来源：Development of a rapid and visual detection platform for Pseudomonas plecoglossicida in large yellow croaker (Larimichthys crocea) based on the RPA-CRISPR/Cas12a system（Aquaculture）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
杀鲑气单胞菌（P. plecoglossicida）是水产养殖中危害严重的革兰氏阴性病原菌，引起多种鱼类内脏白点病，造成重大经济损失。本研究以 gyrB 基因保守区为靶标，将重组酶聚合酶等温扩增（RPA）与 CRISPR/Cas12a 系统相结合，并引入侧向流动试纸条（LFS），构建了无需专业仪器的快速可视化检测平台。检测灵敏度达 2.34 × 10² copies/反应，特异性良好，在实际感染大黄鱼组织样本中验证了应用潜力。
研究背景
P. plecoglossicida 于 2000 年首次从日本香鱼细菌性出血性腹水症中分离获得，如今可感染多种淡水和海水鱼类。在淡水鱼中主要引起败血症和腹水；而在大黄鱼、点带石斑鱼等海水鱼中则典型表现为“内脏白点病”，在肝、肾、脾等器官形成白色结节和肉芽肿。若不加控制，P. plecoglossicida 感染常与其他微生物感染并发，导致死亡率升高，给水产养殖业带来显著经济损失。大黄鱼是中国水产养殖的重要经济物种，年产量超过许多其他海水养殖鱼类，但细菌性和病毒性疾病暴发严重制约了产业发展。感染早期外部症状不明显，往往数日内即出现高死亡率，因此早期检疫对疾病防控至关重要。目前尚无商业化药物和疫苗，建立快速、灵敏的现场检测方法尤为迫切。
研究方法
2.1 菌株与质粒构建
本研究所用菌株和引物列于附表 S1 和 S2。由于 gyrB 基因序列相对保守，选择 P. plecoglossicida 的 gyrB 基因作为检测靶标（图 1B 和附表 S3）。为构建阳性对照质粒，扩增 gyrB 基因序列（GenBank 登录号：AB178862.1）并连接至 pUC19 质粒（Thermo Fisher Scientific，美国）。重组质粒转化至 E. coli DH5α 感受态细胞（TransGen Biotech，北京），筛选阳性克隆用于后续实验。
【数据】靶基因：gyrB（AB178862.1）；载体：pUC19；宿主菌：E. coli DH5α
2.2 crRNA 制备
基于 gyrB 基因（AB178862.1），使用 CRISPR RGEN Tools（www.rgenome.net）设计三条 crRNA。在保守 gyrB 基因序列中鉴定 PAM 位点（TTTV，V = G、A 或 C），根据 crRNA 与靶序列的互补配对特性，选择 PAM 位点侧翼 15–25 bp 区域作为靶序列。从候选序列中选取能特异性区分 P. plecoglossicida 与其他假单胞菌的保守序列（图 1A）。crRNA 序列由骨架序列（UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU）和选定的引导序列组成。为进行 crRNA 的体外合成，合成了含有 T7 启动子（TAATACGACTCACTATAGGG）、骨架序列和引导序列的单链 DNA（ssDNA）（附表 S4），同时合成互补链，两条链退火形成双链 DNA（dsDNA）。随后使用 T7 High Yield RNA Transcription Kit（Vazyme Biotech，南京）通过体外转录合成 crRNA。使用 Nanodrop 2000（Thermo Fisher Scientific，美国）测定合成 crRNA 浓度，并于 −80 °C 保存。
【数据】PAM 位点：TTTV（V = G/A/C）；靶序列长度：15–25 bp；T7 启动子：TAATACGACTCACTATAGGG；保存温度：−80 °C
2.3 基因组 DNA 提取
使用 Omega Bacteria DNA Kit（OMEGA，中国）按制造商说明书提取基因组 DNA。组织样本使用 Qiagen DNA Extraction Kit（Qiagen，德国）按制造商说明书略作修改后提取基因组 DNA。
【数据】试剂盒：Omega Bacteria DNA Kit / Qiagen DNA Extraction Kit
2.4 基于 CRISPR/Cas12a 的 crRNA 靶标筛选
使用 CRISPR/Cas12a 实验筛选三条 crRNA。以引物 gyrB-F/R（附表 S2）PCR 扩增 gyrB 序列，产物用作 CRISPR/Cas12a 反应模板。反应体系含 4 μL 100 nM LbCas12a（New England Biolabs，英国）、2 μL 10 × NEBuffer 2.1、400 nM crRNA、2 μL 1000 nM FAM-N7-BHQ1 ssDNA 报告分子（附表 S2）和 3 μL PCR 产物，加入无核酸酶水调整总体积至 20 μL。反应在 37 °C 下进行 30 分钟。使用凝胶成像分析系统（上海天能生命科学有限公司，中国）在紫外光下观察荧光信号。
为达到最佳性能，对 Cas12a 浓度、FAM-N7-BHQ1 ssDNA 报告分子浓度和 Cas12a 切割时间进行了优化。使用 StepOnePlus Real-Time PCR 系统（Applied Biosystems，美国）监测 CRISPR/Cas12a 反应的荧光变化。以引物 gyrB-F2/R2（附表 S2）PCR 扩增 gyrB 基因，PCR 产物用作 CRISPR/Cas12a 实验的模板。反应在 37 °C 下进行 30 分钟，每 60 秒记录一次荧光强度。所有实验至少进行三次重复，每次实验设三个生物学重复。使用凝胶成像系统（上海天能生命科学有限公司，中国）在紫外光下观察荧光信号。
【数据】Cas12a 浓度：100 nM（4 μL）；缓冲液：10 × NEBuffer 2.1（2 μL）；crRNA 浓度：400 nM；报告分子：1000 nM FAM-N7-BHQ1 ssDNA（2 μL）；模板：3 μL PCR 产物；总体积：20 μL；温度：37 °C；时间：30 min；荧光记录间隔：60 s
2.5 RPA 引物设计与筛选
根据 TwistAmp Assay Design Manual（https://www.twistdx.co.uk/support/rpa-assay-design/）设计三组靶向 gyrB 基因（AB178862.1）保守区的 RPA 引物，序列列于附表 S2。设计 RPA 引物时遵循两条关键原则：引物序列不得与 crRNA 重叠，且 crRNA 应靶向 RPA 扩增子内的保守区域。为筛选 RPA 引物，使用 RPA 引物、gyrB-pUC19 质粒和 TwistAmp Basic 试剂盒（TwistDx，剑桥，英国）按制造商说明书略作修改后扩增 gyrB 基因。具体操作：向反应管中加入 29.5 μL 重悬缓冲液、11.2 μL 无核酸酶水、正向和反向引物各 2.4 μL（10 μM）、2 μL gyrB-pUC19 质粒和 2.5 μL 乙酸镁。反应在 37 °C 下进行 30 分钟。产物经琼脂糖凝胶电泳分析，并用作 CRISPR/Cas12a 反应的模板。使用 StepOnePlus Real-Time PCR 系统（Applied Biosystems，美国）监测荧光变化。每次实验三次重复，三个独立生物学重复。产物同时使用凝胶成像系统（上海天能生命科学有限公司，中国）在紫外光下观察。
【数据】重悬缓冲液：29.5 μL；无核酸酶水：11.2 μL；引物：各 2.4 μL（10 μM）；质粒模板：2 μL；乙酸镁：2.5 μL；温度：37 °C；时间：30 min
2.6 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法
按上述方法建立 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法。以 gyrB-pUC19 质粒作为 RPA 反应模板，所得扩增产物随后用于 CRISPR/Cas12a 检测。使用 StepOnePlus Real-Time PCR 系统（Applied Biosystems，美国）定量荧光强度，并在紫外光下观察产物。
为评估 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法的灵敏度，使用不同拷贝数（2.34 × 10⁶ 至 2.34 × 10⁰ copies）的 gyrB-pUC19 质粒作为模板。监测荧光强度并在紫外光下观察结果。质粒拷贝数按以下公式计算：质粒拷贝数 =（质量 × 6.022 × 10²³）/（长度 × 1 × 10⁹ × 650）。同时使用拷贝数为 2.34 × 10⁶ 至 2.34 × 10⁰ 的 gyrB-pUC19 质粒测试 PCR 检测的灵敏度。
此外，使用其他假单胞菌和常见海洋鱼类病原菌的基因组 DNA 评估 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法的特异性，包括铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、恶臭假单胞菌（P. putida）、荧光假单胞菌（P. fluorescens）、副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）、迟缓爱德华氏菌（E. tarda）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、哈维氏弧菌（V. harveyi）、海豚链球菌（S. iniae）和鲑肾诺卡菌（N. seriolae）。这些样本用作 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法的模板。
【数据】质粒拷贝数范围：2.34 × 10⁰–2.34 × 10⁶ copies；拷贝数公式：（amount × 6.022 × 10²³）/（length × 1 × 10⁹ × 650）；特异性检测菌株：9 种
2.7 侧向流动试纸条（LFS）检测
为拓宽 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法的适用性，开发了侧向流动试纸条检测方法。RPA 反应按前述方法进行，区别在于 CRISPR/Cas12a 检测中将 FAM-N7-BHQ1 ssDNA 报告分子替换为 FAM-N15-Biotin ssDNA 报告分子（附表 S2）。反应结束后，将产物加样至商业化侧向流动试纸条（南京沃博生物科技有限公司，中国），室温孵育 5 分钟，用肉眼观察结果。RPA-CRISPR/Cas12a-LFS 检测方法的灵敏度和特异性按前述方法评估。
【数据】报告分子：FAM-N15-Biotin ssDNA；试纸条：南京沃博；孵育：室温 5 min；结果判读：肉眼
2.8 重复性实验
在先前优化的条件下进行 RPA-CRISPR/Cas12a 检测，以 P. plecoglossicida 基因组 DNA 为模板，以无核酸酶水作为非模板对照（NTC）。RPA 反应平行进行六次，每次反应孵育 30 分钟。所得产物分别进行 CRISPR/Cas12a 介导的荧光检测和侧向流动试纸条检测，每组设三个复孔。使用 StepOnePlus Real-Time PCR 系统测量荧光值。
【数据】重复次数：6 次；孵育时间：30 min；复孔数：3
研究结果
3.1 基于 CRISPR/Cas12a 的 *P. plecoglossicida* 检测
为快速检测 P. plecoglossicida，利用 Cas12a 蛋白、特异性 crRNA 和 FAM-N7-BHQ1 ssDNA 报告分子构建了 CRISPR/Cas12a 检测方法（图 1A）。选择 gyrB 基因作为靶标，因其对 P. plecoglossicida 具有高度保守性和特异性。将 P. plecoglossicida 的 gyrB 基因片段与其他假单胞菌（P. aeruginosa、P. putida 和 P. fluorescens）的对应序列进行比对，以鉴定 P. plecoglossicida 特异性区域（图 1B 和附表 S3）。利用这些特异性序列设计 crRNA 用于靶向检测。共设计并体外转录合成了三条 crRNA，每条 crRNA 靶向 gyrB 基因内不同的富含 T 的 PAM 位点（图 1B）。PCR 扩增 gyrB 基因，产物用作 CRISPR/Cas12a 荧光检测的模板。
结果显示，crRNA1 和 crRNA2 在存在 DNA 模板和阳性 ssDNA 激活子的条件下，于紫外光下产生绿色荧光，而阴性对照无信号（图 1C）。尽管 crRNA1 和 crRNA2 引发的荧光强度差异不明显（图 1C），但鉴于 crRNA1 具有更高的序列保守性（图 1B），选择 crRNA1 用于后续 CRISPR/Cas12a 检测。
【数据】阳性 crRNA：crRNA1、crRNA2；阴性对照：无荧光信号；检测方式：紫外光下绿色荧光
3.2 CRISPR/Cas12a 检测条件的优化
为确定 CRISPR/Cas12a 检测的最佳反应条件，系统评估了三个关键参数：Cas12a 蛋白浓度、FAM-N7-BHQ1 ssDNA 报告分子浓度和 Cas12a 切割时间。
首先测试了 10、50、100 和 200 nM 的 Cas12a 蛋白浓度。荧光强度随浓度增加而升高，在 100 nM 时达到平台期，因此选择 100 nM 作为最佳 Cas12a 浓度（图 2A、B）。随后检测了 500、700、1000 和 2000 nM 的 FAM-N7-BHQ1 ssDNA 报告分子浓度。荧光强度在 1000 nM 时达到平台期，确定为最佳报告分子浓度（图 2C、D）。最后，为确定最佳 Cas12a 切割时间，评估了 0、5、10、20、30 和 40 分钟的反应时长。荧光强度在 30 分钟后达到平台期，表明 30 分钟为最佳切割时间（图 2E、F）。
基于上述结果，CRISPR/Cas12a 检测 P. plecoglossicida 的最佳条件为：100 nM Cas12a、1000 nM FAM-N7-BHQ1 ssDNA 报告分子、切割反应 30 分钟。所有后续 CRISPR/Cas12a 反应均在此条件下进行。
【数据】Cas12a 最佳浓度：100 nM；报告分子最佳浓度：1000 nM；最佳切割时间：30 min；测试浓度范围：Cas12a 10–200 nM，报告分子 500–2000 nM，时间 0–40 min
3.3 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法的建立
为降低仪器依赖、提高便携性，开发了 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法。该方法将 RPA 反应与 CRISPR/Cas12a 检测相结合（图 3A），显著提高了检测灵敏度。为获得最适引物，针对 P. plecoglossicida 基因组设计了三组 RPA 引物。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，观察到预期大小的 DNA 片段（图 3B）。以 RPA 扩增产物为模板进行 CRISPR/Cas12a 反应。如图 3C 所示，三组 RPA 引物在紫外光下均产生绿色荧光。荧光定量结果显示，引物组 RPA1 产生的信号强度略高于另外两组（图 3D）。因此，选择引物 RPA1 用于后续实验。
为评估 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法的灵敏度，使用浓度为 2.34 × 10⁰ 至 2.34 × 10⁶ copies 的 gyrB-pUC19 质粒作为模板。结果表明，拷贝数为 2.34 × 10² 至 2.34 × 10⁶ 的质粒模板在紫外光下产生绿色荧光信号。RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法的检测限（LOD）为每反应 2.34 × 10² copies（图 3E）。实时荧光 PCR 结果显示，2.34 × 10² copies 质粒模板产生的荧光强度显著高于非模板对照（NTC）组（P < 0.01）。上述结果表明，RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法的检测限为每反应 2.34 × 10² copies（图 3F）。
随后，为评估 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法的特异性，提取 P. plecoglossicida、其他假单胞菌和常见海洋鱼类病原菌的基因组 DNA，进行 RPA-CRISPR/Cas12a 检测。结果显示，仅在 P. plecoglossicida 中观察到紫外光下的绿色荧光信号，而 P. aeruginosa、P. putida、P. fluorescens、V. parahaemolyticus、E. tarda、V. alginolyticus、V. harveyi、S. iniae 和 N. seriolae 均无信号。结果表明 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法对 P. plecoglossicida 具有高特异性（图 3G）。
【数据】最佳引物：RPA1；LOD：2.34 × 10² copies/反应；检测范围：2.34 × 10²–2.34 × 10⁶ copies；P 值：< 0.01；特异性：9 种非靶标菌均无交叉反应
3.4 RPA-CRISPR/Cas12a-LFS 检测方法的建立
为实现 P. plecoglossicida 的便携式可视化检测，将 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法与侧向流动试纸条结合，开发了用户友好的检测方法（图 4A）。同样评估了基于 LFS 的检测方法的灵敏度和特异性。结果显示，RPA-CRISPR/Cas12a-LFS 检测方法的检测限为每反应 2.34 × 10² copies（图 4B）。特异性测试表明，仅含 P. plecoglossicida 的样本在 LFS 上产生可见的测试线，其他病原菌均无信号，证实该方法具有高特异性（图 4C）。
【数据】LFS 法 LOD：2.34 × 10² copies/反应；特异性：仅 P. plecoglossicida 出现测试线
3.5 重复性评估
为评估检测平台的重复性，以 P. plecoglossicida 基因组 DNA 为模板进行六次独立 RPA 反应。所得扩增子分别用 CRISPR/Cas12a 荧光检测和侧向流动试纸条检测进行分析。结果显示，六次测试均为阳性，荧光强度仅有微小差异（图 5A、B、C）。变异系数（CV）按公式 CV =（标准差 / 平均值）× 100 % 计算，为 6.206 %（图 5B）。上述结果表明所建立的检测方法具有良好的重复性。
【数据】重复次数：6 次；阳性率：6/6；CV：6.206 %
3.6 RPA-CRISPR/Cas12a 检测方法在加标和临床大黄鱼样本中的应用
为评估所建方法的实用性，将 RPA-CRISPR/Cas12a 系统应用于加标和临床样本中 P. plecoglossicida 的检测。在加标样本中，仅两份混有 P. plecoglossicida（1 × 10⁴ CFU/mg）的脾脏匀浆组织在紫外光下产生可见荧光信号，阴性对照无荧光（图 6A）。实时荧光 PCR 结果证实，加标样本的荧光强度显著高于阴性对照组（P < 0.001）（图 6B）。RPA-CRISPR/Cas12a-LFS 检测也仅在加标样本中产生可见测试线（图 6C），证实该方法检测 P. plecoglossicida 具有高准确性。
此外，从报告有 P. plecoglossicida 感染的不同养殖场采集了五条大黄鱼。提取五条大黄鱼肝、脾、肾组织的基因组 DNA，用作 RPA-CRISPR/Cas12a 和侧向流动试纸条检测的模板。在四条临床鱼（L1、L2、L3 和 L5）的肝、脾、肾样本中检测到荧光信号（图 6D、E、F），表明这些组织中存在 P. plecoglossicida。相比之下，样本 L4 检测为 P. plecoglossicida 阴性。为确认检测的准确性，对五个临床样本的肝、脾、肾组织进行了实时荧光 PCR 检测。
【数据】加标浓度：1 × 10⁴ CFU/mg；加标样本阳性率：2/2；P 值：< 0.001；临床样本阳性：L1、L2、L3、L5（肝/脾/肾）；临床样本阴性：L4
3.7 PCR 检测方法的灵敏度
使用拷贝数为 2.34 × 10⁰ 至 2.34 × 10⁶ 的 gyrB-pUC19 质粒作为模板进行 PCR 扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析。NTC 为非模板对照组。
【数据】PCR 模板范围：2.34 × 10⁰–2.34 × 10⁶ copies；检测方式：琼脂糖凝胶电泳
讨论与解读
P. plecoglossicida 对水产养殖业构成严重威胁，导致重大经济损失。感染早期外部症状不明显，往往数日内即出现高死亡率，因此早期检测对疾病防控至关重要。本研究基于 CRISPR/Cas12a 系统开发了快速、灵敏、可视化的 P. plecoglossicida 检测方法，显著缩短了检测时间，且无需额外仪器。CRISPR/Cas12a 检测系统利用 Cas12a 和 crRNA 特异性识别靶 DNA 序列，激活后切割附近单链 DNA 探针，产生荧光或可视化信号。然而，仅依赖 CRISPR/Cas12a 系统的检测方法灵敏度有限，难以满足现场检测需求。等温核酸扩增技术可在等温条件下扩增靶基因，无需专用设备且反应时间更短，但单独用于病原检测时易出现假阳性。将等温扩增与 CRISPR/Cas12a 系统结合，不仅提高了检测灵敏度，还拓展了 CRISPR/Cas12a 系统在不同诊断场景中的适应性。
编译者解读：该研究在方法学上的亮点在于将 RPA 的等温扩增能力与 CRISPR/Cas12a 的高特异性识别相结合，并通过 LFS 实现了真正意义上的“去仪器化”现场检测——这对于水产养殖场等资源有限场景具有实际价值。检测限达 2.34 × 10² copies/反应，足以满足早期感染筛查需求。从合成生物学应用角度看，该平台的设计思路（保守靶标选择 + 双酶系统级联 + 可视化输出）可推广至其他水产病原体的检测。不足之处在于临床样本验证规模较小（仅 5 尾鱼），且未与传统检测方法（如平板培养法）进行平行比较，其实际现场应用性能仍有待更大样本量的验证。
参考来源
Jiang M. Development of a rapid and visual detection platform for Pseudomonas plecoglossicida in large yellow croaker (Larimichthys crocea) based on the RPA-CRISPR/Cas12a system. Aquaculture, 2025. DOI: 10.1016/j.aquaculture.2025.742704
DOI: 10.1016/j.aquaculture.2025.742704