来源：Genome-scale and pathway engineering for the sustainable aviation fuel precursor isoprenol production in Pseudomonas putida（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
可持续航空燃料（SAF）是航空业减排的关键路径之一。异戊烯醇（isoprenol）作为高能量密度航空燃料DMCO（1,4-二甲基环辛烷）的重要前体，其生物合成备受关注。本研究以代谢 versatile 的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440为宿主，整合两种基因组规模代谢模型（GSMM）计算策略——双层优化（OptKnock/OptForce）与约束最小割集（cMCS）——预测基因敲除靶点，并结合"IPP-bypass"甲羟戊酸途径的理性优化，最终在补料分批条件下实现3.5 g/L的异戊烯醇产量。该工作展示了计算设计与实验验证深度融合的策略价值。
研究背景
航空燃料及其前体的生物制造有望切实减少CO₂排放。除传统乙醇基燃料外，新型高能量多环化合物如fuelimycin A和epi-isozizaene等正被开发为SAF候选物。异戊烯醇（3-甲基-3-丁烯-1-醇）是一种重要的SAF前体，既可作为商品化平台化学品和生物汽油，也可通过高效催化转化为航空燃料DMCO。虽然大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和酿酒酵母等模式微生物已实现异戊烯醇生产，但代谢多样性的微生物能够利用更广泛的碳源（尤其是廉价植物生物质），对构建经济可行的生产工艺至关重要。恶臭假单胞菌因其出色的底物谱和环境适应性，正成为异戊烯醇生物制造的新兴宿主。本研究旨在通过计算模型指导的代谢工程策略，系统优化该菌株的异戊烯醇合成能力。
研究方法
2.1 约束最小割集（cMCS）与基本模式计算
本研究使用恶臭假单胞菌KT2440基因组规模代谢模型iJN1462（Nogales et al., 2020）。以葡萄糖为唯一碳源的有氧条件模拟生长参数，ATP维持需求为0.97 mmol ATP/gDCW/h，葡萄糖摄取速率为6.3 mmol葡萄糖/gDCW/h。使用CellNetAnalyzer（版本2020.2）中的MCS算法（von Kamp and Klamt, 2017）计算约束最小割集。副产物排泄初始设为零，但文献报道的恶臭假单胞菌特异性分泌代谢物除外——包括葡萄糖酸和2-酮葡萄糖酸（Nikel et al., 2015）、3-氧代己二酸和儿茶酚（Sudarsan et al., 2016）、乳酸和乙酸（基于本实验室部分恶臭假单胞菌实验的经验证据，见补充图1）以及CO₂。以葡萄糖为碳源并引入异源IPP旁路途径时，计算得到异戊烯醇最大理论产量（MTY）为0.72 mol/mol葡萄糖。额外输入包括最低产品产量需求（MTY的10%–85%）和最高生物量产量需求（最大生物量产量的10–25%），以约束期望的设计空间。MCS最大规模保持默认值（即50个代谢反应）。不允许敲除转运反应和自发反应。在上述设定下，每个计算出的敲除策略（cMCS）即使在细胞不生长时也要求异戊烯醇生产。所有cMCS计算均通过MATLAB 2017b平台上的CellNetAnalyzer API函数完成，使用CPLEX 12.8作为MILP求解器。不同运行次数、相应割集数量及满足耦合约束的靶向反应数见补充文件1。基本模式计算使用代表恶臭假单胞菌KT2440中心碳代谢及异源IPP旁路异戊烯醇合成途径的小规模模型，通过efmtool（Terzer and Stelling, 2008）完成。
【数据】模型：iJN1462；ATP维持：0.97 mmol ATP/gDCW/h；葡萄糖摄取：6.3 mmol/gDCW/h；MTY：0.72 mol/mol葡萄糖；MCS最大规模：50个反应；求解器：CPLEX 12.8
2.2 基于Opt方法的基因靶点预测
iJN1462代谢模型同样用于OptKnock和OptForce分析。模型首先经以下修改：修复质量或电荷不平衡反应、移除涉及硫辛酰胺脱氢酶的重复反应、移除TOL质粒pWW0上基因催化的反应、移除由假基因磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PP_0253催化的PPCK反应、将OAADC反应的基因-蛋白-反应关联从2-脱氢-3-脱氧-磷酸葡糖酸醛缩酶PP_1024更新为草酰乙酸脱羧酶PP_1389。修改后的模型添加了异戊烯醇合成的IPP旁路途径（补充文件2）。对于OptKnock，模型经预处理以移除阻塞反应和代谢物，并鉴定以葡萄糖为唯一碳源生长所必需的反应。预测的必需反应、自发反应、边界反应及无关联基因的周质转运反应均从敲除靶点中排除。另有若干反应被手动排除以避免不期望的预测结果（ATPM、CAT、CYO1_KT、CYTBO3_4pp、CYTCAA3pp、NADH16pp、NAt3_1p5pp、PItex和PPK）。OptKnock问题使用cobrapy（Ebrahim et al., 2013）构建，通过CPLEX 12.8求解。多次迭代运行OptKnock，利用解池和整数割识别大量敲除策略。另一组OptKnock解来自进一步约束的模型——除葡萄糖酸、2-酮葡萄糖酸和乙酸外，其他副产物分泌均被阻断，假设无显著副产物形成（补充文件3）。对于OptForce，模型同样经预处理以移除葡萄糖最低培养基条件下的阻塞反应。野生型通量范围通过通量变异分析获得，约束条件包括葡萄糖摄取、葡萄糖酸分泌、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖酸激酶、磷酸葡糖酸脱水酶、丙酮酸脱氢酶和柠檬酸合酶，参数取自先前研究（Kukurugya et al., 2019）。异戊烯醇过量生产以理论最大产量的50%为预定目标来识别设计方案。首先鉴定所有可能的一阶和二阶必要通量变化，进而确定最小干预集（包括通量增加、减少或敲除）。多次迭代运行OptForce，通过CPLEX 12.8添加整数割以识别大量设计方案（补充文件3）。
【数据】OptKnock靶点排除类型：必需反应/自发反应/边界反应/无基因周质转运反应；OptForce目标：50%理论最大产量；求解器：CPLEX 12.8
2.3 情境特异性模型与通量变异分析
通量变异分析前，首先利用实验数据衍生的约束生成情境特异性模型，构建6个不同的恶臭假单胞菌GSMM，代表本研究中为异戊烯醇生产而改造的6种不同菌株。约束条件包括葡萄糖摄取速率、异戊烯醇生产速率及生长速率。随后在MATLAB 2017b平台上使用COBRA Toolbox（Heirendt et al., 2019）中的fluxvariabilityanalysis()函数进行通量变异分析。
【数据】情境模型数量：6个；平台：MATLAB 2017b；工具：COBRA Toolbox
2.4 菌株与质粒构建
本研究所用全部菌株和质粒列于补充表1。菌株和质粒及其相关信息已存放于JBEI Registry公共数据库（https://public-registry.jbei.org），也可向作者索取。恶臭假单胞菌基因敲除基于同源重组结合自杀基因（sacB）反向筛选，方法如前所述（Marx, 2008）。基因敲除突变体的基因型通过特异性引物菌落PCR确认，随后进行DNA测序（GENEWIZ，美国加州南旧金山）。
【数据】敲除方法：同源重组+sacB反向筛选；确认方法：菌落PCR+DNA测序
2.5 恶臭假单胞菌异戊烯醇生产
携带异戊烯醇途径质粒（补充表1）的恶臭假单胞菌KT2440菌株用于异戊烯醇生产。所有生产菌株的起始培养通过将单菌落接种于含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中、30°C、200 rpm振荡过夜制备。起始培养物以5 mL EZ rich defined培养基（Teknova，美国加州）稀释，培养基含20 g/L D-葡萄糖（2%，w/v）、25 μg/mL卡那霉素，置于50-mL试管中。OD600达0.4–0.6时加入0.5 mM IPTG或阿拉伯糖（2%）诱导蛋白表达。恶臭假单胞菌培养物在旋转摇床（200 rpm）中30°C孵育48小时。对于含2% D-葡萄糖的M9最低培养基（补充表2）中的异戊烯醇生产，冷冻保存物在含50 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上划线，30°C培养至单菌落。单菌落接种于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，30°C、200 rpm振荡过夜培养。除非另有说明，后续所有培养均采用相同格式和条件。100 μL过夜LB培养物回稀释至最低培养基中培养24小时。第二次回稀释使细胞在最低培养基中完全适应。生产实验中，细胞以初始OD600为0.2接种，接种后立即用2%阿拉伯糖诱导异戊烯醇合成途径。每6小时取样一次，持续至72小时，三次重复，分析生长（OD600）、异戊烯醇、残余葡萄糖和有机酸。异戊烯醇定量按Kim et al.（2021）所述方法进行。简要而言，100 μL含1-丁醇（30 mg/L）作为内标的乙酸乙酯加入100 μL液体培养物中。
【数据】LB培养基卡那霉素：50 μg/mL；EZ rich培养基：20 g/L葡萄糖、25 μg/mL卡那霉素；诱导剂：0.5 mM IPTG或2%阿拉伯糖；OD600诱导范围：0.4–0.6；培养条件：30°C、200 rpm、48h；M9培养基葡萄糖：2%；接种OD600：0.2；取样间隔：6h至72h；内标：1-丁醇30 mg/L
研究结果
3.1 异戊烯醇生产的计算菌株设计
为实现模型指导的异戊烯醇生产改进，本研究采用了基于EMA的方法——包括基本通量模式（EFMs）和约束最小割集（cMCS）——以及基于Opt的方法——包括OptKnock和OptForce。所用模型为添加了异源MVA途径（补充文件2）的恶臭假单胞菌GSMM iJN1462，以及含异源MVA途径聚合反应（补充文件4）的恶臭假单胞菌中心代谢模型。
初步计算菌株设计结果显示，异戊烯醇的生长偶联生产需要删除恶臭假单胞菌中9个或更多代谢反应（补充文件3）。然而，计算预测无法明确哪些基因对提高异戊烯醇产量更为重要、应优先敲除——因为当仅删除已鉴定反应的一个子集时，计算机模拟中并不会出现生长偶联生产。为此，我们使用基于EMA和基于Opt的方法生成了大量计算设计，并统计每种方法中各敲除靶点在设计中出现的频率。频率用于计算每种方法的靶点排序，不同方法的排序结果再合并计算最终得分。我们的假设是：某些靶点对改善异戊烯醇生产比其他靶点更为重要（例如由于通量更高或处于关键分支点），因此会在多样化的计算设计中更频繁出现。通过多种计算方法生成大量设计，并采用基于排序的集成方法进行合并，我们旨在识别这些关键靶点并优先用于敲除菌株的实验构建。尽管计算模型要求删除设计中的所有靶点才能看到异戊烯醇产量提升，我们假设删除由这些关键靶点组成的子集仍能改善异戊烯醇产量。
对于基于EMA的方法，我们首先使用中心代谢模型计算EFMs。每个EFM是在所定义的葡萄糖最低培养基条件下，生长和异戊烯醇生产所需的最小反应集合。共计算出360,475个EFMs，其中仅276个EFMs被选中——这些EFMs在生物量、ATP维持、葡萄糖摄取和异戊烯醇生产反应中均携带通量。采用基于频率的评分从276个不同EFMs中对靶点进行优先级排序（补充文件1）。随后使用cMCS计算异戊烯醇生产的生长偶联策略。从总共60次cMCS运行中，我们枚举了4,950个可行的cMCS割集设计。使用基于频率的评分对可行cMCS设计中的靶点进行优先级排序，这些设计针对异戊烯醇及其前体HMG-CoA、DMAPP或IPP（补充文件1）。
对于基于Opt的方法，首先使用OptKnock寻找将异戊烯醇生产与生长偶联的敲除策略。初步收集到157个OptKnock解，去除冗余解后预处理为120个。此外，我们通过阻断副产物分泌（实验观察到的葡萄糖酸、2-酮葡萄糖酸和乙酸除外）来约束模型，寻找另一组设计。使用约束模型获得377个OptKnock解，预处理后得到263个。随后使用OptForce识别改善异戊烯醇生产的策略，共获得50个OptForce解，但发现这些解主要由增加或减少通量的途径组成，仅包含9个低频敲除靶点。因此，我们决定使用两次模拟的OptKnock解来计算基因靶点评分频率（补充文件3）。
最终，我们将基于EMA和基于Opt的预测得分合并，得出前8个优先基因靶点用于实验实施（表1和图2）。前两个优先基因靶点（mvaB和hbdH）参与内源代谢物（HMG-CoA和乙酰乙酰-CoA）的降解，这些代谢物也参与异源MVA途径。其他优先基因靶点涉及中心碳代谢，包括磷酸戊糖途径（gntZ）、丙酮酸代谢（ldhA和ppsA）和三羧酸循环（gltA和aceA）。尽管部分预测基因靶点参与中间代谢物降解，我们的计算方法通过优先排序来自成熟算法的基因靶点来指导代谢工程过程。当计算设计包含许多基因靶点时，这种方法有助于促进菌株构建。
【数据】EFMs总数：360,475个；选中EFMs：276个；cMCS运行次数：60次；可行cMCS设计：4,950个；OptKnock解：157个→120个（预处理后）；约束模型OptKnock解：377个→263个；OptForce解：50个；优先基因靶点：8个
3.2 异戊烯醇生产代谢重连的实验实施
为实验验证模型预测靶点，以恶臭假单胞菌ΔphaABC菌株（XW01，菌株列表见补充表2）为背景菌株进行基因敲除。该菌株在我们前期工作中通过质粒（pXW1，质粒列表见补充表1）使用IPP旁路MVA途径时，显示出恶臭假单胞菌中最高的异戊烯醇水平（104 mg/L，XW11菌株）（Wang et al., 2022）。
根据模型预测靶点（表1），我们构建了单基因和多基因敲除菌株（图3a）。首先从PP_3540/mvaB基因开始，该基因编码HMG-CoA裂解酶，催化HMG-CoA转化为乙酰乙酸和乙酰-CoA，因此与甲羟戊酸合成中的关键前体HMG-CoA形成竞争。mvaB敲除使异戊烯醇产量提升至164 mg/L，与起始菌株XW11相比增加了1.6倍（图3b）。以此双敲除菌株（ΔphaABC ΔmvaB）为基础，我们进行了第二轮基因敲除，靶点为PP_4116/aceA（异柠檬酸裂解酶）、PP_4043/gntZ（6-磷酸葡糖酸脱氢酶）和PP_3073/hbdH（3-羟基丁酸脱氢酶）（图3a）。aceA敲除（XW13）或gntZ敲除（XW14）使异戊烯醇产量显著下降至14–15 mg/L，而hbdH敲除（XW15）使产量提升至241 mg/L——较XW11菌株增加2.3倍，较XW12菌株增加1.5倍（图3b）。
3-羟基丁酸脱氢酶（hbdH）催化3-羟基丁酸与乙酰乙酸之间的转化，hbdH敲除成功提高异戊烯醇产量可能归因于消除了乙酰乙酰-CoA（MVA途径的第一个代谢物）的一个竞争途径。异柠檬酸裂解酶（aceA）将异柠檬酸转化为乙醛酸，6-磷酸葡糖酸脱氢酶（gntZ）是磷酸戊糖途径与ED途径分流处的关键酶。两者均参与中心碳代谢，这两个敲除未能改善异戊烯醇产量表明，中心碳代谢可能需要多种基因敲除组合而非单一基因删除来实现显著重连。因此，在一个菌株中工程化多个基因敲除可能仍是进一步提高异戊烯醇产量所必需的。
因此，在第三轮敲除中，我们选择三敲除的最高产菌株（ΔphaABC ΔmvaB ΔhbdH，XW15）作为基础，对参与中心碳代谢的基因gltA（柠檬酸合酶）、aceA（异柠檬酸裂解酶）和gntZ（6-磷酸葡糖酸脱氢酶）进行敲除（图3a）。柠檬酸合酶是连接糖酵解与TCA循环的第一个酶，在中心碳和能量代谢中发挥重要作用。在恶臭假单胞菌KT2440中，柠檬酸合酶来源于……
讨论与解读
4 结论
人为碳排放已导致气候变化，可持续航空燃料（SAF）为缓解持续的有害碳排放提供了有效的近期手段。本研究报道了我们在工程化恶臭假单胞菌菌株方面的努力，使其能够从植物源碳源生产SAF前体异戊烯醇。我们同时采用了理性设计和GSMM指导的靶点选择方法，随后在各种培养配置（包括补料分批生物反应器）中进行工程化和测试。应用了两种GSMM方法，每种方法都预测了大量基因敲除靶点以实现计算预测的异戊烯醇产量提升。通过对两种方法产生的众多基因靶点进行集成排序，我们能够确定优先级并减少靶点总数。该方法在减少实现滴度和速率显著改善所需的工程菌株数量方面卓有成效。然而，我们也观察到部分预测未能带来滴度改善，某些敲除组合对恶臭假单胞菌的生长和/或异戊烯醇滴度有害。理性途径优化对滴度改善产生了显著影响。GSMM指导的基因敲除与理性途径优化的协同应用，使恶臭假单胞菌中异戊烯醇的最高滴度达到1.1 g/L，较起始菌株提高了10倍；在补料分批条件下进一步达到3.5 g/L。该研究为利用可再生碳流实现生物生产流程奠定了基础。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于"集成排序"策略——面对计算预测的大量基因靶点，不盲目逐一验证，而是通过多种算法频率统计合并出优先级，大幅减少了实验工作量。这种计算-实验闭环思维在合成生物学中具有方法学价值。但结果也提醒我们：计算预测的可靠性存在边界——aceA和gntZ敲除的失败表明中心碳代谢的复杂性远超模型假设。未来若能将适应性实验室进化与计算设计结合，或可进一步释放恶臭假单胞菌作为工业宿主的潜力。3.5 g/L的产量虽尚不及大肠杆菌体系，但凭借其广谱底物利用能力，该菌株在真实生物质水解液场景中可能更具经济竞争力。
参考来源
Banerjee D, et al. Genome-scale and pathway engineering for the sustainable aviation fuel precursor isoprenol production in Pseudomonas putida. Metabolic Engineering, 2024. DOI: 10.1016/j.ymben.2024.02.004
DOI: 10.1016/j.ymben.2024.02.004