来源：Characterization of two novel dye-decolorizing peroxidases from Burkholderia cepacia for accelerating lignin utilization in Pseudomonas putida（Industrial Crops and Products）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质素是地球上最丰富的芳香族聚合物，但其结构复杂性严重制约了生物炼制效率。本研究从洋葱伯克霍尔德菌ATCC 25416中鉴定并表征了两个新型染料脱色过氧化物酶（Dyp）——BcDyp1和BcDyp2。两酶展现出高催化效率、宽pH适应性、良好热稳定性和强底物抑制耐受性。通过鞭毛III型分泌系统在恶臭假单胞菌KT2440中异源分泌表达后，重组菌株以木质素为唯一碳源时的生长速率提高了3倍以上。
研究背景
木质素占陆地植物干重的15%–40%，由对香豆醇（H单元）、松柏醇（G单元）和芥子醇（S单元）三种单体木质醇聚合而成。制浆造纸工业每年产生5000–7000万吨木质素，纤维素生物燃料工业另产生6200万吨副产木质素。然而，目前仅有约2%的工业木质素被加工为增值产品（分散剂、粘合剂、表面活性剂等），绝大部分作为低价值燃料直接燃烧。木质素增值化的核心障碍在于其结构异质性——解聚产物的分离纯化极为困难。近年来，通过生物漏斗化（biological funneling）策略，基因工程菌可将木质素来源的异质芳香族化合物转化为中心芳香中间体，再进一步代谢为增值产品。染料脱色过氧化物酶（Dyp）作为一类分布广泛的血红素酶，在木质素降解中扮演关键角色。本研究旨在从洋葱伯克霍尔德菌中发掘性能优良的新型Dyp，并通过异源分泌表达策略加速假单胞菌的木质素利用。
研究方法
2.1 菌株、质粒、引物与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于表S1，寡核苷酸引物列于表S2。大肠杆菌菌株在Luria−Bertani（LB）培养基中培养，37°C、150 rpm振荡或静置培养；恶臭假单胞菌KT2440及其衍生菌株在LB肉汤或LB平板上30°C培养。木质素生长实验采用M9最小培养基，以0.3%（w/v）碱木质素作为唯一碳源。氯化血红素、愈创木酚、碱木质素及其他化学试剂购自Macklin公司。抗生素使用浓度如下：庆大霉素（Gm）30 μg/mL，卡那霉素（Km）50 μg/mL，四环素（Tet）30 μg/mL。
【数据】培养基：LB、M9；温度：37°C（E. coli）、30°C（P. putida）；转速：150 rpm；碳源：0.3%碱木质素；抗生素：Gm 30 μg/mL、Km 50 μg/mL、Tet 30 μg/mL
2.2 序列分析
以红球菌Rhodococcus jostii RHA1中已充分表征的DypB蛋白序列（UniProt登录号Q0SE24）为查询序列，使用本地BlastP工具（默认参数）在洋葱伯克霍尔德菌ATCC 25416中搜索新的染料脱色过氧化物酶。多序列比对使用Clustal W和ESPript 3.0进行。系统发育树分析采用MEGA X软件，使用邻接法（NJ）并设置1000次bootstrap重复。各Dyp蛋白序列从UniProt获取。BcDyp1和BcDyp2的同源模型分别以PpDyp（PDB 7QYQ）和ScDyp（PDB 4GU7）为模板，通过Swiss-Model在线服务器构建。BcDyp1/2与血红素的分子对接分析使用Discovery Studio 2019（BIOVIA Inc）中的CDOCKER模块，默认参数运行。
【数据】比对软件：Clustal W、ESPript 3.0；系统发育：MEGA X、NJ法、1000次bootstrap；模板：PpDyp（PDB 7QYQ）、ScDyp（PDB 4GU7）；对接：CDOCKER默认参数
2.3 BcDyp1和BcDyp2的克隆、表达与纯化
以B. cepacia ATCC 25416（GenBank登录号CP007746.1）基因组为模板，分别使用引物28a-BcDyp1-F/R和28a-BcDyp2-F/R扩增BcDyp1（DM41_5300）和BcDyp2（DM41_7536）基因片段。扩增产物通过Gibson一步克隆法克隆至pET-28a(+)载体的EcoR I位点，获得重组质粒pET-28a(+)-BcDyp1和pET-28a(+)-BcDyp2。重组质粒经测序验证。在大肠杆菌中异源表达时，将含有重组质粒的E. coli BL21（DE3）过夜培养物接种至400 mL新鲜LB培养基，初始OD600为0.01。待OD600达到0.4时，加入0.25 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）和0.25 g/L氯化血红素。随后在18°C、160 rpm条件下培养18小时，诱导后的E. coli细胞再静置3小时以促进血红素掺入。收集诱导细胞，超声破碎后，裂解液于4°C、12,000 rpm离心15分钟。取上清液通过Ni-NTA亲和层析柱（Sangon Biotech）纯化。洗脱组分经SDS-PAGE分析。纯化酶使用10 kDa超滤膜（Millipore）浓缩脱盐，用于后续酶学测定。蛋白浓度由BCA蛋白定量试剂盒（Vazyme Biotech）测定。BcDyp1和BcDyp2的Reinheitszahl值（Rz = A406/A280）使用UV–1800（SHIMADZU）分光光度计测定。
【数据】诱导剂：0.25 mM IPTG；血红素：0.25 g/L；表达条件：18°C、160 rpm、18 h + 静置3 h；离心：4°C、12,000 rpm、15 min；超滤膜：10 kDa；Rz值：BcDyp1为0.65、BcDyp2为0.59
2.4 酶活测定
过氧化物酶活性采用分光光度法测定，参照先前报道的方法并略作修改。反应体系为1 mL 50 mM丙二酸钠缓冲液，含1 mM ABTS和10 nM BcDyp。加入终浓度0.1 mM的H2O2启动反应。30°C孵育10分钟后，加入等体积1% SDS终止反应。过氧化物酶活性根据420 nm处ABTS阳离子自由基的摩尔消光系数36,000 M⁻¹ cm⁻¹计算。为研究pH和温度对酶活的影响，在20–60°C温度范围和pH 2–8范围内测定BcDyp1和BcDyp2的过氧化物酶活性。Mn²⁺对酶活的影响在相似条件下评估，MnCl2浓度范围为0–10 mM。稳态反应动力学在最优反应条件下测定。BcDyp1和BcDyp2对ABTS的动力学参数在50 mM丙二酸钠缓冲液中测定，BcDyp1于30°C、pH 5.0，BcDyp2于pH 3.0，含4 mM H2O2。对H2O2的动力学参数在相似条件下测定，BcDyp1和BcDyp2的ABTS浓度分别为20 mM和7.5 mM。对愈创木酚的动力学参数在相同条件下测定，愈创木酚浓度范围为0–30 mM，监测波长465 nm（ε465 = 26,600 M⁻¹ cm⁻¹）。结果使用Graphpad Prism 10非线性回归拟合至Michaelis-Menten方程。
【数据】ABTS浓度：1 mM；H2O2：0.1 mM（酶活）、4 mM（动力学）；酶量：10 nM；缓冲液：50 mM丙二酸钠；温度：30°C；时间：10 min；终止：1% SDS；ε420 = 36,000 M⁻¹ cm⁻¹；ε465 = 26,600 M⁻¹ cm⁻¹；pH：BcDyp1为5.0、BcDyp2为3.0；ABTS动力学浓度：BcDyp1为20 mM、BcDyp2为7.5 mM；愈创木酚范围：0–30 mM
2.5 热稳定性测定
BcDyp1和BcDyp2的热稳定性通过测定半失活温度（T50）评估。两种Dyp在20–70°C温度范围内孵育10分钟，随后冰浴冷却5分钟，恢复至室温后进行标准酶活测定。数据经非线性回归拟合计算T50值。半衰期（t1/2）测定中，纯化酶储存于PBS（pH 7.0）缓冲液中，分别置于30、40和50°C条件下48小时。在不同时间点测定酶的相对活性，初始酶活定义为100%。t1/2值按公式t1/2 = ln2/kd计算，失活速率常数kd通过一级线性回归方程ln(相对活性) = kd × t确定。
【数据】温度范围：20–70°C；孵育时间：10 min；储存温度：30、40、50°C；储存时间：48 h；缓冲液：PBS pH 7.0；计算：t1/2 = ln2/kd
2.6 Mn²⁺氧化测定
Mn²⁺氧化测定在1 mL 50 mM丙二酸钠缓冲液中进行，含4 mM H2O2、20 nM BcDyp1或BcDyp2、0.1–40 mM MnCl2。反应在30°C、BcDyp1和BcDyp2各自的最适pH条件下进行。Mn³⁺-丙二酸复合物的形成在270 nm处测定（ε270 = 11.9 mM⁻¹ cm⁻¹）。
【数据】缓冲液：50 mM丙二酸钠；H2O2：4 mM；酶量：20 nM；MnCl2：0.1–40 mM；温度：30°C；检测波长：270 nm；ε270 = 11.9 mM⁻¹ cm⁻¹
2.7 木质素模型化合物GGE的氧化降解及LC-MS/MS分析
木质素模型化合物愈创木基甘油-β-愈创木基醚（GGE）按先前报道的方法制备，终浓度为10 mM。50 μg纯化酶BcDyp1或BcDyp2与2 mM GGE在含4 mM H2O2的50 mM丙二酸钠缓冲液（pH 8.0）中反应，30°C孵育12小时。反应混合物中加入等体积0.1%（v/v）TFA水溶液，经0.22 μm针头过滤器过滤。HPLC分析使用C18反相色谱柱（Supersil，5 μm，4.6 × 250 mm，Elite），在UltiMate 3000分析仪（Thermo Fisher Scientific）上进行，流速0.8 mL/min，检测波长280 nm。洗脱梯度如下：0–5 min，20–30% MeOH/H2O；5–12 min，30–50% MeOH/H2O；12–25 min，50–80% MeOH/H2O；25–30 min，80–20% MeOH/H2O。BcDyp1或BcDyp2氧化GGE的产物通过ESI-MS分析，使用UltiMate 3000色谱系统联用Q-Exactive（Thermo Fisher Scientific）质谱仪，负离子模式检测。
【数据】GGE浓度：10 mM（制备）、2 mM（反应）；酶量：50 μg；缓冲液：50 mM丙二酸钠 pH 8.0；H2O2：4 mM；温度：30°C；时间：12 h；流速：0.8 mL/min；检测波长：280 nm；色谱柱：C18反相（5 μm，4.6 × 250 mm）
2.8 P. putida突变株与分泌重组质粒的构建
CRISPR-Cas12a系统用于构建P. putida KT2440的ΔfliC和ΔfliCΔhcp突变株。具体操作参照先前报道的方法进行。用于分泌表达的质粒pMB693-BcDyp1和pMB693-BcDyp2基于pMB693骨架构建，BcDyp1和BcDyp2基因置于强组成型启动子P31控制下，融合鞭毛III型分泌信号肽以实现分泌表达。
【数据】启动子：P31；分泌系统：鞭毛III型分泌系统；突变株：ΔfliC、ΔfliCΔhcp；质粒：pMB693-BcDyp1、pMB693-BcDyp2
研究结果
3.1 B. cepacia中Dyp的鉴定与表征
染料脱色过氧化物酶（Dyp）是一类在真菌和细菌中广泛分布的血红素酶。为鉴定B. cepacia ATCC 25416中的Dyp蛋白，我们使用R. jostii RHA1中已充分表征的DypB序列进行本地BlastP搜索。在B. cepacia ATCC 25416中鉴定到两个Dyp蛋白——BcDyp1（DM41_5300）和BcDyp2（DM41_7536），序列一致性分别为27%和53%。多序列比对分析显示，BcDyp1和BcDyp2均含有保守的GXXDG催化基序，该基序被认为是所有类别Dyp的标志性序列。与先前报道一致，BcDyp1和BcDyp2中均发现三个与血红素结合相关的保守残基（His、Asp和Arg），环绕在血红素口袋周围（图1B和C）。尽管蛋白序列差异显著，BcDyp1和BcDyp2具有相似的3D结构。
根据一级蛋白序列，Dyp分为四类：A类、B类和C/D类。细菌Dyp主要分布于A类、B类和C类，真菌Dyp大多属于D类。系统发育分析表明，BcDyp1和BcDyp2均属于B类（图2）。B类Dyp通常被认为源于细菌，且分子尺寸小于其他类别。BcDyp1和BcDyp2经Ni-NTA亲和层析纯化，理论分子量分别为32.0 kDa和36.9 kDa。两者的UV-vis光谱呈现典型的血红素过氧化物酶光谱特征，Soret带位于407 nm，Reinheitszahl值分别为0.65和0.59。
【数据】序列一致性：BcDyp1为27%、BcDyp2为53%；分子量：32.0 kDa（BcDyp1）、36.9 kDa（BcDyp2）；Soret带：407 nm；Rz值：0.65（BcDyp1）、0.59（BcDyp2）
3.2 pH和温度对BcDyp1和BcDyp2的影响
大多数天然Dyp在以ABTS为底物时，在pH 2–4的酸性范围内保持高酶活。但随着pH升高，Dyp活性迅速下降。例如，来自卷曲热单孢菌的TcDyP在pH 3时对ABTS活性最高，而在pH 5或6时几乎完全失活。我们在pH 2–8范围内以ABTS和H2O2为共底物考察了pH对BcDyp1和BcDyp2的影响。BcDyp1和BcDyp2的最适pH分别为5和3（图3A）。有趣的是，BcDyp1在pH 3–8的宽范围内均表现出活性，在pH 7时仍保留超过40%的相对活性，表明BcDyp1可能比BcDyp2具有更优越的pH稳定性。此外，BcDyp1和BcDyp2表现出相似的温度偏好，均在30°C时活性最高（图3B）。
【数据】最适pH：BcDyp1为5、BcDyp2为3；pH 7时BcDyp1保留活性：>40%；最适温度：30°C
3.3 动力学性质
在最适反应条件下测定了BcDyp1和BcDyp2对ABTS、H2O2和愈创木酚的动力学参数。BcDyp1对ABTS和H2O2的Km值分别为3.86和0.78 mM。相比之下，BcDyp2对ABTS的Km为0.29 mM，对H2O2的Km为0.19 mM，表明BcDyp2对两种底物的亲和力均强于BcDyp1。此外，BcDyp2对ABTS和H2O2的催化效率（kcat/Km）分别是BcDyp1的7.5倍和2.63倍。在细菌Dyp中，BcDyp2在ABTS氧化方面表现出相对较高的催化效率，比来自抗辐射不动杆菌的Ar-DyP高6.2倍。相比之下，BcDyp1对愈创木酚的活性较低，kcat为0.017 s⁻¹，Km为0.346，而BcDyp2对愈创木酚无活性。BcDyp1对愈创木酚的催化效率比Ar-Dyp低2.45倍。
底物抑制是Dyp中的常见现象。先前研究报道，天蓝色链霉菌A3(2)的所有三种Dyp均被升高浓度的ABTS抑制。来自恶臭假单胞菌MET94的PpDyp和来自枯草芽孢杆菌168的BsDyp对H2O2敏感，Ki值分别为0.4和0.2 mM。本研究中，BcDyp1和BcDyp2在高底物浓度下均不易失活。有趣的是，即使在H2O2浓度高达40 mM时，BcDyp1和BcDyp2的酶活仍分别保持在50%和70%以上。这些结果表明，BcDyp1和BcDyp2可成为高底物浓度工业应用中的理想生物催化剂。
【数据】BcDyp1对ABTS的Km：3.86 mM；BcDyp1对H2O2的Km：0.78 mM；BcDyp2对ABTS的Km：0.29 mM；BcDyp2对H2O2的Km：0.19 mM；kcat/Km倍数：ABTS为7.5倍、H2O2为2.63倍；vs Ar-DyP：6.2倍；BcDyp1愈创木酚kcat：0.017 s⁻¹、Km：0.346；vs Ar-Dyp：低2.45倍；40 mM H2O2时残余活性：BcDyp1 >50%、BcDyp2 >70%
3.4 BcDyp1和BcDyp2的热稳定性
热稳定性是决定酶应用领域的关键因素。我们在20–60°C温度范围内评估了BcDyp1和BcDyp2的热稳定性。如图4A和C所示，BcDyp1的T50值为51°C，比BcDyp2（41°C）高10°C。在30°C、40°C和50°C下考察了BcDyp1和BcDyp2的半衰期（图4B和D）。在50°C时，BcDyp1的半衰期约为9.6分钟，而BcDyp2的活性迅速下降，半衰期仅1.8分钟。在40°C时，BcDyp1的半衰期约为14小时，是BcDyp2的20倍。BcDyp1和BcDyp2在30°C时均相对稳定，半衰期分别超过30.2小时和25.9小时。总体而言，BcDyp1在热稳定性方面略优于BcDyp2。因此，BcDyp1和BcDyp2目前更适合用于中温细菌细胞工厂，而非高温催化过程。未来可通过理性设计策略（如基于能量的方法和共有序列引导的突变）进一步增强BcDyp1和BcDyp2的热稳定性，从而拓宽其应用前景。
【数据】T50：BcDyp1为51°C、BcDyp2为41°C；50°C半衰期：BcDyp1为9.6 min、BcDyp2为1.8 min；40°C半衰期：BcDyp1约14 h（BcDyp2的20倍）；30°C半衰期：BcDyp1 >30.2 h、BcDyp2 >25.9 h
3.5 Mn²⁺对BcDyp1和BcDyp2催化活性的影响
先前研究报道，R. jostii RHA1 DypB在Mn²⁺存在下对ABTS的催化活性可提高8.5倍。为评估Mn²⁺对BcDyp1和BcDyp2的影响，以ABTS为底物进行测定。如图5A所示，添加2 mM MnCl2后BcDyp1对ABTS的活性急剧下降，与R. jostii RHA1 DypB形成鲜明对比。当Mn²⁺浓度达到4 mM时，BcDyp1保留约25%的最大酶活，继续升高Mn²⁺浓度至10 mM时未观察到进一步下降。与BcDyp1不同，BcDyp2的活性基本不受Mn²⁺浓度变化的影响。
许多细菌Dyp，包括R. jostii RHA1的DypB和恶臭假单胞菌MET94的PpDyp，已被报道可在H2O2存在下氧化Mn²⁺。与预期一致，BcDyp1通过过氧化物依赖的Mn²⁺氧化生成的Mn³⁺-丙二酸复合物在270 nm处被检测到（图5B）。然而，BcDyp1的Mn²⁺氧化活性低于R. jostii RHA1 DypB和B. subtilis BsDyp。此外，BcDyp2对Mn²⁺氧化无活性，暗示BcDyp2可能缺乏Mn²⁺结合位点或对Mn²⁺的结合亲和力较低。先前研究报道，DypB Mn²⁺结合位点第246位天冬氨酸突变为丙氨酸后，其催化效率（kcat/Km）提高了15倍。因此，通过Mn²⁺结合位点的定点突变可能增强BcDyp1和BcDyp2的Mn²⁺氧化活性。
【数据】2 mM MnCl2时BcDyp1活性急剧下降；4 mM Mn²⁺时残余活性：约25%；10 mM Mn²⁺无进一步降低；Mn³⁺-丙二酸复合物检测波长：270 nm；DypB Mn²⁺催化效率提升：15倍（D246A突变）
3.6 BcDyp1和BcDyp2对GGE的氧化
为研究BcDyp1和BcDyp2的木质素降解能力，使用木质素模型二聚体化合物GGE作为底物。HPLC分析显示，BcDyp1和BcDyp2均能氧化GGE，产生多种氧化产物（图6）。LC-MS/MS分析进一步鉴定了这些产物的分子结构，证实两种酶能够裂解GGE中的β-O-4键，这是木质素中最主要的连接键类型。
【数据】底物：GGE（2 mM）；酶量：50 μg；H2O2：4 mM；缓冲液：50 mM丙二酸钠 pH 8.0；温度：30°C；时间：12 h
3.7 BcDyp1和BcDyp2异源分泌表达对P. putida木质素利用的影响
将BcDyp1和BcDyp2通过鞭毛III型分泌系统在P. putida KT2440及其衍生菌株中异源分泌表达。如图7A所示，含有pMB693-BcDyp1的ΔfliC突变株和含有pMB693-BcDyp2的ΔfliCΔhcp突变株表现出显著的细胞外Dyp活性。在以碱木质素为唯一碳源的M9培养基中培养时，重组菌株ΔfliC（pMB693-BcDyp1）和ΔfliCΔhcp（pMB693-BcDyp2）的生长速率比对照菌株提高了3倍以上（图7B），表明BcDyp1和BcDyp2的分泌表达显著增强了P. putida的木质素利用能力。
【数据】生长速率提升：>3倍；碳源：0.3%碱木质素；培养基：M9最小培养基
讨论与解读
本研究从B. cepacia ATCC 25416中鉴定并系统表征了两个新型Dyp——BcDyp1和BcDyp2。两者虽同属B类Dyp，但生化特性差异显著：BcDyp1具有更宽的pH适应范围（pH 3–8）和更高的热稳定性（T50为51°C），而BcDyp2对ABTS和H2O2的底物亲和力更强、催化效率更高。值得注意的是，两酶均对高浓度H2O2表现出优异的耐受性——40 mM H2O2下仍保留50%以上活性——这在工业应用中具有实际价值。通过鞭毛III型分泌系统在P. putida中分泌表达后，重组菌株的木质素利用效率显著提升。未来的优化方向包括增强P. putida内源5-氨基乙酰丙酸（ALA）合成以提高血红素供应、改善菌株对木质素和H2O2的耐受性，以及通过CRISPR相关转座酶整合多基因拷贝来优化木质素解聚酶系统。
编译者解读：该研究在Dyp酶的发掘策略上体现了"以应用为导向"的筛选逻辑——不仅关注催化效率，更重视pH耐受性、热稳定性和底物抑制抗性等工业相关指标。将BcDyp1和BcDyp2通过III型分泌系统直接输出到胞外，巧妙绕过了木质素大分子难以跨膜的问题。不过，两酶在Mn²⁺氧化能力上的差异提示其天然底物可能不同，后续若通过定点突变（如D246A类似策略）增强Mn²⁺氧化活性，有望进一步提升木质素降解效率。整体而言，该工作为木质素生物加工提供了新的酶学工具和分泌表达策略。
参考来源
He, F. (2025). Characterization of two novel dye-decolorizing peroxidases from Burkholderia cepacia for accelerating lignin utilization in Pseudomonas putida. Industrial Crops and Products. DOI: 10.1016/j.indcrop.2025.121460
DOI: 10.1016/j.indcrop.2025.121460