来源：Pseudomonas putida JM37 as a novel bacterial chassis for ethylene glycol upcycling（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
乙二醇（EG）是聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的主要单体之一，微生物升级循环将其转化为高价值产品是塑料废弃物管理的前沿方向。本研究报道了恶臭假单胞菌JM37作为新型细菌底盘用于EG valorization的代谢与生物技术潜力。该菌株能以EG为唯一碳源高效生长，优于其他假单胞菌菌株；基因组测序与定向突变揭示乙醛酸同化途径的遗传冗余是其稳健EG代谢的基础。研究还证实JM37能直接从EG积累中链聚羟基脂肪酸酯（mcl-PHAs），并成功表达包括紫色杆菌素生物合成操纵子和PET水解酶在内的异源途径，展示了其作为合成生物学底盘的多功能性。
研究背景
乙二醇（EG）是一种C2二醇，广泛应用于防冻、飞机和跑道除冰、发动机冷却、天然气处理及聚酯合成等工业领域。全球大部分EG用于制造热塑性聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET），其产量预计到2060年将达到每年6100万吨。PET产品多为一次性用品，主要应用于包装行业，但其回收率在美国仅约21%，主要原因是再生PET的质量低于原生PET且成本更高。
近年来，塑料废弃物管理的生物技术策略聚焦于将PET单体——对苯二甲酸（TPA）和EG——作为生物升级循环的底物，即将其转化为增值产品，如香草醛、香草酸、番茄红素、扑热息痛、乙醇酸或聚羟基脂肪酸酯（PHA）等生物塑料。从PET获取TPA和EG主要有两种策略：化学催化和生物催化。尽管EG具有重要的工业价值，但能有效代谢EG的微生物种类仍然有限，这限制了微生物升级循环策略的发展。
研究方法
2.1 微生物与培养条件
本工作使用的细菌菌株和质粒列于表1。P. putida JM37菌株由德国斯图加特大学Bernhard Hauer博士惠赠。除非另有说明，微生物在LB培养基中培养，然后转移到LB或MC最小培养基中。MC最小培养基组成：KH₂PO₄ 0.33 g/L、Na₂HPO₄ 1.2 g/L、NH₄Cl 0.1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L、CaCl₂ 44 mg/L，pH调至7。维生素和微量元素溶液按照Barragán等人（2004）的描述配制。所有实验均使用三个生物学重复。必要时，向生长培养基中添加50 µg/mL卡那霉素和35 µg/mL庆大霉素。培养条件为30°C、200 rpm，基因表达用1 mM IPTG（异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷）（Sigma-Aldrich，REF I6758）或10 µM N-（β-酮己酰基）-L-高丝氨酸内酯（Sigma-Aldrich，REF K3007）诱导。
【数据】培养基：LB/MC最小培养基；KH₂PO₄：0.33 g/L；Na₂HPO₄：1.2 g/L；NH₄Cl：0.1 g/L；MgSO₄·7H₂O：0.1 g/L；CaCl₂：44 mg/L；pH：7；卡那霉素：50 µg/mL；庆大霉素：35 µg/mL；温度：30°C；转速：200 rpm；IPTG：1 mM；N-（β-酮己酰基）-L-高丝氨酸内酯：10 µM
2.2 P. putida JM37在EG中的生长
P. putida JM37在MC最小培养基中以EG（Sigma-Aldrich，Ref 102466）作为唯一碳源培养，浓度范围为10 mM至2 M。生长曲线使用Victor Nivo多模式酶标仪（PerkinElmer）在96孔板中进行，同时在装有50 mL培养基的250 mL锥形瓶中进行，两种条件均为30°C、200 rpm。为研究氮源对生长的影响，在最高EG浓度（200 mM、500 mM和1 M）的培养物中添加0.3 g/L NH₄Cl。生长以600 nm处的光密度（OD₆₀₀）测量。
【数据】EG浓度范围：10 mM–2 M；培养容器：96孔板/250 mL锥形瓶（50 mL培养基）；温度：30°C；转速：200 rpm；NH₄Cl补充：0.3 g/L；检测波长：OD₆₀₀
2.3 基因组测序与分析
P. putida JM37基因组由MicrobesNG（英国伯明翰）使用Illumina NovaSeq 6000平台测序（覆盖度约100X）。原始读段（FASTQ）已存入NCBI SRA数据库，登录号为PRJNA1330276。组装由该公司完成，获得154个重叠群。注释在RAST服务器（Aziz等人，2008）上进行，以P. putida KT2440为参考发现EG降解基因。P. putida JM37基因与P. putida KT2440和P. umsongensis GO16的基因使用RAST内部BLASTp进行比较。
【数据】测序平台：Illumina NovaSeq 6000；覆盖度：约100X；重叠群数：154；数据库登录号：PRJNA1330276
2.4 CRISPR-Cas9碱基编辑
为确认P. putida JM37代谢EG的关键基因，我们选择性敲除了乙醛酸连接酶的两个拷贝（gcl1和gcl2）、苹果酸合酶的两个拷贝（glcB1和glcB2）以及异柠檬酸裂解酶的唯一个拷贝（aceA）。在第二个实验中，我们构建了gcl1的单基因敲除突变体。这些突变通过Volke等人（2022）开发的CRISPR-Cas9辅助方法引入。简言之，该技术允许C→T替换，产生提前终止密码子，从而中断开放阅读框的翻译。目标突变的gRNA序列从CRISPy-web服务（Blin等人，2016）获取以指导引物设计。使用gRNA引物，以pEX128质粒为模板进行PCR，获得带有Golden Gate共有序列的gRNA。按照作者方案将这些gRNA克隆到pMBEC2质粒（卡那霉素抗性）（Volke等人，2022）中。最终获得质粒pMBEC2-Δgcl1,2-glcB1,2-aceA和pMBEC2-Δgcl1。这些质粒通过热激转化入大肠杆菌DH10β，并在含50 µg/mL卡那霉素的LB平板上进行菌落筛选。阳性菌落缺乏GFP表达。为确认gRNA的正确整合，使用Monarch®质粒小提试剂盒（New England Biolabs）提取质粒并由Full Circle Labs（英国伦敦）测序。P. putida JM37通过电穿孔转化pMBEC2-Δgcl1,2-glcB1,2-aceA和pMBEC2-Δgcl1质粒，获得菌株P. putida JM37Δgcl1,2-glcB1,2-aceA和P. putida JM37Δgcl1。为确认突变，突变菌株在含卡那霉素的LB中培养，并以0.1 OD₆₀₀接种于含10 mM EG的MC培养基中，在30°C、200 rpm条件下培养48小时。野生型菌株作为阳性对照。此外，P. putida JM37Δgcl1,2-glcB1,2-aceA的基因组由MacroGen（首尔）用Illumina NovaSeq X测序。原始数据以FASTQ（双端）格式提供。FASTQ处理使用fastp（Chen等人，2018）修剪polyG和接头序列，并去除Phred质量分数<30和长度<30 bp的读段。基因组使用SPAdes（Prjibelski等人，2020）组装成重叠群（k-mers 21、33、55、77）。为检查基因编辑，天然和突变基因用Clustal-Omega（Madeira等人，2024）比对。对于P. putida JM37Δgcl1，通过PCR扩增目标基因并测序（MacroGen，首尔）检查突变。引物和比对序列见表S1、图S3和图S4。原始读段（FASTQ）和注释重叠群已存入NCBI，登录号PRJNA1330276。
【数据】突变基因：gcl1、gcl2、glcB1、glcB2、aceA；筛选抗生素：卡那霉素50 µg/mL；接种OD₆₀₀：0.1；EG浓度：10 mM；培养时间：48h；温度：30°C；转速：200 rpm；测序平台：Illumina NovaSeq X；fastp质控：Phred≥30、读长≥30 bp；SPAdes k-mers：21、33、55、77
2.5 电穿孔方案
电穿孔用于P. putida JM37的转化。首先制备电感受态细胞。P. putida JM37在LB中过夜培养，然后以OD₆₀₀ 0.1接种到50 mL新鲜LB中。2–2.5小时后，当OD₆₀₀值达到约0.8时，用50 mL含10%甘油的冰冷Milli-Q水洗涤两次。最后，将离心沉淀重悬于1 mL 10%甘油中，分装为100 µL等分试样，立即储存于−80°C。电穿孔在0.2 cm比色皿中使用MicroPulse电穿孔仪（BioRad）（2.5 kV，200 Ω，25 µF）进行，加入100 ng质粒。细胞在LB中于30°C恢复2小时，然后涂布于含50 µg/mL卡那霉素的LB平板上进行筛选。
【数据】培养体积：50 mL LB；OD₆₀₀：0.1→约0.8（2–2.5h）；洗涤液：含10%甘油的冰冷Milli-Q水；储存：−80°C，100 µL等分；电穿孔参数：2.5 kV、200 Ω、25 µF；质粒量：100 ng；恢复时间：2h（30°C）；筛选：卡那霉素50 µg/mL
2.6 PHA分析与定量
为研究PHA积累，P. putida JM37在含50 mM EG作为唯一碳源的MC培养基中培养。24小时后，通过尼罗红染色（图4）（Zuriani等人，2013）目视确认PHA产生。简言之，500 µL培养物以7,000 rpm离心，将所得沉淀重悬于50 µL PBS中，加入尼罗红至终浓度5 µg/mL。PHA颗粒用配备pE-300 Lite LED照明器（CoolLED）和DFC345 FX相机（Leica）的DM4 B显微镜（Leica）观察。为分析组成并定量总胞内PHA，将2–5 mg冻干生物质进行甲醇解。每个生物学样品包含两个技术重复。简言之，冻干沉淀重悬于2 mL含15%硫酸的甲醇中。然后加入2 mL溶于氯仿的3-甲基苯甲酸（0.5 mg/mL）作为内标。样品在100°C孵育5小时。通过冰浴冷却终止反应。样品用2 mL Milli-Q水洗涤两次，离心分相，弃去水相和细胞碎片。第三次洗涤用饱和Na₂CO₃溶液以去除残留硫酸。最后加入少量Na₂SO₄以完全去除水分。甲醇解样品用Agilent 7890A系列气相色谱仪耦合5975C MS检测器（EI，70 eV）和DB-5HT色谱柱（400°C：30 m × 0.25 mm × 0.1 µm膜厚）进行GC-MS分析。不同甲酯单体的保留时间为：3.5 min（C6）、5.2 min（C8）、7.0 min（C10）、9.1 min（C12:1）和9.4 min（C12）。内标在4.9 min检测到。
【数据】EG浓度：50 mM；培养时间：24h；离心转速：7,000 rpm；尼罗红终浓度：5 µg/mL；冻干生物质：2–5 mg；甲醇解：2 mL含15%硫酸甲醇，100°C、5h；内标：3-甲基苯甲酸（0.5 mg/mL氯仿溶液）；GC-MS：Agilent 7890A/5975C（EI 70 eV）；色谱柱：DB-5HT（30 m × 0.25 mm × 0.1 µm）；保留时间：C6 3.5 min、C8 5.2 min、C10 7.0 min、C12:1 9.1 min、C12 9.4 min、内标4.9 min
2.7 HPLC定量EG
样品以13,000 rpm离心，通过0.22 µm PTFE滤膜（Agilent）过滤，在Agilent 1200系列HPLC上分析，使用BioRad Aminex HPX-87H色谱柱（300 × 7.8 mm）维持在60°C，RID检测器设定为35°C。洗脱使用2 mM H₂SO₄作为流动相，等度运行，流速0.5 mL/min，持续25 min。在这些条件下，EG在19.5 min出峰。
【数据】离心：13,000 rpm；滤膜：0.22 µm PTFE；色谱柱：BioRad Aminex HPX-87H（300 × 7.8 mm）；柱温：60°C；检测器：RID，35°C；流动相：2 mM H₂SO₄；流速：0.5 mL/min；运行时间：25 min；EG保留时间：19.5 min
2.8 PET水解酶和紫色杆菌素操纵子克隆
负责紫色杆菌素生物合成的vioABCDE操纵子被克隆到质粒pBLxVi5（庆大霉素抗性）（Schuster & Reisch，2021）中，该质粒随后转化入P. putida JM37。
图1 P. putida中乙二醇代谢示意图。蓝色代表Gcl途径。黄色代表乙醛酸支路。红色代表氧化还原反应。
研究结果
3.1 恶臭假单胞菌JM37以乙二醇为唯一碳源的利用
P. putida JM37被证实能以EG为唯一碳源高效生长，与原始报道一致（Mückschel等人，2012）。该菌在96孔板中、50 mM EG条件下，24小时内达到最大OD₆₀₀ 1.13。更高浓度导致生长降低，2 M具有抑制性（图2A）。已知微孔板培养受氧气限制影响；因此我们也在摇瓶中培养该菌，在50 mM EG条件下24小时内OD₆₀₀达到2.2。在这些条件下，更高的碳源可利用性并未增加最大生物量，提示存在其他营养限制。我们假设MC培养基的氮浓度（0.1 g/L）是更高EG浓度下细胞生长的限制因素。为验证这一点，我们在200 mM、500 mM和1 M EG条件下培养菌株，并添加三倍初始氮浓度（0.3 g/L）。三种条件下均观察到更高的生长（图2B），在200 mM EG条件下48小时达到最大OD₆₀₀ 4.9（比0.1 g/L氮条件增加2.6倍），并消耗了126 mM底物（图2C）。类似的营养限制效应在其他P. putida菌株中也有报道。例如，Franden等人（2018）报道，通过向培养基中添加两倍量的盐和氮，P. putida KT2440改良菌株在高EG浓度下的生长有所增加。Nikodinovic-Runic等人（2009）也观察到P. putida CA-3在苯乙烯上生长时，无氮限制条件下生物量增加。另一方面，前期工作表明，Acetobacterium woodi DSM 1030在75 mM EG上生长，摇瓶培养55小时后OD₆₀₀达到1.1（Trifunović等人，2016）。Paracoccus denitrificans使用β-羟基天冬氨酸循环，在400 mM EG条件下48小时内可生长至OD₆₀₀约1.1（Ren等人，2025）。大肠杆菌天然不能在EG上生长，尽管一株源自K12的进化菌株（带有突变的1,2-丙二醇氧化还原酶FucO）能够同化该底物（Caballero等人，1983）。模式菌株P. putida KT2440需要适应性实验室进化（ALE）或遗传修饰才能在EG上生长。Li等人（2019）证明转录调节因子GclR在该菌株中作为Gcl途径的阻遏物。删除gclR或gcl操纵子上游GclR操纵子盒的突变使KT2440能够在EG上生长，凸显了该途径对从该底物生成生物量的重要性。通过ALE，作者获得了两个突变菌株，一个针对GclR，另一个针对gcl操纵子上游的操纵子盒。两种P. putida KT2440变体在摇瓶中、26.7 mM EG条件下24小时内生长至0.6 g/L细胞干重（CDW）。Franden等人（2018）采用不同方法，设计了一株过表达乙醇酸氧化酶GlcDEF和Gcl途径的菌株。该改良P. putida KT2440可耐受高达2 M EG，并在120小时内达到接近10 g/L DCW的生长量，证明GlcDEF和Gcl途径对该菌株生物量生成的重要性。在更近期的工作中，Bao等人（2023）通过破坏glcR、过表达gcl、glxR、hyi、ttuD和pykA（丙酮酸激酶），并用强组成型Ptac启动子和人工RBS替换glcDEF操纵子的天然启动子和RBS，设计了一株消耗EG的P. putida菌株。该菌株可在48小时内降解约225 mM EG，摇瓶中48小时OD₆₀₀达到约15.5。无需任何遗传修饰，P. umsongensis GO16能够在EG作为唯一碳源的培养基上生长。该菌株在48小时内、1.6 g/L（约26 mM）EG条件下达到0.4 g/L CDW（Narancic等人，2021）。经过ALE后，P. umsongensis GO16 KS3菌株在摇瓶中、1.7 g/L（约27 mM）EG作为唯一碳源条件下，10小时内生长至OD₆₀₀ = 3（Tiso等人，2021）。我们实验中P. putida JM37在EG上的生长量是文献报道的野生型菌株中最高的之一，证明了该菌株在开发EG升级循环策略方面的潜力。
图2 P. putida JM37在MC最小培养基中、不同浓度EG作为唯一碳源条件下的生长与EG消耗。
【数据】最大OD₆₀₀（96孔板）：1.13（50 mM EG，24h）；最大OD₆₀₀（摇瓶）：2.2（50 mM EG，24h）；最大OD₆₀₀（200 mM EG + 0.3 g/L NH₄Cl）：4.9（48h）；生长增加倍数：2.6倍；EG消耗：126 mM；抑制浓度：2 M；对比菌株OD₆₀₀：A. woodi 1.1（75 mM EG，55h）、P. denitrificans约1.1（400 mM EG，48h）、KT2440突变株0.6 g/L CDW（26.7 mM EG，24h）、GO16 0.4 g/L CDW（26 mM EG，48h）、GO16 KS3 OD₆₀₀=3（27 mM EG，10h）、Bao菌株OD₆₀₀约15.5（48h）、降解约225 mM EG
3.2 恶臭假单胞菌JM37的遗传冗余使其能够高效利用乙二醇
P. putida JM37的基因组分析揭示了与P. putida KT2440和P. umsongensis GO16中同源的EG同化基因，在染色体上呈现相似的分布。这些基因 organized into three clusters：一个包含pedE、pedH、pedI和aldB；第二个包含glcDEF；第三个包含Gcl途径（gcl、hyi、glxR、ttuD、ttuE）。基因aceA和glcB不形成簇，但存在于基因组的不同位置（图3）。在P. putida KT2440中，包含pedE、pedH、pedI和aldB的操纵子受转录调节因子pedR1和PAS/PAC传感器杂合组氨酸激酶pedS1控制。在本案例中，pedR1和pedS1均存在于P. putida JM37基因组中，提示类似的调控机制。虽然Mückschel等人（2012）报道了P. putida JM37在EG存在下PedE、PedI、AldB和PedR1的过表达，但作者未测定PedH水平，且发现PedS1不受调控。然而，在相同条件下，这两个基因在P. putida KT2440中均上调。Wehrmann等人（2017）提出PedE和PedH具有冗余活性，其在P. putida KT2440中的调控取决于培养基中是否存在镧系元素。这提示P. putida JM37中存在不同的调控机制，有待进一步研究。Franden等人（2018）证明，被调节因子GclR抑制的Gcl途径（Li等人，2019）对P. putida KT2440从EG生成生物量至关重要。此外，作者还表明P. putida KT2440在代谢EG时会积累有毒中间体乙醇醛，并通过过表达glcDEF解决了这一问题，显著提高了P. putida KT2440在该底物上的生长。P. putida JM37含有一个gclR拷贝和gcl上游的GclR推定结合位点，与KT2440中的情况一致（图S1）（Novichkov等人，2013）。因此，JM37能在EG上生长而KT2440不能，这一点令人费解。这种差异可能归因于JM37中存在一个KT2440中缺失的操纵子，该操纵子包含将乙醇酸转化为丙酮酸所需的基因，即gcl、hyi、glxR、ttuD、ttuE、glcDEF和glcB，以及乙醇酸通透酶（glcA）和苹果酸酶（maeB），后者可将苹果酸转化为丙酮酸。值得注意的是，第二个gcl拷贝的上游区域不包含GclR的推定结合位点，提示该操纵子不受GclR抑制（图S1）。在P. putida JM37中，glcDEF的两个拷贝均伴随glcC（对GclDEF和GlcB活性至关重要）和glcG（功能未知）（Pellicer等人，1996）。然而，在P. putida KT2440中，在镧存在下于甘油上生长时，glcG与glcDEF一同上调（Wehrmann等人，2020）。P. putida JM37中存在两个glcC拷贝可能增强GlcDEF活性。我们提出，P. putida JM37天然高效生长于EG的能力源于其遗传冗余。首先，两个glcCDEFG拷贝能使细菌克服乙醇醛积累瓶颈，增加乙醛酸产量。其次，不受抑制的Gcl途径，连同第二个glcB和maeB，可能促进从乙醛酸生成生物量。P. denitrificans中对应于β-羟基天冬氨酸循环的基因（bhcCBD）未在P. putida JM37中发现，排除了该EG代谢途径。
图3 P. putida JM37中与EG代谢相关基因的排列。与P. putida KT2440和P. umsongensis GO16的重合在图例中说明。GclR推定结合位点以红色标出。基因大小和距离针对P. putida JM37表示。蛋白质同源性见表S2。
【数据】基因簇数量：3个；基因簇组成：pedE-pedH-pedI-aldB、glcDEF、gcl-hyi-glxR-ttuD-ttuE；非簇基因：aceA、glcB；glcC拷贝数：2；bhcCBD基因：未检出
3.3 Gcl途径的破坏阻止P. putida JM37在EG上生长
在一项蛋白质组学研究中，Mückschel等人（2012）观察到P. putida JM37在EG存在下AceA、Gcl和GlcB的上调，提示该菌可能通过Gcl途径和乙醛酸支路代谢EG。为验证这一假设，我们通过CRISPR-Cas9碱基编辑构建了突变菌株P. putida JM37Δgcl1,2-glcB1,2-aceA（敲除gcl1、gcl2、glcB1、glcB2和aceA）和P. putida JM37Δgcl1（仅敲除gcl1）。在含10 mM EG的MC培养基中培养48小时后，野生型菌株正常生长，而突变菌株完全无法生长。这一结果表明，Gcl途径和乙醛酸支路对P. putida JM37在EG上的生长至关重要，也证实了遗传冗余是该菌株高效代谢EG的基础。
【数据】突变菌株：JM37Δgcl1,2-glcB1,2-aceA（敲除gcl1、gcl2、glcB1、glcB2、aceA）、JM37Δgcl1（敲除gcl1）；EG浓度：10 mM；培养时间：48h；结果：突变菌株完全无法生长
图4 P. putida JM37在50 mM EG作为唯一碳源、24小时培养中的mcl-PHA组成和积累。（A）mcl-PHA组成（总PHA/CDW为15.7 ± 1.6%，约60%为C10）（n = 3）（B）尼罗红染色显示mcl-PHA颗粒的积累（红色和相差通道叠加）。
【数据】EG浓度：50 mM；培养时间：24h；总PHA/CDW：15.7 ± 1.6%；C10占比：约60%；生物学重复：n = 3
图5 P. putida Vi菌株在含200 mM EG和0.3 g/L NH₄Cl的MC培养基中，分别添加不同浓度酵母提取物、酪蛋白氨基酸或胰蛋白胨时粗紫色杆菌素的产量。培养（n = 3）在24孔板中进行24小时。误差线代表标准误。
【数据】EG浓度：200 mM；NH₄Cl：0.3 g/L；培养板：24孔板；培养时间：24h；生物学重复：n = 3
图6 重组P. putida JM37菌株上清液对pNPB的活性（U/mL）。WT：野生型菌株；C-：未诱导培养物。n = 2，误差线代表标准误。
【数据】生物学重复：n = 2
图7 （无图注）
讨论与解读
本研究提出P. putida JM37作为EG升级循环的微生物平台。基因组研究结合CRISPR-Cas9驱动的敲除揭示了乙醛酸代谢中的遗传冗余，这解释了其在EG上的稳健生长。除生物量形成外，JM37还能高效地将EG导向中链聚羟基脂肪酸酯，揭示了其在可持续生物塑料生产方面的潜力。研究进一步将P. putida JM37确立为合成生物学底盘，验证了其表达复杂异源途径的能力，包括直接从EG生产粗紫色杆菌素以及分泌具有活性的PET水解酶。这些发现共同凸显了P. putida JM37作为将高效EG代谢与生物技术多功能性相结合的细菌底盘的价值。其天然的代谢能力与可操作的遗传工具相结合，使JM37成为未来PET废弃物升级循环和增值化合物可持续生物合成的有前景的候选菌株。
编译者解读：本研究的关键价值在于发现了一个无需适应性实验室进化即可天然高效代谢EG的野生型假单胞菌菌株，并解析了其背后的遗传冗余机制——两个glcCDEFG拷贝和不受GclR抑制的第二个gcl操纵子。从合成生物学应用角度看，JM37兼具天然底物利用能力和异源表达可塑性，尤其值得关注的是其直接从EG合成mcl-PHA（总PHA/CDW达15.7%）和分泌活性PET水解酶的能力，这为构建"PET解聚-单体升级"一体化生物工艺提供了理想的底盘选择。局限在于目前对JM37中PedE/PedH的调控机制尚未完全阐明，且异源表达的产量仍有优化空间。
参考来源
Molpeceres-García FJ. Pseudomonas putida JM37 as a novel bacterial chassis for ethylene glycol upcycling. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133884
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133884