂，pCrRNA-phzM-R-rfp和pCrRNA-phzM-R-lacZ含有用于替换的重组模板（表S1）。rfp基因的插入和替换编辑效率分别为75%（9/12）和67%（8/12）（图S6A和图S6B，表2）。对于lacZ基因插入和替换的验证，仅选择X-gal平板上呈现蓝色的菌落进行分析——蓝色表明修复模板的存在——两种编辑均有100%的效率（12/12）（图2B和2C，表2）。蓝色菌落的比例……
【数据】rfp基因长度：783 bp（含PTac启动子）；lacZ基因长度：3149 bp（含天然启动子）；rfp插入效率：75%（9/12）；rfp替换效率：67%（8/12）；lacZ插入和替换效率：100%（12/12）
讨论与解读
本研究建立了一种基于工程化CRISPR-Cas12a双质粒系统的铜绿假单胞菌高效基因组编辑方法。该系统的pCas12a-λRed质粒移除了先前在恶臭假单胞菌中使用的sacB盒和鼠李糖诱导型crRNA表达盒。这些修饰允许在蔗糖存在下制备高效电转感受态细胞，并避免crRNA的潜在渗漏表达导致pCrRNA-Y质粒过早丢失。该系统可精确执行基因删除、插入和替换，并支持连续基因组编辑。通过同时表达两个合适的crRNA，还实现了长达15 kb的大DNA片段删除。鉴于电穿孔效率约为7.5×10⁵ CFU/μg DNA，编辑实验中获得的CFU约为300，phzM删除的重组频率粗略计算约为4×10⁻⁴（300/7.5×10⁵），比传统同源重组高1至3个数量级。需要注意的是，最近有研究报道Type I-C Cascade-Cas3系统可在铜绿假单胞菌中删除约420 kb的区域，但其在基因插入和替换方面的可行性仍有待验证。对于哺乳动物细胞的CRISPR-Cas基因组编辑，脱靶事件通常是……
编译者解读
本研究的核心价值在于对已有双质粒系统进行了精准的工程化改造——移除sacB和渗漏crRNA表达盒这两个看似"标准配置"的元件，显著提升了铜绿假单胞菌这种电转效率较低的菌种的编辑可行性。从合成生物学应用角度看，该系统的高效性（多数>75%）和模块化设计（Golden Gate一步插入间隔序列）使其便于推广至其他假单胞菌属菌株。不足之处在于FnCas12a的组成型表达对宿主产生生长延迟，可能影响某些生理学研究的准确性；此外，大片段删除虽达15 kb，但相比Cascade-Cas3的420 kb仍有差距，两种系统的适用场景有待进一步明确。
参考来源
Lin Z. Efficient genome editing for Pseudomonas aeruginosa using CRISPR-Cas12a[J]. Gene, 2021. DOI: 10.1016/j.gene.2021.145693
DOI: 10.1016/j.gene.2021.145693